專利名稱：楊梅突發性枝葉凋萎病病原菌鑒定方法
技術領域：
本發明屬于植物病害鑒定領域，具體涉及一種楊梅突發性枝葉凋萎病的鑒定方法。
背景技術：
楊梅(Myrica rubra)是我國南方特有水果，果實甜酸適口，風味獨特，在國內外享有盛譽，因其顯著的經濟與生態效益，目前全國楊梅栽培已達300萬畝以上。2008年我省楊梅栽培面積已近120萬畝，產量35余萬噸，總產值達20多億元。在楊梅產業對山區農民脫貧致富發揮越來越重要作用之際，近年發生的新型病害楊梅突發性枝葉凋萎病已在我省仙居、瑞安、臨海、黃巖等地大面積發生，據不完全統計，僅仙居一地瀕臨枯死的面積就已達 5000余畝，可見楊梅突發性枝葉凋萎病具有廣泛性、暴發性與毀滅性，已對我省楊梅產業造成了嚴重影響，并將成為楊梅產業健康發展的一個重大隱患，從而阻礙我省楊梅產業的持續穩定發展。
發明內容
為了盡快找出造成這一病害的原因，本發明提供一種室內離體實驗快速鑒定該病害并分離致病菌的方法。該方法包括(1)、用解剖刀小心分離發病楊梅枝干的木質部和韌皮部，韌皮部和木質部分別剪成3-4mm2的小塊組織，不需要表面消毒，輕輕放置到PDA平板上，在25°C恒溫箱培養2d后，挑取絨毛狀真菌菌絲，轉接到一個新的PDA平板上，25°C恒溫箱繼續培養5d后，取0. 5cm2的純化菌絲塊用來做致病性接種實驗。在一個優選的方法中，該方法還包括以下步驟2 在培養皿內平鋪好濾紙，用無菌水浸濕，取新生的楊梅嫩梢，剪成5-6cm長的短枝，使9cm的培養皿能水平放置2根短枝；每根短枝上撕掉兩個葉片并露出葉痕，用步驟1中獲得的0. 5cm2的純化菌絲塊輕輕放置到露出的葉痕位置，把短枝的兩端用脫脂棉吸水保濕；置于25°C的培養箱內，1 光照和12h黑暗；培養4天后調查楊梅嫩梢的發病情況；如果接種的葉痕位置變黑即為擬盤多毛孢屬致病癥狀。如果癥狀為然后沿著枝干慢慢延伸，到葉柄位置會沿著葉柄位置延伸到整個葉片變黑更為確定為擬盤多毛孢屬致病癥狀。在另一個優選的方式中，還包括以下步驟3 在自然條件下，把步驟1中獲得的適當大小的脫脂棉吸無菌水纏到嫩梢頂端下的第10片葉位置的枝條上，撕掉距楊梅樹嫩梢頂端的第3或4片葉，把0. 5cm2的純化菌絲塊輕輕放置到露出的葉痕位置，用保鮮膜條輕輕固定菌塊，用保鮮袋保濕；接種后4天調查楊梅嫩梢的發病情況；如果接種的葉痕位置變黑即為擬盤多毛孢屬致病癥狀。如果癥狀為然后沿著枝干慢慢延伸，到葉柄位置會沿著葉柄位置延伸到整個葉片變黑更為確定為擬盤多毛孢屬致病癥狀。有益效果離體檢測楊梅突發性枝葉凋萎病的病原菌方法可靠，速度快，不需要昂貴的材料， 步驟簡單，準確率高。
圖1楊梅突發性枝葉凋萎病病癥在實際田間不同部位的癥狀。A為枝梢葉片急性青枯圖，B為葉片漸漸呈枯黃而不落葉；C典型的頂枝枯黃；D頂枝和內膛枝同時發生；E整株枯死；F幼樹枯死；G幼樹枝干韌皮部開裂；H根系枯死；I成片發生J全樹落葉枯死。圖2分離菌株接種楊梅的致病性接種實驗。A和B是離體接種實驗。A為對照實驗(CK)不接種菌塊；B接種菌塊。C和D是活體接種實驗。C為接種后7天發病癥狀。D接種后15天發病癥狀。圖3病原菌形態。A和B是分離菌株在PDA平板上25°C暗培養5天菌落正面。C 和D是分離菌株在PDA平板上25°C暗培養5天，然后1 光照1 黑暗培養5天的菌落正面。E分離菌株在PDA平板上25°C暗培養5天菌落背面。F是分離菌株在PDA平板上25°C 暗培養5天，然后1 光照12h黑暗培養5天的菌落背面。G分生孢子。H分生孢子梗。
