專利名稱：一種發光細菌的快速、高通量急性毒性測試方法
技術領域：
本發明涉及的是一種發光細菌的快速、高通量急性毒性測試方法，屬于環境檢測和評價技術范疇。
背景技術：
隨著社會進步和工農業生產的發展，越來越多的化學品被生產和使用，目前已登記的化學品數量超過數千萬種之多，日常使用的化學品超過10萬種。這些化學品在生產和使用過程中可能通過多種途徑進入環境，進而蓄積在人體、生物體中，對生態環境和人體健康造成嚴重威脅。為有效管理化學品、準確評價環境樣品的安全性，生物毒性測試逐漸發展成為一種必不可少且最為直觀有效的方法。發光細菌毒性檢測是建立在細菌發光生物傳感方法基礎上的毒性檢測技術，具有快速、經濟、重現性好、與魚等其他毒性測試結果可比性高等諸多優勢。發光細菌的發光過程是菌體內一種新陳代謝的生理過程，發光的波長在490nm左右。當有毒有害物質與發光細菌接觸時會影響發光菌的新陳代謝，發光強度的減弱與毒性物質的濃度成正比。目前，發光細菌法已廣泛應用于質檢、環境監測、水產養殖等領域，被國內外多國權威機構列為標準方法，如 IS011348,GB/T15441-1995,DIN38412 等。傳統的發光細菌毒性檢測方法是，在15°C溫度下，以不含毒性物質的溶液作為對照，化學品或環境樣品溶液與測試菌液接觸15min后，測定化學品對發光細菌的抑制率。待測樣品的毒性結果以LID值(達到一定抑制率時樣品的稀釋倍數)、EC值(造成一定抑制率時樣品的濃度)表示。而我國標準GB/T15441-1995中水質的毒性水平是以氯化汞的當量濃度來表征。然而，傳統的發光細菌毒性測試方法或多或少存在一些不足，首先，傳統方法多推薦使用凍干粉保存發光細菌菌種，凍干粉菌種的復蘇過程一般比較費時，快的需要幾個小時，慢的需要幾天，這樣需要花費較多時間進行菌種的復蘇或前培養，延長了毒性測試的時間。其次，大多數傳統毒性測試方法采用試管作為暴露容器，測試所需的樣品量較大，而且工作菌液的加入量也較多，這樣不可避免地稀釋了待測溶液的濃度，導致結果不夠準確。此夕卜，傳統方法測試一般每次可以測試的樣品數量有限，不利于對大量樣品的毒性篩查。因此，開發一種發光細菌的快速、高通量急性毒性測試方法十分迫切。
發明內容
本發明的目的是為克服傳統發光細菌急性毒性測試中工作菌液前培養時間長、待測樣品需要量較大、實驗操作時間長、難以保證準確的暴露時間和暴露濃度、測試誤差較大、難以開展大量樣品的快速篩查等不足，提供一種發光細菌快速的復蘇方法，為有毒化學污染物和環境樣品的高通量毒性篩查方法提供技術保障。本發明的目的通過以下方式實現開發出一種復蘇溶液，能快速復蘇以凍干粉、或冷凍保存的發光細菌菌種，將保存的菌種接入復蘇溶液后經過一定時間的攪拌，即可直接
3用于毒性測試；同時，采用微孔板作為毒性測試的暴露容器和檢測池，既減少了測試所需樣品的體積，又避免了傳統測試過程中對待測樣品的不必要稀釋；通過采用多道移液器轉移溶液和酶標儀檢測發光強度，既縮短了測試時間，又提高了結果的準確性，實現了高通量化。本發明的優點主要體現在以下幾個方面(1)開發了一種針對發光細菌凍干粉和冷凍保存菌種的復蘇溶液，可快速復蘇菌種，無需繁瑣、費時的菌液前培養，即可用于毒性測試；(2)采用微孔板既作為毒性測試中暴露容器，又作為菌液發光強度的檢測池，減少了測試所需樣品的體積；(3)采用多道移液器轉移待測樣品和工作菌液，減少了實驗操作時間；(4)用化學發光酶標儀檢測發光細菌的發光強度，加快了檢測速度，也提高了檢測的靈敏度和數據的準確性；( 采用微孔板測試，可以同時測定多個樣品，通過設定平行樣，降低了實驗誤差，保證了實驗結果的可靠性，實現了毒性測試的高通量化。綜上，本發明通過開發一種針對發光細菌菌種快速復蘇的溶液、采用微孔板作為毒性測試的暴露容器和檢測池，既實現了菌種的快速復蘇，又縮短了毒性測試時間，也提高了測試的靈敏度和測試數據的準確性，實現了急性毒性測試方法的快速、準確和高通量化， 所得測試結果與原標準方法一致。
