專利名稱：微生物酶法拆分dl-半胱氨酸制備d-胱氨酸的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術生產氨基酸的技術領域，涉及通過微生物酶法拆分DL-半胱 氨酸生產D-胱氨酸的方法。
背景技術：
胱氨酸是重要醫藥中間體，也常用于制備復方氨基酸口服制劑或輸液、染化劑、化 妝品、乳制品添加劑、油脂抗氧劑等；還可用于重金屬解毒劑、肝炎等藥物。胱氨酸具有促進 機體細胞氧化還原能力，增強白血球的抗感染能力，可用于治療白血球減少癥、冠心病，防 治脂肪肝、肝硬化，促毛發生長、防皮膚老化，也可用于傷寒痢疾、流感、氣喘、神經痛、濕疹 及各種中毒等疾患的治療。D-胱氨酸為D-半胱氨酸的二聚體，通過還原手段可以有效獲得重要的藥物中間 體D-半胱氨酸。D-半胱氨酸是一種非天然氨基酸，可廣泛應用于醫藥、食品、化妝品、飼 料等行業，是手性藥物的重要中間體，如D-半胱氨酸是合成第三代頭孢菌素——頭孢米 諾鈉的重要原料，在7 β位側鏈末端引入了 D-半胱氨酸，具有很強的殺菌作用，可以用于 治療呼吸道感染；由D-半胱氨酸衍生得到的D-青霉胺可作為解毒藥，用于重金屬的拮抗 劑，也用于類風濕性關節炎及慢性活動性肝炎等免疫性疾病的治療；另外，2-(2，4-二酚 羥基)-4，5-二氫噻唑-4 (S)-羧酸、N-乙酰-D-半胱氨酸、FK-228, N-(S)-3-烷基庚酰 基-D-R-谷氨酰基-甘氨酰基-D-丙氨酸和阿奇霉素等系列藥物均以D-半胱氨酸為原料。 除此之外，D-半胱氨酸鹽還是大腸桿菌的強抑制劑，亦可作為急性酒精中毒的緩解劑，同 時也是一些蛋白酶的抑制劑，在炎癥以及HIV治療等方面也具有一定療效，因此用途十分 廣泛。D-半胱氨酸鹽酸鹽的制備工藝比較復雜，通常采用不對稱合成方法制備，反應步 驟多，生產控制難度大，需要使用價格昂貴的手性試劑；而酶法拆分反應條件溫和，選擇性 強，副反應少，收率高，光學純度高，是D-半胱氨酸生產的有效方法。L-半胱氨酸脫巰基酶(L-cysteine desulfhydrase，CD)可將L-半胱氨酸分解為 丙酮酸、H2S和NH3,因此可以利用L-半胱氨酸脫巰基酶催化分解L-半胱氨酸，進而保留高 純度的D-半胱氨酸，并通過氧化達到制備D-胱氨酸的目的，該途徑具備較好的工業化應用 前景。目前DL-半胱氨酸拆分主要是采用化學方法，化學拆分法是使外消旋體與手性試 劑作用生成非對映體，利用非對映體物理、化學性質的差異而將它們分開。目前常用的以 DL-半胱氨酸為原料拆分制備D-半胱氨酸的幾種路線分別如下(1)以L-酒石酸為拆分 齊U，經由2，2- 二甲基四氫噻唑-4-羧酸不對稱轉化，生成D-2，2- 二甲基四氫噻唑-4-羧 酸-L-酒石酸鹽，隨后使其在水溶液中水解，得到D-半胱氨酸。(2)以DL-半胱氨酸為原 料，先制備D-4-四氫噻唑-4-羧酸，然后再使其和羥胺反應得到半胱氨酸，之后利用優先結 晶的方法得到旋光異構體。(3)以L-噻唑啉羧酸為拆分劑，生成DL-半胱氨酸-噻唑啉羧 酸鹽，利用優先結晶的方法得到D-、L-半胱氨酸-噻唑啉羧酸鹽，之后采用三乙胺處理可得到光學純度的D-和L-半胱氨酸。上述幾種常用的化學拆分方法具有步驟長，收率低，不利 于環保的缺點。酶對旋光性物質具備選擇性，且專一性好，所以可以選擇適當的酶對外消旋體進 行拆分。2009年，焦慶才等(200910032018.9)以DL-半胱氨酸作為原料，將具有高活力 L-色氨酸酶的基因工程大腸桿菌的菌體細胞與含有DL-半胱氨酸的混合氨基酸或DL-半 胱氨酸鹽酸鹽的轉化液混合，30 45°C下進行酶促反應，然后用等電點結晶法或等電點結 晶與離子交換樹脂相結合的方法分離轉化產物，得到高純度D-半胱氨酸和L-色氨酸。但 采用L-半胱氨酸脫巰基酶拆分DL-半胱氨酸制備D-半胱氨酸或D-胱氨酸的研究目前尚 未見報道。
本發明則利用高效表達L-半胱氨酸脫巰基酶的大腸桿菌的菌體細胞為酶源，酶法拆 分DL-半胱氨酸制備D-胱氨酸，具備催化效率高，反應條件溫和，發酵成本低等特點，具有 良好的產業化前景。
發明內容