具體實施例方式通過以下具體實施例，對本發明作進一步的具體說明，但應該理解本發明并不受這些內容所限止。實驗1病害田間癥狀調查楊梅突發性“枝葉凋萎”癥主要集中爆發在10月至翌年的3-4月份，始現癥狀為當年生枝梢急性“凋萎”，即楊梅枝梢葉片首先急性青枯(圖1A)，后漸漸呈枯黃(圖1B)、褐黃直至枯死(圖1E)，癥狀初現時不落葉，1-2個月后才漸漸落葉；無論頂枝還是內膛枝均有不同程度的發生(圖IC和1D)，先零星后發生后漸漸增多，逐漸擴大呈成片發生(圖II)，山腳往往比山頂嚴重；幼樹發生后在1-2月內地上部分就漸漸枯死(圖1F)，并伴隨枝干韌皮部開裂(圖1G)，根系枯死(圖1H)；大樹發病當年枝梢枯死而枝桿正常，嚴重影響樹勢，樹冠逐年減小，2 3年后楊梅果樹林連片整株枯死(圖1J)，發病當年產量一般損失達20 40%，嚴重的達80%以上，病勢有逐年加重的趨向，直至絕收，樹木枯死。實驗2真菌分離2008-2010年分別從浙江仙居、黃巖、瑞安楊梅果園采集發病枝并隨即進行病菌分離。分離方法如下用PDA培養基(含氨芐青霉素鈉100 μ g/mL，抑制細菌的生長)進行組織分離，用解剖刀小心分離枝干的木質部和韌皮部，韌皮部和木質部分別剪成3-4mm2的小塊組織，不需要表面消毒，就輕輕放置到PDA平板上，在25°C恒溫箱培養2d后，挑取純化的絨毛狀真菌菌絲，轉接到一個新的PDA平板上，25°C恒溫箱繼續培養5d后，取0. 5cm2的純化菌絲塊用來做致病性接種實驗。實驗結果總共分離到真菌菌株259個，所有這些真菌菌株都用來首先做室內離體實驗測定其對楊梅嫩梢的致病性。實驗3離體接種試驗培養皿內平鋪好濾紙，用無菌水浸濕，取新生的楊梅嫩梢，剪成5-6cm長的短枝， 葉片稍加修剪，使9cm的培養皿能水平放置2根短枝。每根短枝上撕掉兩個葉片并露出葉痕，0. 5cm2的純化菌絲塊輕輕放置到露出的葉痕位置，把短枝的兩端用脫脂棉吸水保濕。置于25°C的培養箱內，1 光照和12h黑暗。培養4天后調查楊梅嫩梢的發病情況。不接種菌塊同樣處理的楊梅短枝做對照。選擇幼嫩枝梢的葉痕位置接種是為了讓發病速度較快并且操作方便，不用使用刀具創造傷口。實驗結果經室內離體接種發現，95%的分離真菌菌株能對楊梅嫩梢致病，其余5%對楊梅嫩梢沒影響，跟對照一樣。與對照(圖2A)相比，致病菌株對嫩梢致病情況(圖2B)，首先接種的葉痕位置變黑，然后沿著枝干慢慢延伸，到葉柄位置會沿著葉柄位置延伸到整個葉片變黑。4天調查時在枝干以及葉柄、葉片等都會出現少量小黑點，是分生孢子器，時間越長，孢子器越多。同樣，我們用同樣與實驗2的方法分離病株的葉片和根部的組織來分析目標致病菌，經過最后的分析鑒定，獲得300個真菌菌株，其中大約有20%的分離真菌對楊梅嫩梢致病，其余80%對楊梅嫩梢沒影響，跟對照一樣。所以采用枝干的木質部和韌皮部的組織可以獲得大量的致病菌，為接種鑒定提供了大量的樣本。實驗4果園接種針對室內離體實驗對楊梅嫩梢致病的菌株在楊梅樹上做致病性活體檢測實驗。本試驗在浙江省農業科學院園藝研究所的大棚內5年生楊梅樹、仙居和瑞安的10年生楊梅樹上分別進行。適當太小的脫脂棉吸無菌水纏到嫩梢頂端下的第10片葉位置的枝條上，撕掉距楊梅樹嫩梢頂端的第3或4片葉，把0. 5cm2的純化菌絲塊輕輕放置到露出的葉痕位置， 用保鮮膜條輕輕固定菌塊，用保鮮袋保濕。接種后4天、7天和15天分別解開保鮮袋，并在不同時間進行調查拍照。不接種菌塊同樣處理的楊梅嫩梢做對照。實驗結果接種結果見圖2C和圖2D，接種后4天觀察，接種位置已經變黑(圖片省略)，接種后7天，病已經沿著枝干蔓延到葉片上，葉片開始表現失水癥狀，到接種后15天嫩梢已經有多片葉片失水青枯，但是不脫落，發病癥狀與田間觀察到的相同。