專利名稱：一種快速檢測綿羊多胎FecB基因的方法
技術領域：
本發明涉及分子生物技術領域，尤其涉及一種Tetra-primer ARMS-PCR快速檢測 綿羊多胎FecB基因的方法。
背景技術：
單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)是最具有潛力的第三 代分子標記，在多態性研究、基因圖譜構建、表型性狀和疾病連鎖分析中具有重要作用。而 SNP檢測是當前國際上研究的熱點，已經開發出許多商品化和專門化的儀器。目前，用于檢 測SNP的方法有很多種，但各有優缺點，在具有快速和高通量的同時仍存在一些不足，主要 表現為樣品前處理要求高，試劑昂貴且多數必須依賴于儀器生產商，少量樣本檢測成本高 等不足，因此不利于在普通實驗室和生產中推廣應用。2001年前后，國外三個研究小組幾乎同時發現控制Booroola美利奴羊多胎 的主效基因即FecB基因，該基因是綿羊6號染色體上骨形態發生蛋白受體IB基因 (Bonemorphogenetic proteins receptor type IB,BMPR-IB)A^G 突變。通過序列測定和PCR-RFLP的方法可以實施對該基因的檢測，且已用于多胎綿羊早期 分子標記輔助選擇。我國較早在關于綿羊多胎FecB基因研究中也是采用了這些方法(王 根林等，2003 ；柳淑芳等，2003)。但該方法相對比較繁瑣且所用內切酶的價格較高。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種快速檢測綿羊FecB 基因的方法。一種快速檢測綿羊多胎FecB基因的方法，利用特異性上游引物F1、下游引物Rl和 參照上游引物F2、參照下游引物R2共同對待測綿羊基因組DNA擴增，然后對PCR擴增產物 進行電泳分析，確定序列擴增產物中條帶大小和數目；其中，上游引物Fl:5' —GCTGGTTCCGAGAGACGAAAATATAGCG—3'；下游引物Rl:5' —GTTTTCATGCCTCATCAACACCGGCT—3‘；參照上游引物F2 5 ‘ —TCAGATGGTGAAACAGATTGGAAA—3 ‘；參照下游引物R2 5 ‘ —AGAAAGAGAGGAAAGCTAGGAAACC—3 ‘。所述的快速檢測綿羊多胎FecB基因的方法，所述PCR擴增條件為PCR反應總體 積 20 μ L，其中基因組 DNA 50 lOOng，IOXbuffer 2 μ L ;MgCL21. 5mmol/L ;dNTP 濃度 ().2mmol/L ；DNA Taq 酶 1. OU ；特異引物 Fl 和 Rl 各 20pmol ；參照引物 F2 和 R2 各 5pmol ； 加雙蒸水至 20 μ L ；PCR 反應程序94°C預變性 5min ；94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s，循環 30 次；72°C 延伸 5min。。 所述的快速檢測綿羊多胎FecB基因的方法，所述電泳分析中，取PCR產物8 μ L經 10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色。 應用本方法對PCR-RFLP(即限制性酶切片段長度多態性)和測序方法已經測試的109份綿羊樣品DNA進行檢測，其結果表明，前兩種方法結果完全一致，即湖羊均為BB基因 型，美利奴羊均為++基因型，而美利奴羊和湖羊雜交Fl代均為B+基因型。因此，準確性很
尚ο本發明建立了一種簡便易行、耗時短、結果易于判讀、用以檢測綿羊FecB基因突 變的新方法，以提高測定FecB基因型的效率，使之易于在實踐中推廣和應用于大規模群體 的檢測。
圖1為四引物ARMS PCR法檢測綿羊FecB基因的電泳圖譜。
具體實施例方式以下結合附圖和具體實施例，對本發明進行詳細說明。1.1材料與試劑用于研究的湖羊樣品采自上海永輝種羊場(87只)，并以該場引進的德國美利奴 羊(6只)以及和湖羊雜交Fl代(16只)作為對照。每只羊在耳尖部用75%酒精棉球消毒 后用耳缺鉗取耳皮膚組織約5g，酚-氯仿法抽提基因組DNA，-20°C保存備用。Taq DNA聚 合酶和dNTP及PAGE凝膠電泳和染色等其它試劑均購自南京生興生物技術公司。特異性引物設計(a)下游引物BB 型基因組5 ‘ -TATC § GACGGTGTTGATGAGGCATGAAAACATCTTGGGCTTCATT—3 ‘
++ 型基因組5 ‘ -TATC @ GACGGTGTTGATGAGGCATGAAAACATCTTGGGCTTCATT—3 ‘引物序列 3' —T CGGCCACAACTACTCCGTACTTTTG—5'(b)上游引物BB 型基因組3 ‘ —TCTCCTCCGGTCGACCAAGGCTCTCTGTCTTTATATAG § CTGC-5 ‘++ 型基因組3 ‘ —TCTCCTCCGGTCGACCAAGGCTCTCTGTCTTTATATAG @ CTGC-5 ‘弓丨物序列 5 ‘ —GCTGGTTCCGAGAGACGAAAATATAGC G—3 ‘根據四引物ARMS PCR原理設計綿羊FecB(Genebank登陸號AF370007)突變點(框 內字母代表突變點)特異性引物，其序列如下上游引物Fl:5' —GCTGGTTCCGAGAGACGAAAATATAGCG—3'下游引物Rl:5' —GTTTTCATGCCTCATCAACACCGGCT—3‘下游引物3'末端堿基與++基因型匹配而與BB基因型不匹配，在PCR過程中BB 基因型個體就會因在3'末端堿基磷酸二酯鍵形成困難而不能延伸，反應終止而無特異性 擴增，電泳結果中就無此特異性條帶；上游引物3'末端堿基與BB基因型匹配而與++基因 型不匹配，在PCR產物中就無++基因型特異性條帶；對于雜合子(B+)來說，兩種基因型同 時存在，故擴增產物中同時具有BB基因型和++基因型的特有條帶。