專利名稱：海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶f的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種可用于膠原的提取和制革中的低PH值軟化的海藻酸鈉負載蛋白 水解復合酶F，屬于新材料技術領域。本發明還涉及該負載蛋白水解復合酶F在膠原的提取 和制革中的低PH值軟化中的應用，適合于以所有動物皮為原料的膠原的提取和制革中的 酶軟化操作過程。
背景技術：
現階段應用于膠原提取的方法主要有酸法、堿法、酶法以及它們的結合法(肖 世維，但年華，曾睿，等.從動物皮中提取膠原蛋白的方法[J].西部皮革，2009,31(15) 17-21)。且經過前人的對比研究發現，酶法具有作用條件溫和、底物水解快、無污染、產物質 量高等優點，是比較理想的膠原提取方法(王川，李燕，馬志英，等.幾種酶法從豬皮中提取 膠原蛋白的對比研究[J].食品科學，2007，觀(1) =201-204) 0雖然用酶法提取膠原具有眾 多優勢，但酶法提取膠原大多使用胃蛋白酶，木瓜蛋白酶及胰酶等單一酶制劑，或者是在不 同階段加入同種或不同種酶制劑，有關使用復合酶提取膠原方面的研究未見報道，且缺乏 專用酶制劑。再者，在現有條件下，用酶提取膠原，存在酶不耐儲存、活力喪失太快、作用不 持久、在底物中分散不均勻、與產物難分離、很難實現對酶的回收等問題(趙江，劉鵬，宋慶 明，等.胰酶固定化條件的優化與應用[J].中國釀造，2008，(1) :22-25)。而要解決以上問 題，目前所采用的主要辦法之一就是對酶進行固定化處理。制革過程中的酶軟化是一個既重要又充滿質量風險的操作，其不僅對成革的豐滿 性、柔軟性、彈性、粒面光滑性和手感等方面十分重要，而且是制革生產過程中唯一不能被 化學過程代替的操作。另外，在實際生產中，皮坯的差異、原料皮存在的部位差、酶的催化活 性過高等問題均可能導致酶軟化過度等危險的發生。對此，近年來，國內外均有人認為軟化 時采取多種酶的結合使用，效果更好。再者，為了減緩酶的催化活性，利用微球化緩釋技術 也有利于提高酶的使用性能，從而大大提高對制革軟化操作過程的可控性。固定化酶是在一定空間內呈閉鎖狀態存在的酶，能連續的進行反應，反應后的酶 可以回收重復使用。與普通酶相比，固定化處理有利于提高酶的存儲穩定性，能夠在存儲較 長時間后仍保存有較高的活力，可以使酶在底物中充分分散開來，增大酶與底物的接觸面 積，提高產物的質量，從而提高酶的使用效率。同時酶易于與底物和產物分開，有望達到回 收利用，使成本降低等目的。海藻酸鈉又稱海藻膠、褐藻酸鈉或海帶膠，是從褐藻或細菌中提取出的天然多糖， 是由3-(l，4)-D甘露糖醛酸(M)和α (1，4)_L古洛糖醛酸(G)組成的線性高聚物。海 藻酸鈉分子鏈的G塊很容易與二價金屬粒子(如Ca2+，Ba2+等)作用，然后折疊堆積，使得 相鄰的海藻酸鈉分子鏈從自然伸展的卷曲狀態向整齊有序的帶狀結構轉變，最終導致了 海藻酸鈉三維網狀凝膠結構的形成，即形成“蛋盒”模型。通過這種作用將酶固定在凝膠 網絡中，可以改善酶的耐高溫、抗酸堿能力等一系列性能(Sugawara S，Imai T，Otagiri M. The controlled release ofprednisolone using alginate gel [J]. Pharmaceuticalresearch,1994，11 :272-277)。目前，已有利用海藻酸鈉固定化酶方面的研究，如龔彥銘等(龔彥銘，曾睿，但衛 華，等·海藻酸鈣負載胰酶微球的研究[J].中國皮革，2009，38 (15) 16-18)介紹的一種海 藻酸鈣負載胰酶微球的制備及其性能研究。然而，從現有技術看來，多數情況下制備得到的 微膠囊，酶負載率低，酶活力回收率低，且多因制備得到的微膠囊粒徑較大而減少了酶與底 物的接觸面積、使酶在底物中難分散均勻以致降低了酶的使用效果。另外，在現有條件下， 固定化酶技術多集中在對單一酶制劑的處理，有關對復合酶進行固定化處理的研究未見報 道，且有關固定化復合酶用于水解提取膠原蛋白和制革軟化的研究更未見報道。
發明內容
