專利名稱：耐高溫轉醛酶及其制備方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物基因工程技術領域的酶及其制備方法，具體是一種耐 高溫轉醛酶及其制備方法。
背景技術：
自從1969年第一個嗜熱菌水生棲熱菌(Thermus aquaticus)從美國黃石國家公園
分離出來至今已有超過70個屬140多種嗜熱菌被陸續發現。1985年第一種嗜熱酶即Taq DNA聚合酶被成功用于DNA聚合酶鏈式反應(PCR)后，嗜熱菌的應用更加引起了全球 科學家們的重視。然而，大多數的嗜熱菌生長條件比較苛刻，需要嚴格厭氧或極端高溫等，生長 速度也較慢，因而通過培養嗜熱菌來分離大量的嗜熱酶顯得困難重重。隨著基因工程 技術的成熟，人們可以通過將嗜熱酶的基因克隆到表達載體上，直接在常溫宿主(如 Escherichia coli)中進行大量表達，且其在常溫宿主中的表達并不會失去它們原有的構 象，熱穩定性及活性，同時還避免了培養條件嚴格等缺陷，使嗜熱酶的大量生產成為可 能。無細胞合成途徑生物轉化是指在體外聚集一些酶及其輔酶用于完成一個復雜的 生化反應。現有很多用于生產液體生物燃料及氣體生物燃料(氫氣)的生物轉化途徑。 其中，穩定的酶是高效率生物轉化的關鍵，而在實際生產過程中，利用嗜熱酶作為生物 催化劑有如下的優點1)酶制劑的制備成本降低。因為嗜熱酶的穩定性高，因而可以在 室溫下分離提純和包裝運輸，并且能長久地保持活性；2)加快了動力學反應。隨著反 應溫度的提高，分子運動速度加快，酶催化能力加強；3)對反應器冷卻系統的要求標準 降低，因而減少了能耗。由于嗜熱酶有耐高溫的特性，所以生產中不需要復雜的冷卻裝 置。一方面節省了開支，另一方面也降低了冷卻過程中對環境所造成的污染；4)提高了 產物的純度。在嗜熱酶催化反應條件下(超過70°C )，很少有雜菌生存，從而減少了細 菌代謝物對產物的污染。因此制備低成本，耐高溫的嗜熱酶對于今后生產廉價的生物燃 料及其他化學品具有重大意義。轉醛酶(tnmsaldolase)是磷酸戊糖途徑中重要的組成部分，可催化轉移景天庚酮 糖-7-磷酸的3個碳單位給甘油醛-3-磷酸形成果糖-6-磷酸，剩余的4個碳單位則轉變 成赤蘚糖-4-磷酸。該酶可用于無細胞合成途徑生物轉化制氫過程及生物工程領域景天 庚酮糖-7-磷酸的制備。海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)是較早發現的極端嗜熱菌之一，其最適生 長溫度為 80"C。Karen E.Nelson 等在 1999 年公布了海棲熱袍菌(Thermotoga maritima) 的基因組序列，隨著基因組序列的公布，多種嗜熱酶被成功從海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)中克隆或分離得到且都保持著較高的最適溫度和熱穩定性。因此考慮在 Escherichia coli中克隆表達來源于嗜熱菌Thermotoga maritima的轉醛酶基因，并考察其嗜 熱性及熱穩定性。
經過對現有技術的檢索發現，目前，已從多種物種如酵母，馬鈴薯，E.coli K12，果蠅等中克隆了轉醛酶(tnmsaldolase)基因并成功進行外源表達。但只有在2004 年報道了一種從嗜熱菌Methanocaldococcus jannaschii中成功克隆表達了嗜熱的轉醛酶，
然而雖然其耐熱性顯著，但活性較低。因此，開發一種耐熱性良好且具有較高活性的轉 醛酶將在工業應用與生化研究領域具有重大意義。
發明內容
本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種耐高溫轉醛酶及其制備方法， 確定了嗜熱及耐高溫的轉醛酶的基因序列和氨基酸序列，熱穩定性良好的耐高溫轉醛 酶。本發明是通過以下技術方案實現的本發明涉及一種嗜熱耐高溫的轉醛酶，其酶蛋白的核苷酸序列如SEQ ID Nal所 示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述的轉醛酶的酶活性pH值為6-10，優選酶活性pH值為10.0 ；所述的轉醛酶的反應方程式為赤蘚糖-4-磷酸+果糖-6-磷酸一景天庚酮 糖-7-磷酸+甘油醛-3-磷酸；所述的轉醛酶的反應體系500 μ 1 50mM磷酸鹽緩沖液(pH 10)反應體系中含 0.6mM果糖-6-磷酸，0.5mM赤蘚糖-4-磷酸，10 μ 1純化酶(lmg/ml)，反應溫度80°C， 反應時間為Imin。