專利名稱：野生茄子耐鹽基因StBADH抗除草劑植物表達載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及了一個野生茄子耐鹽基因StBADH 抗除草劑植物表達載體。
背景技術(shù)：
近年來，由于受全球氣候變暖、工業(yè)污染加劇和農(nóng)民不合理耕作方式等因素影響， 我國土壤鹽漬化的程度有逐年加重的趨勢。由土壤鹽漬化而導(dǎo)致的鹽脅迫是抑制植物生 長、降低農(nóng)作物產(chǎn)量和影響農(nóng)作物品質(zhì)的主要環(huán)境因素，嚴重制約著我國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展。 研究植物耐鹽分子機理和培育耐鹽新品種，對開發(fā)利用鹽堿地具有重要意義。利用轉(zhuǎn)基因 技術(shù)將耐鹽相關(guān)基因克隆并轉(zhuǎn)化農(nóng)作物，使其在農(nóng)作物中過量表達，將會大幅提高農(nóng)作物 的耐鹽能力，也是解決我國土壤鹽漬化問題的有效途徑之一。在鹽等滲透脅迫條件下，許多植物如甜菜、菠菜，都積累甜菜堿(Betaine)。甜 菜堿被認為是植物抗?jié)B透脅迫最有效的滲透調(diào)節(jié)劑(參考文獻Tarczynski MC, Jensen RG. Stress protection of transgenic tobacco by production of the osmolyte mannitol. Science. 1993,259 =508-510)。作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，甜菜堿在植物體內(nèi)由膽 堿經(jīng)兩步不可逆的氧化合成，催化這兩步反應(yīng)的酶分別是膽堿單氧化物酶(Choline Monooxyge-nase, CM0)禾口甜菜堿酸脫S酶(Betaine Aldehyde Dehydrogenase, BADH)； 其中BADH是合成甜菜堿的關(guān)鍵酶，催化甜菜堿醛氧化為甜菜堿(參考文獻Rhodes D， Hanson AD. Quarternary ammonium and tertiary sulfonium compounds in higher plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1993,44 357-384)。由于植物體內(nèi)甜菜堿的合成途徑相對簡單，進行遺傳操作方便，在諸多耐鹽基 因中甜菜堿合成酶基因被看作是最有應(yīng)用價值的耐鹽基因之一(參考文獻Nakamura T， Nomura Μ, Mori H, Jagendorf AT, Ueda A, Takabe Τ. An isozyme of betaine aldehyde dehydrogenase in barley. Plant Cell Physiology. 2001,42(10) : 1088-1092)。植物中導(dǎo) 入耐鹽基因BADH，其耐鹽性得到明顯提高已有諸多報道Jia等(2002)構(gòu)建了含山菠菜甜 菜堿醛脫氫酶BADH基因的重組雙元植物表達載體pBin438，由農(nóng)桿菌介導(dǎo)對番茄進行遺傳 轉(zhuǎn)化，120mmol · L^1NaCl培養(yǎng)條件下，獲得轉(zhuǎn)基因番茄中的甜菜堿脫氫酶活性和BADH mRNA 積累量顯著高于野生型品種，轉(zhuǎn)基因番茄對于高濃度鹽脅迫表現(xiàn)出較強的耐受性(參考文 獻:Jia GX, Zhu ZQ, Chang FQ, Li YX. Transformation of tomato with the BADH gene from Atriplex improves salt tolerance. Plant Cell Reports. 2002, 21 :141-146)。Guo 等(2000)以雙元植物表達載體pABH9 (含BADH基因)為供體DNA，由農(nóng)桿菌介導(dǎo)對小麥進 行遺傳轉(zhuǎn)化，鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株葉片的BADH活性比受體親本提高1-3倍，植株相對 電導(dǎo)率比親本明顯低，表明轉(zhuǎn)基因植株的細胞膜在脅迫時受傷害程度較輕(參考文獻Guo BH,Zhang YM,Li HJ,Du LQ,Li YX，Zhang JS,Chen SY,Zhu ZQ. Transformation of wheat with a gene encoding for the betaine aldehyde dehydrogenase (BADH). Acta Botanica Sinica. 2000,42(3) :279_283)。