圖1.發光細菌快速毒性測定法與國標方法測試結果比較圖2.發光強度隨復蘇時間的變化實施例取一支市售的發光細菌凍干粉或冷凍保存的凍存管，在20°C條件下快速解凍，向管中加入LOmL復蘇溶液，混合均勻后，小心將管中的混合液轉入IOOmL復蘇溶液，在20°C 條件下以500轉/分鐘的速度攪拌30分鐘。在一只96微孔板上，用8通道移液器向微孔板中移入245 μ L體積的待測樣品溶液，然后再快速向每孔移入5 μ L體積的工作菌液，開始計時。15分鐘后在化學發光酶標儀上測試微孔板每個孔的發光強度，并記錄結果。
權利要求
1.一種發光細菌的快速、高通量測試方法，屬于環境檢測和評價技術范疇。通過開發一種發光細菌的復蘇溶液，能在30分鐘內快速復蘇發光細菌的凍干粉或冷凍保存的菌種，復蘇后的菌液無需前培養即可作為毒性測試的工作菌液。同時采用微孔板作為毒性測試的暴露容器和檢測池，縮短了實驗操作時間，減少了待測樣品的用量，加快了測試速度，提高了測試的準確性，便于推廣應用。
2.權利要求1所述的一種發光細菌的快速、高通量測試方法，其特征在于不僅適用于明亮發光桿菌T3小種、費氏弧菌等海洋型菌，也適用于青海弧菌等淡水型菌。
3.權利要求1所述的一種發光細菌的快速、高通量測試方法，其特征還在于不僅適用于發光細菌的凍干粉菌種，也適用于冷凍保存的菌種。
4.權利要求1所述的一種發光細菌的快速、高通量測試方法，其特征還在于快速復蘇溶液的組成，包括氯化鈉、磷酸鹽、氯化鎂、氯化鉀等無機組分，以及胰蛋白胨、酵母膏、氨基酸、甘油、維生素、葡萄糖等有機組分。
5.權利要求1所述的一種發光細菌的快速、高通量測試方法，其特征還在于采用微孔板作為毒性測試的暴露容器和檢測池，減小了待測樣品的體積，縮短了實驗操作的時間，提高了毒性測試的速度和實驗數據的準確性。
6.權利要求1所述的一種發光細菌的快速、高通量測試方法，其特征還在于不僅適用于12孔板、M孔板、96孔板、還適用于384孔板。
全文摘要
本發明涉及一種發光細菌的快速、高通量急性毒性測試方法，屬于分析檢測與技術范疇。通過研發一種發光細菌的復蘇溶液，可在30分鐘內將發光細菌凍干粉、冷凍保存的菌種快速復蘇，復蘇后的菌液無需前培養，攪拌一定時間后即可作為工作菌液直接用于毒性測試。同時，選擇微孔板作為毒性測試的暴露容器和檢測池，在孔中加入待測樣品和工作菌液，暴露15分鐘后即可采用化學發光酶標儀進行發光強度測試。采用該方法既省去了煩瑣、耗時的工作菌液前培養程序，又節省了檢測時間，降低了成本，提高了測試結果的準確性，實現了毒性測試的高通量化，具有廣闊的推廣應用前景。
文檔編號C12Q1/02GK102465167SQ20101053705
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月10日 優先權日2010年11月10日
發明者杜宇國, 譚卓威, 魏東斌 申請人:中國科學院生態環境研究中心