本發明涉及上述轉醛酶的制備方法，包括以下步驟第一步、根據上下游引物以海棲熱袍菌全基因組DNA為模板進行擴增得到DNA 片段，將該片段回收后，用NdeI和SalI內切酶進行雙酶切，酶切后連接到經同樣內切酶 酶切的表達質粒載體pET28a上，轉化大腸桿菌E.coli DH5 α，篩選重組質粒，并進行雙 酶切及測序驗證；所述的上下游引物分別為上游5，-GGAATTCCATATGATGAAGATCTTTCTGGAC-3 ‘；下游5，-ACGCGTCGACTTATTTCTTCAGGTTCTC-3,；其中劃線部分為上游引物Nde I酶切位點及下游引物Sal I酶切位點。所述的經同樣內切酶酶切的表達質粒載體pET28a是指用NdeI和SalI內切酶 進行雙酶切后的pET28a質粒。所述的內切酶是指NdeI和SalI限制性內切酶。所述的轉化大腸桿菌E.coli DH5 α具體包括以下步驟從_80°C冰箱中取出 E.coli DH5 α感受態細胞并置于冰上放置，加入待轉化的DNA片段并混勻后冰浴30min ； 然后置于預加溫至42°C的循環水浴中放置90s后快速將其轉移到冰浴中并進一步冷卻1 到2min;最后加入LB培養基并混勻后置于37°C搖床上溫育45min;取溫育后的菌液均 勻涂布于含有50mg/L卡那霉素的固體LB培養基的平板，涂布后倒置放于37°C靜置培養 12-16h后長出菌落。第二步、將重組質粒轉化E.coli BL21培養至OD為0.5-0.8之間時，加入異丙
基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷并繼續培養獲得菌體，再加入Tris-HCl緩沖液并充分攪拌均勻后超聲破碎處理，將得到的破碎液離心后取含有可溶性的含誘導表達的轉醛酶蛋白的 上清，經過鎳柱親和層析后可得到純化的轉醛酶蛋白。所述的加入異丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷并繼續培養獲得菌體是指加 入400mM的異丙基- β -D-硫代吡喃半乳糖苷于37°C繼續培養3h，然后將所得菌液以 4000rpm, 20min離心得菌體。所述的加入Tris-HCl緩沖液是指每IOml菌液離心的菌體中加入Iml的濃度單 位為IOmMTris-HCl緩沖液。所述的超聲破碎處理是指在200W功率下超聲2s后間隔5s并重復超聲40次。上述海棲熱袍菌(Thermotoga maritima Huber et al.)全基因組DNA購自美國典型 微生物菌種保藏中心(American Type Culture Collection) ATCC 43589D-2，http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/ Default.aspx ？ ATCCNum = 43589D~2&Template = bacteria,地址為美國維吉尼亞州馬納 薩斯(Manassas，VA20108USA)；上述轉化大腸桿菌E.C0liDH5a購自天根生化科技北京有限公司，地址北 京市海淀區西小口路66號東升科技園(北領地)C區7號樓3層(100192)，電話 010-59822688。本發明優點在于確定了嗜熱轉醛酶的基因序列和氨基酸序序列；獲得了一種 熱穩定性良好的耐高溫轉醛酶。
圖1是本發明轉醛酶的蛋白質表達電泳照片；其中M.標準蛋白質分子量I.未經過誘導的可溶性細胞提取物S.經過誘導的可 溶性細胞提取物P.經鎳柱親和層析純化的酶蛋白。圖2是本發明轉醛酶的酶活與溫度變化關系曲線。圖3是本發明轉醛酶的酶活與pH變化關系曲線。圖4是本發明轉醛酶在60°C和80°C下的耐熱性曲線。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進 行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的 實施例。實施例1 :嗜熱耐高溫的轉醛酶的制備嗜熱耐高溫的轉醛酶的制備方法，包括菌株、質粒、酶與培養基，PCR擴增及 重組質粒的構建，基因的誘導表達與蛋白質的純化。具體步驟如下第一步、根據上下游引物以Thermotoga maritima全基因組序列為模板進行擴增 得到DNA片段，將該片段回收后，用NdeI和SalI內切酶進行雙酶切，酶切后連接到經同 樣內切酶酶切的表達質粒載體pET28a上，轉化大腸桿菌E.coli DH5 α，篩選重組質粒， 并進行雙酶切及測序驗證。所述的上下游引物分別為