StBADH 基因是從野生茄子(Solanum torvum Swartz) iTorvum Vigor，中克隆出 來的一種新的耐鹽基因，目前尚無該基因抗除草劑植物表達載體的相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為解決提高農(nóng)作物耐鹽性和抗除草劑特性的問題，提供一種新的野 生茄子耐鹽基因StBADH抗除草劑植物表達載體及其構(gòu)建方法。所構(gòu)建的野生茄子耐鹽基 因StBADH抗除草劑植物表達載體可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鹽敏感農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制 耐鹽和抗除草劑新種質(zhì)，提高鹽敏感農(nóng)作物的耐鹽性和抗除草劑特性，可用于農(nóng)作物品種 改良。本發(fā)明的技術(shù)問題可通過如下技術(shù)方案解決野生茄子耐鹽基因StBADH，該基因的序列為SEQ ID NO. 1。野生茄子耐鹽基因StBADH抗除草劑植物表達載體，由本發(fā)明所述的野生茄子耐 鹽基因StBADH與抗除草劑植物表達載體構(gòu)成。其中，所述的植物表達載體優(yōu)選中間載體PCAMBIA3301-T800，該載體是通過分別 用EcoR I/Hind III雙酶切全序列合成的pT800DNA片段和植物表達載體pCAMBIA3301，回 收PT800中843bp的片段與pCAMBIA3301中11273bp的大片段，連接所述兩個片段得到的。野生茄子耐鹽基因StBADH抗除草劑植物表達載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟1) 野生茄子耐鹽基因StBADH的克隆選用野生茄子作為試驗材料，取幼嫩葉片，提取總RNA，取其2μ g反轉(zhuǎn)錄cDNA，用 RNase消化cDNA產(chǎn)物，根據(jù)NCBI上公布的番茄(Solanum lycopersicum) amadh2序列信息 設(shè)計特異引物，進行高保真聚合酶鏈式PCR反應(yīng)，在合成的野生茄子葉片cDNA中擴增含Sma I和Xba I兩個酶切位點的StBADH，PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收純化；2) StBADH加多聚腺苷酸‘PolyA’尾反應(yīng)按照DNA Α-Tailing試劑盒說明，以步驟1)得到的PCR純化產(chǎn)物為反應(yīng)底物， 在StBADH基因3’端加上多聚腺苷酸‘PolyA’尾；StBADH加‘PolyA，尾反應(yīng)的產(chǎn)物連入 PMD19-T載體中，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細胞，測序驗證，得到pMD_StBADH ；3)中間載體 pCAMBIA3301-T800 的構(gòu)建全序列合成含有CaMV35S啟動子、pUC18Polylinker多克隆位點、Nos終止子的 PT800DNA片段(見SEQ ID N0. 2)，其中，CaMV35S啟動子的上游和Nos終止子的下游分別引 入了 EcoRI和HindIII酶切位點；所述的pT800 DNA片段與植物表達載體pCAMBIA3301 (含 bar 基因)分別 EcoRI (Promega) /Hind III (Promega)雙酶切，回收 pT800 中 843bp 的片段 與pCAMBIA3301中11273bp的大片段(含bar基因)，用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 T0P10感受態(tài)細胞，質(zhì)粒用AxyPr印質(zhì)粒DNA小量試劑盒提取純化，EcoR I (Promega) /Hind III (Promega)雙酶切驗證，得到構(gòu)建成功的中間載體pCAMBIA3301_T800 (含bar基因)；4) StBADH抗除草劑植物表達載體pCAMBIA3301-StBADH_T800的構(gòu)建含Sma I和Xba I兩個酶切位點的pMD-StBADH與中間載體pCAMBIA3301_T800 (含 bar 基因)分別 Sma I (Promega) /Xba I (Promega)雙酶切，回收 pMD-StBADH 中 1522bp 的小片段與PCAMBIA3301-T800中12107bp的大片段(含bar基因)，用T4DNA連接酶 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細胞，質(zhì)粒用AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒提取純化，