本發明的目的是解決現有DL-半胱氨酸拆分技術中存在的上述問題，提供一種微 生物酶法拆分DL-半胱氨酸制備D-胱氨酸的綠色生產方法。本發明涉及基因工程菌大腸桿菌BL21(DE3)-pET21a(+)-CD，以底物DL-半胱氨酸 出發，經基因工程菌表達的L-半胱氨酸脫巰基酶直接催化拆分制備獲得D-半胱氨酸，并經 氧化和分離純化最終獲得產物D-胱氨酸的工藝路線。本發明構建了高效表達L-半胱氨酸脫巰基酶的基因工程菌株大腸桿菌 BL21(DE3)-pET21a(+)-CD，即以TS1138菌株(已于2007年1月17日保藏于“中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCC No. 1920)基因組DNA為模板進行PCR 擴增L-半胱氨酸脫巰基酶基因(Genbank :AY675347)，并在大腸桿菌BL21 (DE3)中進行表 達，酶活力可達126. 5 U/g，純化后測定其米氏常數Km值為2. 63 mmol/L ；最大反應速度Vmax 為0. 10 mmol/mL · min ；其中大腸桿菌BL21 (DE3)以及對應的表達載體pET21a(+)均為文 獻報道和商業化可利用的表達體系。以上述重組菌株的菌體為酶源，本發明建立了以DL-半胱氨酸為底物，經酶促反 應生物拆分DL-半胱氨酸生產D-胱氨酸的方法。本發明提供的微生物酶法拆分DL-半胱氨酸制備D-胱氨酸的方法，具體包括 以高效表達L-半胱氨酸脫巰基酶的基因工程重組菌的菌體為酶源，酶促反應過程中，
向反應體系中加入上述菌體1 g/L至50 g/L，底物DL-半胱氨酸用量為1 g/L至12 g/L。 在20至60°C下，pH值為6. 5至9. 5，經酶法轉化反應20 min至5 h，產生D-半胱氨酸，過 濾去除菌體后進一步通入空氣氧化后得到D-胱氨酸。本發明分離拆分氧化后獲得的D-胱氨酸的純化方法是將上述反應液調節pH至 5. 0，對D-胱氨酸進行等電點沉淀。在本發明實施例中，采用柱前衍生化HPLC法來測定D/L-半胱氨酸的含量，衍生化 試劑為Marfey試劑，即1_氟_2，4_ 二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺(l-fluoro-2，4-dinitro phenyl-5-L-alanine amide, FDAA)。它含有一個手性碳原子，在與含手性碳原子的氨基酸反應時，由于空間位阻的影響，可以有效地抑制氨基酸發生消旋化反應，因此可以將兩種不 同構型的同一氨基酸衍生為非對映異構體，從而達到分離鑒定的目的。柱前衍生化方法如 下以100 μ L 10 mmol/L Na2CO3溶液(pH 9)溶解半胱氨酸，使其終濃度為10 40 mmol/ L，隨后加入到1%的FDAA 200 μ L丙酮溶液中，40°C孵育1 h后，加入2N HCl 20 μ L終 止反應，20 mL進樣用于HPLC分析。色譜條件C18色譜柱(Phenomenex Luna 5μ , 100Α, 250X4. 6mm)，以水乙腈(含0. 1%TFA)=1 :1為流動相；室溫，檢測波長340 nm，流速為ImL/ min0連續進樣5次，計算峰面積并取平均值，以D/L半胱氨酸濃度(X，mmol/L)為橫坐標，峰 面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線。酶促反應所產生的D-半胱氨酸經稀釋10倍后取IOOmL, 按上述方法進行衍生后，以HPLC測定，依據標準曲線進行精確定量。胱氨酸的檢測采用相似的柱前衍生化HPLC方法，主要參數與方法同上。本發明的有益效果本發明以底物DL-半胱氨酸出發，利用高效表達L-半胱氨酸 脫巰基酶的大腸桿菌BL21 (DE3) -pET21a (+) -CD的菌體為酶源，酶法拆分DL-半胱氨酸生產 D-胱氨酸。由于采用菌體直接進行酶法拆分，方便易行，催化效率高，發酵成本低，因此本發 明在D-胱氨酸的工業化生產領域具有良好的產業化前景。
圖1是L-半胱氨酸脫巰基酶的SDS-PAGE(A)和酶活性染色(B)
1 包含 pET-21a(+)的萬.coli BL21 (DE3)菌體裂解液；2 包含 pET_21a (+)的萬.coli BL21(DE3)菌體裂解液經Ni-NTA His Bind樹脂純化的產物；3 包含pET_21a (+)-CD的五 coli BL21(DE3)菌體裂解液；4 包含pET_21a (+)-CD的萬.coli BL21(DE3)菌體裂解液經 Ni-NTA His Bind樹脂純化的產物；5 :TS1138菌體裂解液；6 從TSl 138菌株純化的L-半 胱氨酸脫巰基酶；M，蛋白分子量標準。圖2是D/L-半胱氨酸(A)及D/L-胱氨酸(B)柱前衍生HPLC分析。圖3是大腸桿菌菌體為酶源的轉化條件分析