上游5，-GGAATTCCATATGATGAAGATCTTTCTGGAC-3 ‘下游5，-ACGCGTCGACTTATTTCTTCAGGTTCTC-3,；其中劃線部分為上游引物Nde I酶切位點及下游引物Sal I酶切位點。所述的經同樣內切酶酶切的表達質粒載體pET28a是指用NdeI和SalI內切酶 進行雙酶切后的pET28a質粒。所述的內切酶是指NdeI和SalI限制性內切酶。所述的轉化大腸桿菌的具體步驟參數為從-80°C冰箱中取出E.coli DH5 α感 受態細胞(ΙΟΟμΙ)，并置于冰上放置，將要轉化的DNA片段加入，小心混勻并冰浴 30min。將管放入預加溫至42°C的循環水浴中，放置90s后快速將其轉移到冰浴中，冷卻 1至Ij2min。在管中加入800 μ 1 LB培養基，混勻后，置于37°C搖床上溫育45min (轉速為 220轉/分鐘)。取100 μ 1菌體均勻涂布于含有50mg/L卡那霉素的固體LB培養基的平 板，涂布后倒置放于37°C靜置培養12-16h后長出菌落。第二步、將重組質粒轉化E.coli BL21培養至OD為0.5-0.8之間時，加入400mM IPTG于37 0C繼續培養3h，將所得菌液以4000rpm，20min離心得菌體，加入IOmM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)(每IOml菌液離心的菌體中加入約Iml緩沖液)充分攪拌均勻后 超聲破碎(功率200W，超聲2s，間隔5s，次數40次)，破碎液于12000rpm離心20min 后取上清，上清中為可溶性的蛋白(含誘導表達的轉醛酶蛋白)，經過鎳柱親和層析后可 得到純化的轉醛酶蛋白。實施例2 轉醛酶的基本酶學性質酶反應方程式為赤蘚糖-4-磷酸+果糖-6-磷酸一景天庚酮糖-7-磷酸+甘油醛-3-磷酸酶反應體系500μ1，50mM磷酸鹽緩沖液(pH 10)反應體系中含0.6mM果 糖-6-磷酸，0.5mM赤蘚糖-4-磷酸，IOyl純化酶，反應溫度80°C，反應時間為lmin。通過對轉醛酶進行分析鑒定，得到該酶的主要以下酶學性質如下(1)得到的純化的轉醛酶蛋白電泳圖如圖1所示。(2)該酶的最適溫度為80°C (如圖2所示)(3)該酶具有較寬泛的最適pH，在pH 6-10的范圍內具有很高的酶活，最適酶活 pH為10.0 (如圖3所示)(4)該酶在實驗條件下，Kcat為44.32s—1，Km(果糖_6_磷酸)和Km(赤蘚 糖-4-磷酸)分別為0.51mM和0.32mM。實施例3 轉醛酶的熱穩定性分析熱穩定性分析方法將配制好的轉醛酶溶液(lmg/ml)分別放置在60°C和80°C 的水浴鍋中，在0-48h之間，測定其在放置了 0，0.5，1，2，4，8，12，24，48h時的剩 余酶活。測定酶活的方法同實施例3。通過對該轉醛酶的熱穩定性分析鑒定，得到如下結果該酶具有較高的熱穩定性，在60°C和80°C放置48h后，酶活力分別為初始酶活 的80%，10%。此時的活性仍高達33.53U/mg和3.94U/mg。其中，酶活lU/mg代表每mg蛋白每分鐘可以轉化的底物1 μ moL2004年報道了一種從嗜熱菌Methanocaldococcus jannaschii中成功克隆表達了嗜熱的轉醛酶，它在80°C放置4h，或在25°C放置3星期后活性都并未降低，然而雖然其耐 熱性顯著，但純化后的該酶的活性僅為l.lU/mg(測定溫度為25°C)。且該文獻中由于其 酶活測定方法的限制，也未能給出轉醛酶的酶活與溫度變化之間的關系。
本實施例不僅僅提供了一種新的嗜熱的轉醛酶的制備方法且考察了其嗜熱性， 耐熱性等相關酶學性質。其顯著的嗜熱及耐熱性顯示其將在工業應用與生化研究領域如 無細胞合成途徑生物轉化制氫過程及生物工程領域景天庚酮糖-7-磷酸的制備等方面具 有潛在應用價值。
權利要求