實驗5病菌分類鑒定PDA平板25°C培養致病菌，觀察菌落形態。分生孢子顯微鏡觀察形態。參考中國真菌志進行病菌的分類鑒定。實驗結果對楊梅致病的菌株，我們進行生長性狀觀察，發現有兩類病菌，一類菌絲旺盛，白色，絨狀(圖3A)；另一類菌株氣生菌絲聚集隆起，形成波浪狀的同心輪紋(圖:3B)。黑色分生孢子堆在菌落上不規則散生(圖3C)或者輪紋狀(圖3D)，邊緣整齊。平板背面一般呈暗黃色(圖3E)或者由于分生孢子堆的顏色摻雜有黑色(圖3F)。分生孢子由5個細胞組成，多呈紡錘形，直立或彎曲，中間細胞褐色或黑褐色，頂端無色胞常著生2-5根附屬絲，基部無色胞著生1根中生的柄，一般比頂端附屬絲短而直(圖3G)。分生孢子梗無色，有分枝， 有分隔(圖3H)。經過分類學的形態鑒定，引起楊梅突發性枝葉凋萎病的2類病菌都屬于擬盤多毛抱屬(Pestalotiopsis Steyaert)。實驗6病菌回分離
將室內離體和植株活體發病的枝梢進行常規組織分離，分離方法和材料與同實驗 2。實驗結果再次獲得與接種菌株一致的病原菌，仍然屬于擬盤多毛孢屬真菌。
權利要求
1.一種楊梅突發性枝葉凋萎病病原菌鑒定方法，其特征在于它包括(1)、用解剖刀小心分離發病楊梅枝干的木質部和韌皮部，韌皮部和木質部分別剪成3-4mm2的小塊組織，不需要表面消毒，輕輕放置到PDA平板上，在25°C恒溫箱培養2d后，挑取絨毛狀真菌菌絲，轉接到一個新的PDA平板上，25°C恒溫箱繼續培養5d后，取0. 5cm2的純化菌絲塊用來做致病性接種實驗；( 、在培養皿內平鋪好濾紙，用無菌水浸濕，取新生的楊梅嫩梢，剪成5-6cm 長的短枝，使9cm的培養皿能水平放置2根短枝；每根短枝上撕掉兩個葉片并露出葉痕，用步驟1中獲得的0. 5cm2的純化菌絲塊輕輕放置到露出的葉痕位置，把短枝的兩端用脫脂棉吸水保濕；置于25°C的培養箱內，1 光照和12h黑暗；培養4天后調查楊梅嫩梢的發病情況；如果接種的葉痕位置變黑即為擬盤多毛孢屬致病癥狀。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于該方法還包括在田間進一步的驗證實驗， 包括如下步驟在自然條件下，把步驟1中獲得的適當大小的脫脂棉吸無菌水纏到嫩梢頂端下的第10片葉位置的枝條上，撕掉距楊梅樹嫩梢頂端的第3或4片葉，把0. 5cm2的純化菌絲塊輕輕放置到露出的葉痕位置，用保鮮膜條輕輕固定菌塊，用保鮮袋保濕；接種后4天調查楊梅嫩梢的發病情況；如果接種的葉痕位置變黑即為擬盤多毛孢屬致病癥狀。如果癥狀為然后沿著枝干慢慢延伸，到葉柄位置會沿著葉柄位置延伸到整個葉片變黑更為確定為擬盤多毛孢屬致病癥狀。
全文摘要
本發明提供一種楊梅突發性枝葉凋萎病病原菌鑒定方法，它包括用解剖刀小心分離發病楊梅枝干的木質部和韌皮部，韌皮部和木質部分別剪成小塊組織，不需要表面消毒，放置到PDA平板上，在25℃恒溫箱培養2d后，挑取絨毛狀真菌菌絲，轉接到一個新的PDA平板上，25℃恒溫箱繼續培養5d后，取0.5cm2的純化菌絲塊用來做致病性接種實驗。離體檢測楊梅突發性枝葉凋萎病的病原菌方法可靠，速度快，不需要昂貴的材料，步驟簡單，準確率高。
文檔編號C12Q1/04GK102191182SQ20101053703
公開日2011年9月21日 申請日期2010年11月9日 優先權日2010年11月9日
發明者任海英, 方麗, 李崗, 王漢榮 申請人:浙江省農業科學院