A :pH與D-半胱氨酸純度的關系；B溫度與D-半胱氨酸純度的關系；C 底物濃度與 D-半胱氨酸純度的關系；D 酶源濃度D-半胱氨酸純度的關系；E 反應時間與D-半胱氨酸 轉化率的關系。圖4是不同轉化時間下D-半胱氨酸收率曲線 圖5是D-胱氨酸的純度分析。
具體實施例方式實施例1
基因工程菌大腸桿菌的構建及L-半胱氨酸脫巰基酶的高效表達 根據KT2440菌株的L-半胱氨酸脫巰基酶基因序列(743003)設計引物，上游引物CDl 5，-CCG GGA TCC ATG AAG TTG CCG ATC TAC CTT G-3，，下游引物 CD2 :5，-CCC AAG CTT TTA GTG GGC GGC CCA CTC-3’，以TSl 138菌株基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得L-半 胱氨酸脫巰基酶基因，并構建重組表達質粒pET-21a(+)-CD。將重組質粒轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，構建得到L-半胱氨酸脫巰基酶基因 工程菌株。
將陽性重組菌株接種于4 mL含韋AmP 20 μ g/mL的LB培養基中過夜培養，隨后 以2%轉接量接入50 mL含有20 μ g/mL的新鮮LB培養基中，37 ！振蕩培養24 h，離 心收集菌體，PBS洗滌后將菌體細胞破碎后進行SDS-PAGE分析及酶活分析，利用L-半胱氨 酸脫巰基酶可催化L-半胱氨酸分解，生成丙酮酸、氨和硫化氫這一特性，可以通過酶染的 方式對其活性進行鑒定。經過非變性蛋白電泳后，采用特異性酶染溶液對PAGE膠進行染 色。特異性酶染溶液中含有L-半胱氨酸和BiCl3, L-半胱氨酸脫巰基酶分解L-半胱氨酸 所產生的H2S可以與BiCl3反應生成黑褐色的沉淀Bi2S3，根據顏色反應即可鑒定L-半胱氨 酸脫巰基酶的活性。圖1的結果表明，重組表達的L-半胱氨酸脫巰基酶具有酶學活性。實施例2
柱前衍生HPLC法測定D/L-半胱氨酸及D/L-胱氨酸 柱前衍生化方法如下以100 μ L 10 mmol/L Na2CO3溶液(pH 9)溶解D/L-半胱氨 酸，使其終濃度為10 40 mmol/L，隨后加入到1%的FDAA 200 μ L丙酮溶液中，40°C孵育 1 h后，加入2N HCl 20 μ L終止反應，20 mL進樣用于HPLC分析。色譜條件C18色譜柱 (Phenomenex Luna 5 μ，100Α, 250 X 4. 6mm)，以水乙腈(含 0. 1%TFA) =1 1 為流動相；室 溫，檢測波長340nm，流速為lmL/min。連續進樣5次，計算峰面積并取平均值，以D/L-半胱 氨酸濃度(X，mmol/L)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線。酶促反應所產生的 D-半胱氨酸經稀釋10倍后取IOOmL,按上述方法進行衍生后，以HPLC測定，依據標準曲線 進行精確定量。D/L-胱氨酸的測定采用相似方法，衍生方法及色譜條件同半胱氨酸的方法。 結果如圖2，表明采用柱前衍生HPLC法可以達到測定D/L-半胱氨酸及D/L-胱氨酸的純度 及定性、定量的目的。實施例3
以大腸桿菌菌體為酶源，考察D-半胱氨酸制備的條件
以上述實例1中重組大腸桿菌菌體為酶源，分別在每升反應液中加入底物DL-半胱氨 酸的加入量為廣12 g ；轉化pH值為6. 5 9. 5 ；轉化溫度為2(T60°C;菌體濃度廣50 g/L ’轉 化時間為2(T300 min0 (以上各參數具體取值如圖3中各點所示，此處略)考察不同的轉 化條件對D-半胱氨酸純度的影響。圖3Α 考察pH與D-半胱氨酸純度的關系；菌體濃度5 g/L ；底物DL-半胱氨酸用 量為5 g ；轉化溫度為40°C ；轉化時間為0. 5 h。圖3B 考察反應溫度與與D-半胱氨酸純度的關系；菌體濃度5 g/L ；底物DL-半 胱氨酸用量為5 g ；轉化pH值為9. 0 ；轉化時間為0. 