1.一種嗜熱耐高溫的轉醛酶，其特征在于，其酶蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNal所 示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根據權利要求1所述的嗜熱耐高溫的轉醛酶，其特征是，所述的轉醛酶的酶活性 pH 值為 6-10。
3.—種根據權利要求1所述轉醛酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟第一步、根據上下游引物以海棲熱袍菌的全基因組序列為模板進行擴增得到DNA片 段，將該片段回收后，用NdeI和SalI內切酶進行雙酶切，酶切后連接到經同樣內切酶酶 切的表達質粒載體pET28a上，轉化大腸桿菌E.coli DH5 α，篩選重組質粒，并進行雙酶 切及測序驗證；第二步、將重組質粒轉化E.coliBL21培養至OD為0.5-0.8之間時，加入異丙 基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷并繼續培養獲得菌體，再加入Tris-HCl緩沖液并充分攪拌均 勻后超聲破碎處理，將得到的破碎液離心后取含有可溶性的含誘導表達的轉醛酶蛋白的 上清，經過鎳柱親和層析后可得到純化的轉醛酶蛋白。
4.根據權利要求3所述的轉醛酶的制備方法，其特征是，所述的上下游引物分別為上游 5，-GGAATTCCATATGATGAAGATCTTTCTGGAC-3 ‘；下游 5' -ACGCGTCGACTTATTTCTTCAGGTTCTC-3，；其中劃線部分為上游引物Nde I酶切位點及下游引物Sal I酶切位點。
5.根據權利要求3所述的轉醛酶的制備方法，其特征是，所述的經同樣內切酶酶切的 表達質粒載體pET28a是指用NdeI和SalI內切酶進行雙酶切后的pET28a質粒。
6.根據權利要求3或5所述的轉醛酶的制備方法，其特征是，所述的內切酶是指 NdeI和SalI限制性內切酶。
7.根據權利要求3所述的轉醛酶的制備方法，其特征是，所述的轉化大腸桿菌E.coli DH5a具體包括以下步驟從-80°C冰箱中取出E.C0liDH5a感受態細胞并置于冰上放 置，加入待轉化的DNA片段并混勻后冰浴30min;然后置于預加溫至42°C的循環水浴中 放置90s后快速將其轉移到冰浴中并進一步冷卻1到2min ；最后加入LB培養基并混勻 后置于37°C搖床上溫育45min ；取溫育后的菌液均勻涂布于含有50mg/L卡那霉素的固體 LB培養基的平板，涂布后倒置放于37°C靜置培養12-16h后長出菌落。
8.根據權利要求3所述的轉醛酶的制備方法，其特征是，所述的加入異丙 基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷并繼續培養獲得菌體是指加入4001^的異丙基-0"0-硫 代吡喃半乳糖苷于37°C繼續培養3h，然后將所得菌液以4000rpm，20min離心得菌體。
9.根據權利要求3所述的轉醛酶的制備方法，其特征是，所述的加入Tris-HCl緩沖液 是指每IOml菌液離心的菌體中加入Iml的濃度單位為IOmM Tris-HCl緩沖液。
10.根據權利要求3所述的轉醛酶的制備方法，其特征是，所述的超聲破碎處理是 指在200W功率下超聲2s后間隔5s并重復超聲40次。
全文摘要
一種生物基因工程技術領域的耐高溫轉醛酶及其制備方法，其酶蛋白的核苷酸序列如SEQID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，該轉醛酶通過根據上下游引物以海棲熱袍菌的全基因組序列為模板進行擴增得到DNA片段，將該片段回收后，用NdeI和SalI內切酶進行雙酶切，酶切后連接到經同樣內切酶酶切的表達質粒載體pET28a上，轉化大腸桿菌E.coliDH5α，篩選重組質粒并轉化E.coli BL21培養至OD為0.5-0.8之間時，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷并繼續培養獲得菌體，再加入Tris-HCl緩沖液并充分攪拌均勻后超聲破碎處理，將得到的破碎液離心后取含有可溶性的含誘導表達的轉醛酶蛋白的上清，經過鎳柱親和層析后可得到純化的轉醛酶蛋白。
文檔編號C12N15/54GK102010853SQ20101053306
公開日2011年4月13日 申請日期2010年11月5日 優先權日2010年11月5日
發明者張以恒, 鐘建江, 黃松燕 申請人:上海交通大學