本發明的特點是針對已有技術存在的不足而提供的一種海藻酸鈉負載蛋白水解 復合酶F。其特點是以價廉易得的海藻酸鈉天然材料為載體，制備得到的一種粒徑小、載酶 量高、酶活力損失小且負載有復合酶F的微球。一種海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F，具有以下特征(1)外觀白色、微黃色或黃色粉末狀微球顆粒；(2)粒徑粒徑范圍為0. 1 1. 0 μ m ；(3)酶活力140 280U/g ；(4)存儲半衰期在4°C保存條件下，海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F的存儲半衰 期為180 220d ；(5)操作半衰期取一定量的海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F裝入反應柱(1. 5cmX2. 0cm)中，以pH 值為2. 0的磷酸鹽緩沖液配制的2. 0%的酪蛋白溶液為底物，水浴37°C恒溫，以流速60 100ml/h，連續運轉，每隔Id測定流出液中酪蛋白水解率。在此條件下，海藻酸鈉負載蛋白 水解復合酶F的操作半衰期為8 12d ；(6)熱穩定性在30 60°C的溫度范圍內，海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F的酶 活力應無顯著降低；(7)酸堿穩定性在pH值為2 7的范圍內，海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F的 酶活力應無顯著降低；(8)在有機溶劑中的穩定性將一定量的海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F浸泡在含有乙酸乙烯酯的反應瓶內， 于溫度為40°C、轉速為150r/min的搖床內反應，考察不同浸泡時間對酶活力的影響；60min 后酶活力應無顯著降低，仍為初始酶活力的90%以上；一種海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F，主要按照以下方法制備得到(1)準確稱取一定量的海藻酸鈉溶于水中，配制成4. 0 7. 2% (wt/v)的海藻酸 鈉溶液，然后在0°c的冰浴條件下，將復合酶F加入到海藻酸鈉溶液中，充分攪拌均勻后靜 置除去氣泡，使得復合酶F的最終濃度為2. 8 5. 0% (wt/v)；(2)將制備好的海藻酸鈉復合酶F溶液與濃度為1. 2 4. 5% (ν/ν)的交聯劑溶 液等體積混合，于0°c的冰浴條件下，低速攪拌反應150 210min，然后與含有3. 0 5. 6% (ν/ν)乳化劑的油相混合，同樣于0°C的冰浴條件下，調節攪拌速度至850 1450r/min，攪拌反應30 90min，得到乳化完全的海藻酸鈉復合酶F的乳液體系，其中油相與海藻酸鈉復 合酶F溶液的體積比為1. 0 5. 0 1 ；(3)使用滴定裝置將乳化完全的海藻酸鈉復合酶F乳液滴入事先已超聲溶解均 勻的濃度為2. 2 5. 6% (wt/v)的固化液中，同時調節攪拌速度至1000 1600r/min，攪 拌反應90 150min，使海藻酸鈉凝固成微球，最后再加入2. 5% (ν/ν)的破乳劑溶液，混 合攪拌均勻，靜置沉淀，分層后取下層液體，于5000rpm下離心lOmin，收集固體，再依次用 2.5% (ν/ν)的破乳劑溶液和蒸餾水反復洗滌所收集的固體各3次，同樣于5000rpm下離心 lOmin，收集固體并真空冷凍干燥Mh，所得到的微球即為海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F， 其中固化液與海藻酸鈉復合酶F乳液的體積比為1.0 5. O 1。需要說明的是其中所述的交聯劑選自醛類、碳化二亞胺中的任何一種；乳化劑選自丙二醇單硬 脂酸酯、SpanSO, Span60、0P-7中的任何一種；油相選自蓖麻油、液體石蠟、大豆油、花生油 中的任何一種；滴定裝置選自孔徑為0. 1 0. 5mm的注射器、噴霧器中的任何一種；固化液 選自 CaCl2、MgCl2、BaCl2 中的任何一種；破乳劑選自 Tween60、Tween80、Tween40、0P-10 中 的任何一種。海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F的用途，可作為穩定的酶制劑用于膠原的提取和 制革中的低PH值軟化。本發明具有以下優點1.由于本發明提供的是海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F，復合酶F是混合酶，可作 用的位點更多。因而對皮膠原的作用機制更加完善，提取得到的膠原產物質量更好、安全性 能更高，將其用于制革的軟化效果也更好。2.本發明提供的海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F的外觀為球形，具有粒徑小、酶 與底物的接觸面積大、易在底物中均勻分散、載酶量高、酶活力損失小等特點。同時，復合酶 F經微球化處理后具有很好的機械穩定性，能最大程度地保存酶的活力，提高其在有機溶劑 中的穩定性及對溫度和酸堿度的耐受性，可較長時間保存，便于酶的存儲與運輸。