4Sma I (Promega)/Xba I (Promega)雙酶切驗證，得到構(gòu)建成功的抗除草劑植物表達載體 pCAMBIA3301-StBADH-T800 (含 bar 基因)。有益效果1.本發(fā)明將野生茄子耐鹽基因StBADH克隆至含有抗除草劑基因(bar基因)的中 間載體pCAMBIA3301-T800中，StBADH基因在CaMV35S啟動子的啟動下超量表達，大量合成 甜菜堿生物合成關(guān)鍵酶，植物體內(nèi)積累甜菜堿，顯著提高植物耐鹽性。同時，bar基因的表 達產(chǎn)物膦絲菌素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，能使植物抵抗以L-Phosphinothricin(膦絲菌素，PPT)為 活性成分的除草劑。2.本發(fā)明構(gòu)建的野生茄子耐鹽基因StBADH抗除草劑植物表達載體為野生茄子中 首次報道，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鹽敏感農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化，提高鹽敏感農(nóng)作物的耐鹽性 和抗除草劑特性，創(chuàng)制耐鹽和抗除草劑新種質(zhì)，可進行農(nóng)作物品種改良。
圖1中間載體pCAMBIA3301-T800質(zhì)粒EcoR Ι/HindIII雙酶切檢測瓊脂糖凝膠電 泳分析；1:DL2000DNAMarker(TaKaRa)(2Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 25Kb/0. 1Kb)，2 :pCAMBIA3301-T800/EcoR I/HindIII,3 :pCAMBIA3301-T800 質(zhì)粒。圖2質(zhì)粒pMD-StBADH及其pCAMBIA3301-T800 Sma I/Xba I雙酶切檢測瓊脂糖凝 膠電泳分析；1:DL2000DNAMarker(TaKaRa)(2Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 25Kb/0. 1Kb)，2 :pMD-StBADH/Sma I/Xba I，3 :pMD-StBADH/Sma I/Xba I，4:pMD-StBADH/Sma I/Xba I，5 :pMD-StBADH/Sma I/Xba I，6 :pMD-StBADH 質(zhì)粒，7 =IKbp DNAMarker(TaKaRa)(10Kb/9Kb/8Kb/7Kb/6Kb/5Kb/4Kb/3Kb/2Kb/lKb)，8 :pCAMBIA3301-T800/Sma I/Xba I，9 :pCAMBIA3301-T800/Sma I/Xba I，10 :pCAMBIA3301-T800 質(zhì)粒。圖3抗除草劑植物表達載體pCAMBIA3301-StBADH-T800質(zhì)粒圖譜。
具體實施例方式實施例1.野生茄子耐鹽基因StBADH抗除草劑植物表達載體的構(gòu)建1)野生茄子耐鹽基因StBADH的克隆選用野生茄子(Solanum torvum Swartz) iTorvum Vigor，(為日本砧木品種，購自 日本Takii種苗株式會社)作為試驗材料，幼苗長至4-5片真葉時，進行IOOmmol · L^1NaCl 脅迫處理，連續(xù)處理5天，取幼嫩葉片，按照Total RNA提取試劑盒(TaKaRa)說明提取總 RNA，按照東洋紡(上海)生物技術(shù)有限公司cDNA合成試劑盒ReverTra Ace-a- 說明取2 μ g總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RNase (TaKaRa)消化cDNA產(chǎn)物。根據(jù)NCBI上公布的番茄 amadh2的序列信息(GenBank登錄號:FJ228482. 1)，經(jīng)Primer PREMIER 5軟件(加拿大 Premier公司)分析設(shè)計特異引物，上游引物Ml序列為SEQ ID NO. 3，下游引物M2序列為 SEQ ID NO. 4，進行高保真PCR反應(yīng)，在野生茄子葉片cDNA中擴增含Sma I和Xba I兩個酶 切位點的StBADH。高保真PCR 擴增體系cDNA 模板 1. 0 μ L(60ng)，5XPrime STAR Buffer 4· 0μ L(Mg2+plus，5XMg2+濃度為 5mmol · L-1)，dNTP Mixture 1· 6μ L(各 2. 5mmol · L-1)， Ml (SEQ ID NO. 3) 1. 0 μ L (10 μ mol ‘ L-1), Μ2 (SEQ ID Ν0· 4) 1· 0 μ L (10 μ mol · L-1)，Prime STAR HS EnzymeO. 4 μ L，ddH20 11 μ L ；高保真PCR擴增程序95°C預(yù)變性5min，98°C變性10s，55. 0°C退火15s，72°C延伸 Imin 40s，30個循環(huán)后，72°C總延伸5min ；PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收純化；2) StBADH加多聚腺苷酸‘PolyA’尾反應(yīng)按照DNA A-Tai 1 ing試劑盒(TaKaRa)說明，以步驟1)回收純化得到的PCR產(chǎn)物 為反應(yīng)底物，在StBADH基因3’端加上多聚腺苷酸‘PolyA’尾；反應(yīng)體 % =IOXA-Tailing Buffer 2 μ L, dNTP Mixture 1.6yL(各 2. 