專利名稱：檢測精神分裂關聯基因的試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及的是一種分子生物技術領域的試劑盒及其制備方法，具體地說是一種 檢測精神分裂關聯基因的試劑盒及其制備方法。
背景技術：
連接酶可以對與目標序列完全互補的兩條寡核苷酸片段進行連接，進而形成一條 較長的寡核苷酸探針，如果兩條寡核苷酸探針連接處的堿基與目標序列不完全互補，那么 連接反應就不會發生，也就不會產生較長的寡核苷酸探針。根據這一原理，根據SNP位點 的基因型設計不同長度的寡核苷酸探針，可以對SNP位點的基因型進行檢測。根據最終產 物的長度分類，可以確定SNP位點的基因型，這就是連接酶檢測反應(Ligase Detection Reaction)。人類基因組是遺傳信息的最終載體，人類個體之間的差異根本原因也在于基因組 序列的差異。單核苷酸多態性(SNP)正是表征這種差異的常用的遺傳標記，在人類基因組 上大概每一千個堿基對，就包含有一個SNP。雙生子實驗等證明，精神分裂是一種復雜的遺 傳疾病，遺傳度高達80%左右。現代遺傳學研究表明，各種遺傳疾病都會被某些SNP位點 所表征，也就是說，某些SNP位點與遺傳疾病呈現出關聯性。全基因組關聯研究的出現，更 為尋找關聯位點提供了有力的技術支持。這些強關聯SNP位點可以作為一種患病風險的表 征。現在對SNP位點的分型，常用的方法有AB公司的TaqMan探針技術，測序技術等。 TaqMan探針要從AB公司定制，周期較長而且價格較為昂貴。測序技術雖然結果較為可靠， 但是對特定位點的SNP分型，該方法相對成本較高，花費時間也比較長。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種檢測精神分裂關聯基因的試 劑盒及其制備方法，本發明操作簡便，成本低廉，針對精神分裂而開發。結果可靠，穩定性 好，靈敏度高。本發明是通過以下技術方案實現的本發明涉及檢測精神分裂關聯基因的試劑盒，包括PCR試劑組和LDR(連接酶檢 測反應)試劑組，兩個試劑組包裝在同一個盒子中，PCR試劑組，包括緩沖液、dNTP混合液、 Taq DNA聚合酶、純水和四對PCR專用擴增引物；LDR試劑組，包括緩沖液、dNTP混合液、 Taq DNA連接酶、純水和四組LDR專用探針。所述的PCR試劑組，緩沖液濃度為正常工作濃度的十倍，dNTP混合液的濃度為 IOmM, Taq DNA聚合酶的濃度為2unit/ul，四對PCR擴增引物為2 OD的干粉，使用時，先 SOOOrpm離心十分鐘，然后加入純水溶解，震蕩均勻后可以使用。所述的LDR試劑組，緩沖液濃度為正常工作濃度的十倍，Taq DNA聚合酶的濃度為 40unit/ul,四對PCR擴增引物為2 OD的干粉，使用時，先8000rpm離心十分鐘，然后加入純水溶解，混合均勻后可以使用。本發明還涉及如上述的檢測精神分裂關聯基因的試劑盒的制備方法，包括以下步 驟①PCR引物的設計及合成PCR引物采用引物設計軟件raiMER3進行引物設計，TM 值選擇60度左右。②LDR探針的設計及合成LDR探針每個位點包括三條，兩條5’端探針和一條3’
端探針。a.兩條5’端探針長度相差2個堿基，該差別反映在該探針的5’端b.兩條5’端探針的3’端的最后一個堿基根據SNP位點的基因型確定c.兩條5’端探針在距3’端6個堿基的位置認為引入與目標序列不互補的一個堿 基，目的是增大檢測的準確度d. 5’端探針的5’末端及3’端探針的3’末端均采用polyT的序列，目的是使產物 達到利于檢測的長度。e.除上述三點描述外，5’端探針的其他位置與目標序列完全互補f. 3’端探針與目標序列完全互補，且在其5’端加磷酸修飾，其3’端加FAM熒光修 飾③Taq DNA聚合酶和Taq DNA連接酶選用市售TAKARA的產品或New England Biolabs的產品(配套試劑(如緩沖液，dNTP等)均選用市售常用試劑之)。所述的PCR引物的設計及合成中每個位點對應的引物的序列如下