另外，該 負載蛋白水解復合酶F的操作半衰期長，可反復多次使用，用于膠原提取和制革軟化的生 產條件溫和，將其用于提取膠原能夠得到預期分子量及其分布的膠原蛋白產品，且用于制 革軟化能夠得到預期的軟化效果，提高了對皮膠原水解過程和制革軟化程度的可控性，為 高效提取質量優、安全性能高的膠原蛋白，獲得軟化效果好的皮革制品奠定了基礎。因此， 該負載蛋白水解復合酶F，可作為一種穩定的酶制劑用于膠原的提取和制革中的低pH值軟 化。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，有必要要在此指出的是以下實施例只 用于對本發明作進一步說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術人員根 據本發明的內容對本發明作出一些非本質的改進和調整，仍屬于本發明的保護范圍。實施例1取0.4g海藻酸鈉溶于IOml水中配制4.0% (wt/v)的海藻酸鈉溶液，然后在0°C的 冰浴條件下，將0. 28g復合酶F加入到海藻酸鈉溶液中，充分攪拌均勻后靜置除去氣泡，使得復合酶F的最終濃度為2. 8% (wt/v)。將制備好的海藻酸鈉復合酶F溶液與濃度為1. 2% (ν/ν)的戊二醛溶液IOml混合，于0°C的冰浴條件下，以90r/min低速攪拌反應150min。然 后與含有3. 0% (v/v) SpanSO的蓖麻油20ml混合，同樣于0°C的冰浴條件下，調節攪拌速度 至850r/min，攪拌反應30min，得到乳化完全的乳液體系。然后使用針頭孔徑為0. 5mm的注 射器將乳化完全的海藻酸鈉復合酶F乳液滴入事先已超聲溶解均勻的濃度為2. 2% (wt/v) 的CaCl2溶液40ml中，調節攪拌速度至lOOOr/min，攪拌反應90min，使海藻酸鈉凝固成微 球。最后再加入2.5% (ν/ν)的TweenSO溶液，混合攪拌均勻，靜置沉淀，分層后取下層液 體，于5000rpm下離心lOmin，收集固體，再依次用2. 5% (ν/ν)的Tween80溶液和蒸餾水反 復洗滌所收集的固體各3次，同樣于5000rpm下離心lOmin，收集固體并真空冷凍干燥Mh， 所得到的微球即為海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F。經檢測，本實施例制備得到的海藻酸鈉 負載蛋白水解復合酶F在4°C條件下的存儲半衰期為180d。實施例2取1. Ig海藻酸鈉溶于20ml水中配制5. 5% (wt/v)的海藻酸鈉溶液，然后在0°C的 冰浴條件下，將0. Sg復合酶F加入到海藻酸鈉溶液中，充分攪拌均勻后靜置除去氣泡，使得 復合酶F的最終濃度為4.0% (wt/v)。將制備好的海藻酸鈉復合酶F溶液與濃度為3.0% (ν/ν)的戊二醛溶液20ml混合，于0°C的冰浴條件下，以120r/min低速攪拌反應180min。 然后與含有4. 2% (v/v) Span60的液體石蠟120ml混合，同樣于0°C的冰浴條件下，調節攪 拌速度至1150r/min，攪拌反應60min，得到乳化完全的乳液體系。然后使用孔徑為0. 3mm的 噴霧器將乳化完全的海藻酸鈉復合酶F乳液滴入事先已超聲溶解均勻的濃度為3. 8% (wt/ ν)的CaCl2溶液400ml中，并調節攪拌速度至1400r/min，攪拌反應120min，使海藻酸鈉凝 固成微球。最后再加入2. 5% (v/v)的TweeneO溶液，混合攪拌均勻，靜置沉淀，分層后取 下層液體，于5000rpm下離心lOmin，收集固體，再依次用2. 5% (v/v)的Tween60溶液和蒸 餾水反復洗滌所收集的固體各3次，同樣于5000rpm下離心lOmin，收集固體并真空冷凍干 燥Mh，所得到的微球即為海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F。經檢測，本實施例制備得到的 海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F在4°C條件下的存儲半衰期為220d。實施例3取2. 16g海藻酸鈉溶于30ml水中配制7. 2% (wt/v)的海藻酸鈉溶液，然后在0°C 的冰浴條件下，將1. 5g復合酶F加入到海藻酸鈉溶液中，充分攪拌均勻后靜置除去氣泡， 使得復合酶F的最終濃度為5.0% (wt/v)。將制備好的海藻酸鈉復合酶F溶液與濃度為 4. 5% (v/v)的碳化二亞胺溶液30ml混合，于0°C的冰浴條件下，以150r/min低速攪拌反 應210min。然后與含有5. 