專利名稱：一種芽孢桿菌及其酯酶的提取方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種芽孢桿菌及其酯酶的提取方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
有機(jī)磷農(nóng)藥在保護(hù)農(nóng)作物免受病、蟲(chóng)害，提高糧食產(chǎn)量方面具有巨大作用，但其過(guò) 度使用經(jīng)常導(dǎo)致蔬菜和水果等農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)，直接危害人們的身體健康，因此有效 控制農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留是我國(guó)當(dāng)前解決食品安全問(wèn)題的主要任務(wù)之一。減少農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘 留危害的最有效的途徑之一是建立快速有效的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法。目前國(guó)內(nèi)大部分的農(nóng)貿(mào) 市場(chǎng)都在使用酶抑制法來(lái)檢測(cè)果蔬的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，該法涉及了酶試劑、底物和顯色劑， 其中的關(guān)鍵技術(shù)是對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥敏感的酯酶的提取和獲得。目前國(guó)內(nèi)現(xiàn)有 的用于規(guī)模生產(chǎn)的酯酶都是從動(dòng)物中提取的，主要還存在以下缺點(diǎn)和問(wèn)題(1)篩選酶源 工作量很大、成本較高；( 酶來(lái)源不穩(wěn)定，不同批次不同個(gè)體來(lái)源的酶的差異較大。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種成本低、靈敏度高以及酶來(lái)源 穩(wěn)定的芽孢桿菌酯酶的提取方法。該菌命名為芽孢桿菌(Bacillus brevis)GDXEase8，編號(hào)為。本發(fā)明芽孢桿菌(Bacillus brevis)⑶XEase8的分子分類地位的確定。該菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO 1所示。該菌株在平板上的菌落呈圓形、淺黃色、不透明、表面光滑、邊緣整齊。細(xì)胞呈桿 狀，直徑0. 8 μ m左右，長(zhǎng)度約2-3 μ m,革蘭氏染色為陽(yáng)性，芽孢呈橢圓形，近端生。對(duì)該菌株進(jìn)行的抗生素抗性、接觸酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株對(duì)萘啶酮酸和大觀霉素 有抗性，接觸酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。本發(fā)明還提供了芽孢桿菌酯酶的提取方法，包括以下步驟(1)斜面菌種將芽孢桿菌(Bacillus brevis)⑶XEase8接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上 培養(yǎng)；(2)擴(kuò)大種子液培養(yǎng)將斜面菌種接種到裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，37士3°C， 100-300rpm，搖床培養(yǎng)12-14小時(shí)；所述種子培養(yǎng)基為蛋白胨1%，酵母膏0. 5%, NaCl 0. 5%,pH7. 0 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將擴(kuò)大培養(yǎng)種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37士3°C培養(yǎng)M-26小 時(shí)；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖1 %，蛋白胨2%，K2HPO4O. 1 %，NaH2PO4 0. 1%,ρΗ7.0 ；(4)芽孢桿菌酯酶的提取將發(fā)酵菌液3000-5000rpm離心10-20min，收集菌體， 用0. 01-003mol/L pH7. 0磷酸緩沖液洗滌后再次用磷酸緩沖液懸浮，用超聲波破壁法提酶， 3000-5000rpm離心10_20min，所得上清即為芽孢桿菌酯酶。本發(fā)明還提供了該芽孢桿菌酯酶在農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果1.本發(fā)明以一株芽孢桿菌(Bacillus brevis)⑶XEase8為出發(fā)菌株進(jìn)行發(fā)酵后 提取酶液，該酶在菌種不發(fā)生變異的情況下其性質(zhì)完全相同，重復(fù)性好，克服了不同動(dòng)植物 個(gè)體來(lái)源的酯酶存在差異的問(wèn)題。2.本發(fā)明以芽孢桿菌(Bacillus brevis)⑶XEase8進(jìn)行發(fā)酵提取酶液，不需要 篩選酶源，也不需要純化，降低了酶提取的工作量和成本。3.本發(fā)明提供的芽孢桿菌酯酶在甲胺磷、敵敵畏濃度分別為0. 3ppm、0. 005ppm時(shí) 抑制率都高于50%，使檢測(cè)限度遠(yuǎn)低于相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，克服了目前產(chǎn)品對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的 敏感度不高，特別是對(duì)甲胺磷等的敏感度低的缺點(diǎn)。本發(fā)明芽孢桿菌(Bacillus brevis)GDXEase8已于2010年11月9日保藏于國(guó) 家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為No. CCTCC M 2010295。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明提供的芽孢桿菌(Bacillus brevis)⑶XEase8具有下述性質(zhì)1.形態(tài)特征菌株在平板上的菌落呈圓形、淺黃色、不透明、表面光滑、邊緣整齊。細(xì)胞呈桿狀， 直徑0. 8 μ m左右，長(zhǎng)度約2-3 μ m,革蘭氏染色為陽(yáng)性，芽孢呈橢圓形，近端生。2.生理生化鑒定對(duì)菌株進(jìn)行的抗生素抗性、接觸酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株對(duì)萘啶酮酸和大觀霉素有 抗性，接觸酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。3. 16SrDNA 序列該菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO 1所示。