權利要求
一種檢測精神分裂關聯基因的試劑盒，其特征在于，包括PCR試劑組和LDR試劑組，其中PCR試劑組包括緩沖液，dNTP混合液，Taq DNA聚合酶，純水，四對PCR專用擴增引物；LDR試劑組包括緩沖液，dNTP混合液，Taq DNA連接酶，純水，四組LDR專用探針。
2.根據權利要求1所述的檢測精神分裂關聯基因的試劑盒，其特征是，所述的PCR試劑 組，dNTP混合液的濃度為10mM，Taq DNA聚合酶的濃度為2unit/ul，四對PCR擴增引物為2 OD的干粉，使用時，先SOOOrpm離心十分鐘，然后加入純水溶解，震蕩均勻后可以使用。
3.根據權利要求書1中所述的檢測精神分裂關聯基因的試劑盒，其特征是，所述的LDR 試劑組，Taq DNA聚合酶的濃度為40unit/ul，四對PCR擴增引物為2 OD的干粉，使用時，先 SOOOrpm離心十分鐘，然后加入純水溶解，混合均勻后可以使用。
4.一種根據權利要求1所述的檢測精神分裂關聯基因的試劑盒的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟①PCR引物的設計及合成PCR引物采用引物設計軟件raiMER3進行引物設計，TM值選 擇60度左右；②LDR探針的設計及合成LDR探針每個位點包括三條，兩條5’端探針和一條3’端探針；③TaqDNA聚合酶和Taq DNA連接酶采用TAKARA的產品或New England Biolabs的Φ 口廣 BFI ο
5.根據權利要求4所述的檢測精神分裂關聯基因的試劑盒的制備方法，其特征是，所 述的LDR探針兩條5’端探針長度相差2個堿基，反映在該探針的5’端。
6.根據權利要求4所述的檢測精神分裂關聯基因的試劑盒的制備方法，其特征是，所 述的LDR探針兩條5’端探針的3’端的最后一個堿基根據SNP位點的基因型確定。
7.根據權利要求4所述的檢測精神分裂關聯基因的試劑盒的制備方法，其特征是，所 述的LDR探針兩條5’端探針在距3’端6個堿基的位置認為引入與目標序列不互補的一 個堿基，目的是增大檢測的準確度。
8.根據權利要求4所述的檢測精神分裂關聯基因的試劑盒的制備方法，其特征是，所 述的LDR探針5’端探針的5’末端及3’端探針的3’末端均采用polyT的序列，目的是使 產物達到利于檢測的長度。
9.根據權利要求4所述的檢測精神分裂關聯基因的試劑盒的制備方法，其特征是，所 述的LDR探針除上述三點描述外，5’端探針的其他位置與目標序列完全互補。
10.根據權利要求4所述的檢測精神分裂關聯基因的試劑盒的制備方法，其特征是，所 述的LDR探針3’端探針與目標序列完全互補，且在其5’端加磷酸修飾，其3’端加FAM熒 光修飾。
全文摘要
一種分子生物技術領域的檢測精神分裂關聯基因的試劑盒及其制備方法。試劑盒PCR試劑組和LDR試劑組，其中PCR試劑組包括緩沖液，dNTP混合液，Taq DNA聚合酶，純水，四對PCR專用擴增引物；LDR試劑組包括緩沖液，dNTP混合液，Taq DNA連接酶，純水，四組LDR專用探針。制備方法包括PCR引物的設計及合成PCR引物采用引物設計軟件PRIMER3進行引物設計，TM值選擇60度左右；LDR探針的設計及合成LDR探針每個位點包括三條，兩條5’端探針和一條3’端探針；Taq DNA聚合酶和Taq DNA連接酶采用TAKARA的產品或New England Biolabs的產品。本發明可以實現對精神分裂關聯基因內特定SNP位點的快速、高效、準確的分型。
文檔編號C12Q1/68GK101985659SQ20101054312
公開日2011年3月16日 申請日期2010年11月13日 優先權日2010年11月13日
發明者馮國鄞, 師詠勇, 李志強, 李濤, 賀林 申請人:上海交通大學