6% (v/v) Span80的液體石蠟300ml混合，同樣于0°C的冰浴條件 下，調節攪拌速度至1450r/min，攪拌反應90min，得到乳化完全的乳液體系。然后使用孔徑 為0. 5mm的噴霧器將乳化完全的海藻酸鈉復合酶F乳液滴入事先已超聲溶解均勻的濃度為 5.6% (wt/v)的CaCl2溶液IOOOml中，并調節攪拌速度至1600r/min，攪拌反應150min，使 海藻酸鈉凝固成微球。最后再加入2. 5% (v/v)的TweenSO溶液，混合攪拌均勻，靜置沉淀， 分層后取下層液體，于5000rpm下離心lOmin，收集固體，再依次用2. 5% (v/v)的Tween80 溶液和蒸餾水反復洗滌所收集的固體各3次，同樣于5000rpm下離心lOmin，收集固體并真 空冷凍干燥Mh，所得到的微球即為海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F。經檢測，本實施例制 備得到的海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F在4°C條件下的存儲半衰期為198d。
應用實施例1準確稱取凍干后的純化豬皮5重量份，剪碎。用100重量份的Tris-HCl (pH7. 5) 緩沖液室溫封口浸泡12h。到達預定時間后，將緩沖液倒掉，加入250重量份的蒸餾水，并用 醋酸調節PH值至2. 0。準確稱取按任一實施例制備得到的海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F 0. 1重量份加入到調節過PH值的皮片水溶液中，于12°C下攪拌反應Mh。將攪拌足夠時間 的粗制膠原蛋白溶液進行過濾，取過濾后的清液，再用NaOH溶液調pH值至7. 5左右(調pH 時要緩慢加入NaOH，避免部分過熱使膠原變性)。然后根據試樣體積加入(NH4)2SO4,并保證 其最終濃度為1. 5mol/L，此后室溫封口靜置12h，過濾，提取粗膠原。將粗膠原蛋白溶液裝 入透析袋中，依次用0. 04mol/L和0. 02mol/L的Na2PO4、蒸餾水在低溫下透析約2d，透析期 間需要勤換液。最后將試樣轉移于皿中冷凍干燥，凍干后得到海綿狀膠原蛋白固體。應用實施例2取按常規方法脫灰完全的動物皮100重量份，加入轉鼓。然后按常規浸酸法浸酸， 調節PH值至2. 8左右。且浸酸結束后不控水，調節溫度至左右，此后直接加入按任一 實施例制備得到的海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F 2. 0 2. 5重量份，轉動90min。軟化結 束時粒面光滑、潔白，用力擠壓能留下指痕印，皮身堅牢，無軟化過度的現象發生。應用實施例3取按常規方法鞣制后的藍濕革100重量份，加入轉鼓，調溫至32°C左右，加入150 重量份的相同溫度的水，加入草酸1. 5重量份，轉動60min，調節pH值至2. 5 3. 0，到達預 定時間后排液。再加入150重量份的相同溫度的水，內溫仍為32°C左右，加入按任一實施例 制備得到的海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F 2.5重量份，轉動120!^11。軟化結束時粒面平 細、粒紋清晰、皮革的彈性和柔軟度更好、基本消除了皮身的皺紋和死對折。注本發明所用的蛋白水解復合酶F由成都佰樂金生物科技有限公司生產，其余 的化學試劑均為市場購買。
權利要求
1.一種海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F，具有以下特征(1)外觀白色、微黃色或黃色粉末狀微球顆粒；(2)粒徑粒徑范圍為0.1 1. 0 μ m ；(3)酶活力140 ^0U/g;(4)存儲半衰期在4°C保存條件下，海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F的存儲半衰期為 180 220d ；(5)操作半衰期在37°C，pH值2.0條件下，海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F的操作半 衰期為8 12d ；(6)熱穩定性在30 60°C的溫度范圍內，海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F的酶活力 應無顯著降低；(7)酸堿穩定性在pH值為2 7的范圍內，海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F的酶活 力應無顯著降低；(8)在有機溶劑中的穩定性海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F在有機溶劑中浸泡60min 后，酶活力應無顯著降低，仍為初始酶活力的90%以上。