5mmol · I71)，Α-Tailing Enzyme 0. 2 μ L, StBADH10 μ L(2 μ g)，Ckffl2O 6. 2 μ L ；反應(yīng)程序為72°C反應(yīng)20min，冰中靜置2min ；StBADH基因3，端加上多聚腺苷酸‘PolyA，尾反應(yīng)的產(chǎn)物連入pMD19_T載體 (TaKaRa)中，連接反應(yīng)體系(10 μ L) :pMD19_T載體1 μ L，StBADH加‘PolyA，尾反應(yīng)的產(chǎn)物 4 μ L, Solution I 5 μ L ;16°C過夜反應(yīng)，取10 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細胞(南京天 為生物技術(shù)有限公司)，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-硫代半乳糖苷(X-Gal)、異丙 基_硫代_ β -D-半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板培養(yǎng)基(南京基天生 物技術(shù)有限責(zé)任公司)上37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆(白色菌落)，在含有氨芐青霉素 (Amp)的LB液體培養(yǎng)基(南京基天生物技術(shù)有限責(zé)任公司)中37°C過夜擴大培養(yǎng)后，質(zhì)粒 用AxyPr印質(zhì)粒DNA小量試劑盒(AXYGEN)提取純化，測序驗證，得到pMD_StBADH ；3)中間載體 pCAMBIA3301-T800 的構(gòu)建。全序列合成含有CaMV35S啟動子、PUC18 Polylinker多克隆位點、Nos終止子的 PT800DNA片段(見SEQ ID N0. 2)，其中，CaMV35S啟動子的上游和Nos終止子的下游分別 引入了 EcoRI (Promega)和HindIII (Promega)酶切位點(北京鼎國昌盛生物科技有限公 司)；pT800DNA片段(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)與pCAMBIA3301 (澳大利亞 國際農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)應(yīng)用中心)分別EcoR I (Promega)/Hind III(Promega)雙酶切，回收 PT800中843bp的片段與pCAMBIA3301中11273bp的大片段，按4 1的比例用T4DNA連接 酶(TaKaRa)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細胞(南京天為生物技術(shù)有限公司)，質(zhì)粒用 AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒(AXYGEN)提取純化，進行雙酶切驗證①取pT800DNA 片段與植物載體 pCAMBIA3301 各 15 μ L，分別用 EcoR I (Promega) 和 HindIII(Promega)雙酶切，50yL 酶切反應(yīng)體系10XE Buffer 5 μ L, 100 X BSA
0.5yL，質(zhì)粒 pT800DNA 片.段或 pCAMBIA330115 μ L(彡 1 μ g)，EcoR I 1. 25 μ L, HindIII
1.25μ L，補ddH20至50μ L，37°C反應(yīng)3h ；酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠回收 試劑盒(AXYGEN)回收pT800中843bp的片段與pCAMBIA3301中11273bp的大片段；
②用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收pT800中843bp的片段與pCAMBIA3301中 11273bp的大片段，按4 1的比例用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接，連接反應(yīng)體系(25 μ L) IOXT4 IigaseBuffer 2. 5 μ L, ρΤ800 片段 8 μ L，pCAMBIA3301 大片段 2 μ L，T4DNA 連接酶 1 μ L，ddH20 11. 