同時，根據該技術原理 在倒數第三個堿基引入錯配(劃線字母代表引入錯配堿基)，以提高檢測的特異性。1.3參照引物設計根據FecB基因序列在突變點兩側設計引物，用以在PCR擴增中作為陽性對照。序列如下上游引物F2 5 ‘ —TCAGATGGTGAAACAGATTGGAAA—3 ‘下游引物R2 5 ‘ —AGAAAGAGAGGAAAGCTAGGAAACC—3 ‘1. 4四引物ARMS PCR擴增體系優化四引物ARMS PCR用于SNP檢測的關鍵除了引物設計之外，主要是對反應體系的優 化。本發明中采用PCR-RFLP檢測后已知的綿羊個體基因組模板，在固定其它條件不變的情 況下對以下因素進行了逐一優化。1.4. 1退火溫度的優化退火溫度是影響PCR反應特異性的重要因素，本發明中固定其它PCR條件不變，對 退火溫度為64°C、62°C、60°C、58°C和56°C 5個溫度進行了優化。1. 4. 2Mg2+濃度、dNTP濃度和Taq酶的用量及循環數的優化在最適退火溫度下，20μ L反應體系中分別對Mg2+濃度(1.5、1.8、2.0、2. 5、 3.0mmol/L)、dNTP 濃度(0. 15、0· 20,0. 25,0. 3mmol/L)和 Taq 酶的用量(0. 5、1. 0、1. 5U)及 循環數(25、30、35)進行優化。1.4.3引物組合和引物濃度的優化在最適退火溫度、Mg2+濃度、dNTP濃度和Taq酶用量條件下，在20 μ L反應體系中 對引物各組合(見表1)進行靈敏度優化，在此基礎上進行內外引物濃度比(4 1、2 1、 1 1、1 2、1 4)優化。1. 5四引物ARMS PCR擴增和電泳PCR 反應總體積 20 μ L，其中基因組 DNA 50 lOOng，IOXbuffer 2 μ L ； MgCL21. 5mmol/L ；dNTP 濃度 0. 2mmol/L ；DNA Taq 酶 1. OU ；特異引物 Fl 和 Rl 各 20pmol ；參 照引物F2和R2各5pmol ；加雙蒸水至20 μ L0PCR 反應程序；94°C預變性 5min ；94°C 30s，62°C 30s, 72°C 30s，循環 30 次；72°C延 伸5min。取PCR產物8 μ L經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色。1. 6四引物ARMS PCR引物擴增結果判讀和意義根據特異性引物3'端阻斷類型，其不同配對引物擴增片段大小和意義見表1，電 泳圖譜中有220bp和120bp條帶的為BB基因型；有220bp和160bp條帶的為++基因型，而 有220bp、160bp和120bp三條帶的為B+基因型。表1各對引物擴增產物片段長度及意義
產物長度
I:游引物 下游引物陽性結果及意義陰性結果及意義
(bp) t
權利要求
一種快速檢測綿羊多胎FecB基因的方法，其特征在于，利用特異性上游引物F1、下游引物R1和參照上游引物F2、參照下游引物R2共同對待測綿羊基因組DNA擴增，然后對PCR擴增產物進行電泳分析，確定序列擴增產物中條帶大小和數目；其中，上游引物F15′ GCTGGTTCCGAGAGACGAAAATATAGCG 3′；下游引物R15′ GTTTTCATGCCTCATCAACACCGGCT 3′；參照上游引物F25′ TCAGATGGTGAAACAGATTGGAAA 3′；參照下游引物R25′ AGAAAGAGAGGAAAGCTAGGAAACC 3′。
2.根據權利要求1所述的快速檢測綿羊多胎FecB基因的方法，其特征在于，所述PCR 擴增條件為PCR反應總體積20 μ L，其中基因組DNA 50 lOOng，10Xbuffer2y L ；MgCL2 1. 5mmol/L ；dNTP 濃度 0. 2mmol/L ；DNA Taq 酶 1. OU ；特異引物 Fl 和 Rl 各 20pmol ；參照引物 F2 和 R2 各 5pmol ；加雙蒸水至 20 μ L ；PCR 反應程序:94°C預變性 5min ；94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s，循環 30 次；72°C延伸 5min。。
3.根據權利要求1所述的快速檢測綿羊多胎FecB基因的方法，其特征在于，所述電泳 分析中，取PCR產物8 μ L經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色。
全文摘要
本發明公開了一種快速檢測綿羊多胎FecB基因的方法。本發明所提供的利用四條單鏈擴增引物進行FecB基因分型的方法，是由特異性上游引物F1、下游引物R1和對照上游引物F2、下游引物R2共同對待測綿羊基因組DNA擴增，然后對PCR擴增產物進行電泳分析，確定序列擴增產物中條帶大小和數目。產物有三種情況包含220bp和120bp；220bp和160bp；220bp、160bp和120bp。本發明的研究結果表明Tetra-primer ARMS-PCR對綿羊FecB基因的檢測具有快速簡便，成本低廉等特點，對于研究和綿羊育種提供理論和實踐基礎，并給綿羊生產者帶來效益。
文檔編號C12Q1/68GK101979659SQ20101054499
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月16日 優先權日2010年11月16日
發明者萬鵬程, 劉守仁, 楊利國, 石國慶, 管峰, 艾君濤 申請人:新疆農墾科學院