2.一種海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F的制備方法，其特征在于(1)準確稱取一定量的海藻酸鈉溶于水中，配制成4.0 7.2% (wt/v)的海藻酸鈉溶 液，然后在0°C的冰浴條件下，將復合酶F加入到海藻酸鈉溶液中，充分攪拌均勻后靜置除 去氣泡，使得復合酶F的最終濃度為2. 8 5. 0% (wt/v)；(2)將制備好的海藻酸鈉復合酶F溶液與濃度為1.2 4. 5% (ν/ν)的交聯劑溶液等 體積混合，于0°C的冰浴條件下，低速攪拌反應150 210min，然后與含有3. 0 5. 6% (ν/ ν)乳化劑的油相混合，同樣于0°C的冰浴條件下，調節攪拌速度至850 1450r/min，攪拌反 應30 90min，得到乳化完全的海藻酸鈉復合酶F的乳液體系，其中油相與海藻酸鈉復合酶 F溶液的體積比為1.0 5.0 1 ；(3)使用滴定裝置將乳化完全的海藻酸鈉復合酶F乳液滴入事先已超聲溶解均勻的濃 度為2. 2 5. 6% (wt/v)的固化液中，同時調節攪拌速度至1000 1600r/min，攪拌反應 90 150min，使海藻酸鈉凝固成微球，最后再加入2. 5% (ν/ν)的破乳劑溶液，混合攪拌均 勻，靜置沉淀，分層后取下層液體，于5000rpm下離心lOmin，收集固體，再依次用2. 5% (ν/ ν)的破乳劑溶液和蒸餾水反復洗滌所收集的固體各3次，同樣于5000rpm下離心lOmin，收 集固體并真空冷凍干燥Mh，所得到的微球即為海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F，其中固化 液與海藻酸鈉復合酶F乳液的體積比為1. O 5. O 1。
3.按照權利要求2所述制備的海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F，其特征在于所述的交 聯劑選自醛類、碳化二亞胺中的任何一種。
4.按照權利要求2所述制備的海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F，其特征在于所述的乳 化劑選自丙二醇單硬脂酸酯、Span80、Span60、OP-7中的任何一種。
5.按照權利要求2所述制備的海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F，其特征在于所述的油 相選自蓖麻油、液體石蠟、大豆油、花生油中的任何一種。
6.按照權利要求2所述制備的海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F，其特征在于所述的滴 定裝置選自孔徑為0. 1 0. 5mm的注射器、噴霧器中的任何一種。
7.按照權利要求2所述制備的海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F，其特征在于所述的固化液選自CaCl2、MgCl2、BaCl2中的任何一種。
8.按照權利要求2所述制備的海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F，其特征在于所述的破 乳劑選自 Tween60、Tween80、Tween40、0P-10 中的任何一種。
9.權利要求2所述制備的海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F，可用于膠原的提取和制革 中的低PH值軟化。
全文摘要
本發明提供的海藻酸鈉負載蛋白水解復合酶F屬于新材料技術領域。主要制備方法如下將海藻酸鈉溶于水中制成溶液，然后在冰浴條件下將復合酶F加入其中攪拌均勻，再向制備好的海藻酸鈉復合酶F溶液中加入交聯劑，之后與含有乳化劑的油相混合，攪拌得到乳液。將乳液滴入固化液中凝固成球后，依次用含有破乳劑的溶液和蒸餾水反復洗滌，離心，冷凍干燥。本發明提供的負載蛋白水解復合酶F粒徑小，載酶量高，酶活力損失小，半衰期長，且其熱穩定性、酸堿穩定性和在有機溶劑中的穩定性好。將其用于膠原提取和制革軟化的生產條件溫和，對皮膠原水解過程和制革軟化程度的可控性提高，避免了生產中產品質量的波動。
文檔編號C12N9/50GK102061292SQ20101054747
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月17日 優先權日2010年11月17日
發明者但衛華, 但年華, 劉蘭, 林海, 胡楊, 龔彥銘 申請人:四川大學