5 μ L ; 16°C過夜連接反應(yīng)，取10 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Τ0Ρ10感受態(tài)細胞(南京 天為生物技術(shù)有限公司)，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-硫代半乳糖苷(X-Gal)、異丙 基_硫代_ β -D-半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板培養(yǎng)基(南京基天生 物技術(shù)有限責(zé)任公司)上37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆(白色菌落)，在含有氨芐青霉素 (Amp)的LB液體培養(yǎng)基(南京基天生物技術(shù)有限責(zé)任公司)中37°C過夜擴大培養(yǎng)后，質(zhì)粒 用 AxyPr印質(zhì)粒DNA小量試劑盒(AXYGEN)提取純化，EcoR I (Promega) /Hind III(Promega) 雙酶切驗證，結(jié)果見圖1，得到構(gòu)建成功的中間載體PCAMBIA3301-T800 ；4)抗除草劑植物表達載體pCAMBIA3301-StBADH-T800的構(gòu)建含Sma I和Xba I兩個酶切位點的pMD_StBADH與中間載體pCAMBIA3301_T800 分別 Sma I (Promega)/Xba I (Promega)雙酶切，回收 pMD_StBADH 中 1522bp 的小片段與 PCAMBIA3301-T800中12107bp的大片段，按4 1的比例用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細胞(南京天為生物技術(shù)有限公司)，質(zhì)粒用AxyPr印質(zhì)粒DNA 小量試劑盒(AXYGEN)提取純化，進行雙酶切驗證①取質(zhì)粒pMD-StBADH 與 pCAMBIA3301_T800 各 15 μ L，分別用 Sma I (Promega) / XbaI (Promega)雙酶切，50 μ L 酶切反應(yīng)體系Multi_Core Buffer 5 μ L, 100 XBSA 0· 5 μ L，質(zhì)粒 pMD-StBADH 或 pCAMBIA3301_T80015 μ L (彡 1 μ g)，Sma I 1. 25 μ L，補 ddH20 至50μ L，25°C反應(yīng)3h ；65°C保溫lOmin，待冷卻后再加入XbaI 1. 25μ L，37°C反應(yīng)3h ；酶 切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析(圖2)，用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收pMD-StBADH中 1522bp的小片段與pCAMBIA3301-T800中12107bp的大片段；②用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收pMD-StBADH中1522bp的小片段與 PCAMBIA3301-T800中12107bp的大片段，按4 1的比例用T4DNA連接酶(TaKaRa)連 接，連接反應(yīng)體系(25μ L) :10XT4 ligase Buffer 2· 5 μ L，pMD-StBADH 小片段 8 μ L， PCAMBIA3301-T800 大片段 2μ L，T4DNA 連接酶 1 μ L，ddH20 11. 5 μ L ; 16 °C 過夜連接反 應(yīng)，取10 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細胞(南京天為生物技術(shù)有限公司)，在含有 5_溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖苷(X-Gal)、異丙基-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、 氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板培養(yǎng)基(南京基天生物技術(shù)有限責(zé)任公司)上37°C過夜 培養(yǎng)，挑取陽性單克隆(白色菌落)，在含有氨芐青霉素(Amp)的LB液體培養(yǎng)基(南京基 天生物技術(shù)有限責(zé)任公司)中37°C過夜擴大培養(yǎng)后，質(zhì)粒用AxyPr印質(zhì)粒DNA小量試劑盒 (AXYGEN)提取純化，Sma I (Promega) /Xba I (Promega)雙酶切驗證，得到構(gòu)建成功的抗除草 劑植物表達載體pCAMBIA3301-StBADH-T800，圖譜見圖3。綜上所述，本發(fā)明構(gòu)建的野生茄子耐鹽基因StBADH抗除草劑植物表達載體 pCAMBIA3301-StBADH-T800為野生茄子中首次報道，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鹽敏感農(nóng)作 物遺傳轉(zhuǎn)化，提高鹽敏感農(nóng)作物耐鹽性和抗除草劑特性，消除鹽堿地逆境對鹽敏感農(nóng)作物 的危害，可進行農(nóng)作物品種改良。