實(shí)施例2實(shí)施例1所述的芽孢桿菌酯酶的制備方法(1)斜面菌種將保藏的菌種接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上培養(yǎng)，0-4°C保存。(2)擴(kuò)大種子液培養(yǎng)將斜面菌種接種到裝有IOOml種子培養(yǎng)基(蛋白胨1%，酵 母膏 0.5%，NaCl 0. 5%, pH7. 0)的 250ml 三角瓶中，37°C，200rpm，搖床培養(yǎng) 12 小時(shí)。(3)發(fā)酵培養(yǎng)將IOOml擴(kuò)大培養(yǎng)種子液接種到IOL發(fā)酵罐中，于37°C培養(yǎng)M小 時(shí)(培養(yǎng)基配方葡萄糖 1%，蛋白胨 2%，K2HPO4O. 1 %, NaH2PO4O. 1%, pH7. 0) (4)酶液的提取將發(fā)酵菌液離心(4000rpm) 15min,收集菌體，用0. 02mol/ L磷酸緩沖液(pH7.0)洗滌后再次用磷酸緩沖液懸浮，用超聲波破壁法提酶，離心 (4000rpm) 15min，所得上清即為酯酶液。實(shí)施例3實(shí)施例2所述的芽孢桿菌酯酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感度檢測(cè)材料細(xì)菌酯酶、靛酚乙酸酯溶液和磷酸緩沖液儀器恒溫水浴鍋、分光光度計(jì)酯酶活力測(cè)定在試管中加入4. 7mL 0. 02mol/L, ρΗ7· 0磷酸緩沖液，200 μ L2%靛 酚乙酸酯，混勻，37°C水浴10分鐘，加入100 μ L芽孢桿菌酯酶，反應(yīng)5分鐘后加入5mL無(wú)水乙醇終止反應(yīng)(對(duì)照管在加無(wú)水乙醇后再加芽孢桿菌酯酶)，測(cè)0D605。抑制率計(jì)算(0D0-0D1)/ODOX 100% (0D0 不被抑制時(shí)的OD值；ODl 抑制后的OD
值)測(cè)定結(jié)果(1)芽孢桿菌酯酶對(duì)敵敵畏的敏感度敵敵畏濃度為0. 005ppm時(shí)，抑制率高于50 %，低于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[GB/T 5009. 199-2003蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測(cè)]。(2)芽孢桿菌酯酶對(duì)敵百蟲(chóng)的敏感度敵百蟲(chóng)濃度為0. Ippm時(shí)，抑制率高于50%，低于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[GB/T5009. 199-2003蔬
菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測(cè)]。(3)芽孢桿菌酯酶對(duì)甲胺磷的敏感度甲胺磷濃度為0. 5ppm時(shí)，抑制率高于50%，低于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[GB/T5009. 199-2003蔬
菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測(cè)]。(4)芽孢桿菌酯酶對(duì)樂(lè)果的敏感度樂(lè)果濃度為2ppm時(shí)，抑制率高于50%，低于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[GB/T 5009. 199-2003蔬菜 中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測(cè)]。(5)芽孢桿菌酯酶對(duì)乙酰甲胺磷的敏感度乙酰甲胺磷濃度為0. 6ppm時(shí)，抑制率高于50 %，低于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[GB/ T5009. 199-2003蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測(cè)]。
權(quán)利要求
1.一種芽孢桿菌(Bacillus brevis)⑶XEase8，其特征在于其保藏編號(hào)為CCTCC M 2010295。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillusbrevis)⑶XEase8，其特征在于所述芽 孢桿菌的16SrDNA序列如SEQ ID NO 1所示。
3.—種權(quán)利要求1或2的所述的芽孢桿菌酯酶的提取方法，其特征在于包括以下步驟(1)斜面菌種將芽孢桿菌(Bacillusbrevis)⑶XEaseS接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上培養(yǎng)；(2)擴(kuò)大種子液培養(yǎng)將斜面菌種接種到裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，37士 3°C， 100-300rpm，搖床培養(yǎng)12-14小時(shí)；所述種子培養(yǎng)基為蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 0. 5%,pH7.0 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將擴(kuò)大培養(yǎng)種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37士3°C培養(yǎng)M-26小時(shí)； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖1 %，蛋白胨2%，K2HPO4 0.1%，NaH2PO4 0. 1%,ρΗ7.0 ；(4)芽孢桿菌酯酶的提取將發(fā)酵菌液3000-5000rpm離心10-20min，收集菌體，用 0. 01-003mol/L pH7. 0磷酸緩沖液洗滌后再次用磷酸緩沖液懸浮，用超聲波破壁法提酶， 3000-5000rpm離心10_20min，所得上清即為芽孢桿菌酯酶。
4.如權(quán)利要求3所述的芽孢桿菌酯酶在農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種芽孢桿菌(Bacillus brevis)GDXEase8及其酯酶的提取方法和應(yīng)用，該菌已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期為2010年11月9號(hào)，保藏編號(hào)為CCTCC No:M2010295。本發(fā)明成本低、靈敏度高以及酶來(lái)源穩(wěn)定。
文檔編號(hào)C12R1/08GK102134559SQ201010546319
公開(kāi)日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月15日
發(fā)明者肖桂秋, 隆湘蕾 申請(qǐng)人:廣州吉家莊生物科技有限公司