5 h。圖3C 考察底物DL-半胱氨酸與D-半胱氨酸純度的關系；菌體濃度5 g/L ；轉化 溫度為45 V ；轉化pH值為9. 0 ；轉化時間為0. 5 h。圖3D 考察菌體濃度與D-半胱氨酸純度的關系；底物DL-半胱氨酸用量為6 g ； 轉化溫度為45 0C ；轉化pH值為9. 0 ；轉化時間為0. 5 h。圖3E 考察反應時間與D-半胱氨酸純度的關系；菌體濃度10 g/L ；底物DL-半胱 氨酸用量為6 g ；轉化溫度為45 0C ；轉化pH值為9. 0。根據上述考察，確定了最優的拆分條件為最適pH 9.0，最適反應溫度為45 V， 最適底物濃度為6 g/L，最佳菌體濃度為10 g/L，最適催化反應時間為1 h。實施例4以大腸桿菌菌體為酶源，酶法拆分DL-半胱氨酸生產D-胱氨酸 根據實施例3確定的拆分條件，以上述實例1中重組大腸桿菌菌體為酶源，在1升反應 液中加入菌體10g，DL-半胱氨酸6 g，反應溫度45 pH 9.0，轉化時間1 h，進行DL-半 胱氨酸的拆分(圖4)。過濾后得酶促反應后的轉化液，測定D-半胱氨酸含量為1. 96g ；收 率為65.3%。通入空氣，攪拌下氧化20 h，調pH至D-胱氨酸的等電點5.0，收集D-胱氨酸， 并采用與實施例2的方法進行檢測，產物D-胱氨酸純度達到98. 7%(圖5)，測定其比旋度 [a ]20d 為 +225°。
權利要求
、一種微生物酶法拆分DL 半胱氨酸制備D 胱氨酸的方法，其特征在于該方法包括以高效表達L 半胱氨酸脫巰基酶的基因工程重組菌的菌體為酶源，以DL 半胱氨酸為底物，在20至60 ℃下，pH值為6.5至9.5，經酶法轉化反應20 min至5 h，產生D 半胱氨酸，進一步氧化后得到D 胱氨酸。
2.根據權利要求1所述的方法，其特這在于所采用的酶為具備水解L-半胱氨酸的 L-半胱氨酸脫巰基酶。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述重組L-半胱氨酸脫巰基酶基因 工程菌為大腸桿菌BL21(DE3)，基因來源為惡臭假單胞菌TS1138菌株，表達的載體為 pET-21a (+) -CD重組表達載體，重組L-半胱氨酸脫巰基酶的菌體可高效表達高活性的L-半 胱氨酸脫巰基酶。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于每升反應液中，酶原細胞濃度為1至50g/L0
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于以所述的重組大腸桿菌菌體為酶源，每升 反應液中底物DL-半胱氨酸的加入量為1至12 g。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于每升反應液中，底物DL-半胱氨酸的用量 優選為6 g ；優選轉化溫度為45 尤選轉化pH值為9. 0 ；優選轉化時間為1 h ；優選的菌 體濃度為10 g/L。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于D-胱氨酸的純化方法是采用過濾方法 去除菌體后，向酶促轉化液通入空氣氧化5至24 h，使D-半胱氨酸氧化為D-胱氨酸，再調 節PH至5. 0，使D-胱氨酸等電點結晶析出，收集沉淀得D-胱氨酸。
全文摘要
一種微生物酶法拆分DL-半胱氨酸制備D-胱氨酸的方法。本發明利用高效表達L-半胱氨酸脫巰基酶的重組大腸桿菌的菌體為酶源，以DL-半胱氨酸為底物，經酶促反應拆分DL-半胱氨酸生產D-半胱氨酸。酶促反應液過濾去除菌體后通過氧化使D-半胱氨酸氧化為D-胱氨酸，再調節pH至5.0，等電點結晶析出D-胱氨酸，收集沉淀，洗滌、精制后獲得D-胱氨酸。本發明采用菌體直接進行酶法拆分，方便易行，催化效率高，發酵成本低，因此本發明在D-胱氨酸的工業化生產領域具有良好的產業化前景。同時本發明提供了一種新的D-胱氨酸的綠色生產工藝路線。
文檔編號C12R1/19GK101974605SQ20101054121
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月12日 優先權日2010年11月12日
發明者侯潔, 張奇, 張璽, 段靜靜, 白芳, 白鋼 申請人:南開大學