權(quán)利要求
野生茄子耐鹽基因StBADH抗除草劑植物表達載體，其特征在于由野生茄子耐鹽基因StBADH與抗除草劑植物表達載體構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的野生茄子耐鹽基因StBADH抗除草劑植物表達載體，其特征在 于所述的抗除草劑植物表達載體為分別用EcoR I/Hind III雙酶切全序列合成的pTSOODNA 片段和抗除草劑植物表達載體PCAMBIA3301，回收pT800中843bp的片段與pCAMBIA3301中 11273bp的大片段，連接所述兩個片段得到的中間載體pCAMBIA3301-T800。
3.權(quán)利要求2所述的野生茄子耐鹽基因StBADH抗除草劑植物表達載體的構(gòu)建方法，其 特征在于包括如下步驟1)野生茄子耐鹽基因StBADH的克隆選用野生茄子作為試驗材料，取幼嫩葉片，提取總RNA，取其2 μ g反轉(zhuǎn)錄cDNA，用RNase 消化cDNA產(chǎn)物，根據(jù)NCBI上公布的番茄(Solanum lycopersicum) amadh2序列信息設(shè)計特 異引物，進行高保真聚合酶鏈式PCR反應(yīng)，在合成的野生茄子葉片cDNA中擴增含Sma I和 Xba I兩個酶切位點的StBADH基因，PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收純化；2)StBADH加多聚腺苷酸‘PolyA’尾反應(yīng)按照DNA Α-Tailing試劑盒說明，以步驟1)得到的PCR純化產(chǎn)物為反應(yīng)底物，在 StBADH基因3’端加上多聚腺苷酸‘PolyA，尾；StBADH加‘PolyA’尾反應(yīng)的產(chǎn)物連入 PMD19-T載體中，轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細胞，測序驗證，得到pMD_StBADH ；3)中間載體pCAMBIA3301-T800的構(gòu)建全序列合成含有CaMV35S啟動子、PUC18 Polylinker多克隆位點、Nos終止子的 PT800DNA片段SEQ ID NO. 2，其中，CaMV35S啟動子的上游和Nos終止子的下游分別引入了 EcoRI和HindIII酶切位點；所述的pT800片段與pCAMBIA3301分別EcoR I/Hind III雙 酶切，回收PT800中843bp的片段與pCAMBIA3301中11273bp的大片段，用T4DNA連接酶連 接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細胞，質(zhì)粒用AxyPr印質(zhì)粒DNA小量試劑盒提取純化，EcoR I/Hind III雙酶切驗證，得到構(gòu)建成功的中間載體pCAMBIA3301-T800 ；4)StBADH抗除草劑植物表達載體pCAMBIA3301-StBADH-T800的構(gòu)建含Sma I和Xba I兩個酶切位點的pMD_StBADH與中間載體pCAMBIA3301_T800分別 Smal/Xba I 雙酶切，回收 pMD-StBADH 中 1522bp 的小片段與 pCAMBIA3301_T800 中 12107bp 的大片段，用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細胞，質(zhì)粒用AxyPr印質(zhì)粒DNA 小量試劑盒提取純化，Sma I/Xba I雙酶切驗證，得到構(gòu)建成功的抗除草劑植物表達載體 pCAMBIA3301-StBADH-T800。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及了野生茄子耐鹽基因StBADH抗除草劑植物表達載體。本發(fā)明所述的野生茄子耐鹽基因StBADH序列為SEQ ID NO.1，該基因的抗除草劑植物表達載體是將該StBADH基因插入到中間載體pCAMBIA3301-T800的Sma I/Xba I酶切位點間得到的。將該抗除草劑植物表達載體用于農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化，大量合成甜菜堿生物合成的關(guān)鍵酶，將會提高其耐鹽堿能力。同時，該抗除草劑植物表達載體中含有的bar基因的表達產(chǎn)物膦絲菌素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，能使植物抵抗以L-Phosphinothricin(膦絲菌素，PPT)為活性成分的除草劑。
文檔編號C12N15/82GK101979604SQ20101054155
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月12日
發(fā)明者朱月林, 楊立飛, 蓋鈞鎰, 陳罡 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)