專利名稱：一株具有解磷作用的枯草芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及枯草芽孢桿菌新菌株及其應用，特別是涉及一株具有解磷作用的枯草 芽孢桿菌(Bacillus subtilis)XF-8及應用此菌產生中性植酸酶的方法。
背景技術：
磷是動植物生長的必需元素，在生命活動過程中發揮著重要的作用。土壤中的磷 大部分以植酸態、核酸、磷脂態等有機磷形式存在，不能被植物直接吸收利用，并且作為磷 肥原料來源的磷礦石地下儲存量非常有限，這將使磷成為制約現代農業可持續發展的一個 重要因素。另一方面，水產養殖業中，魚類飼料中40 70%的磷也以植酸態形式存在，因 魚類消化道內缺乏水解植酸磷的酶類，磷大部分隨糞便排出，不但不能充分利用飼料中的 磷源，而且造成嚴重的水體磷污染。因此，急需解磷菌產生出酶類物質將有機磷轉化成生 物體易于吸收的磷。植酸酶就可以催化植酸及植酸鹽水解成低磷酸化的肌醇衍生物和磷 酸(或磷酸鹽)，提高磷和其它微量元素的生物利用率。但目前大多植酸酶都屬酸性植酸 酶(pH2.5 5.5)。因此，研究開發新的菌株，使其能產生中性植酸酶，有效pH作用范圍在 6. 5 7. 5之間，能夠提高中性條件下的解磷效果，應用于磷細菌肥料和魚類(消化道呈 中性)飼料的開發，提高土壤或飼料中磷的利用率，改善土壤及水體生態環境，具有重要意 義。
發明內容
本發明的目的之一是提供一株能產生中性植酸酶的具有解磷作用的枯草芽孢桿 菌(Bacillus subtilis)XF-8。本發明的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)XF_8分離自山東省濟寧市田間土 壤，在篩選平板上產生水解圈，菌落邊緣整起，濕潤，革蘭氏陽性，并結合16SrDNA和BIOLOG 微生物鑒定系統進行鑒定，確定該菌株為枯草芽孢桿菌，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)XF-8。該菌已于2010年7月16日保藏在中國武漢大學的中國典型培養物保藏 中心，保藏編號為=CCTCC NO =M 2010182。本發明的第二個目的是提供利用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)XF-8 CCTCC NO =M 2010182產生中性植酸酶的方法。為實現這目的，本發明采取以下技術方案菌種接至LB培養基，30°C振蕩培養過 夜，以1 5%接種量接種于產酶培養基中，pH 5. 5 7. 5，25 37°C振蕩培養2 4天。 4°C，5000rpm，離心15min，取上清，得到中性植酸酶粗酶；稀釋10倍后，測定發酵液的酶活。利用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)XF-8CCTCC NO :M 2010182發酵產生植酸 酶的培養基碳源為麥麩，氮源為酪蛋白胨和(NH4)2SO4,其中的酪蛋白胨有利于誘導植酸酶 的產生。由本發明所得到的中性植酸酶具有良好的熱穩定性，其pH作用范圍在6. 5 7. 5 之間，可以有效彌補酸性植酸酶的不足，能夠應用于魚類飼料開發，降低水體中磷的污染； 還能用于研制生物菌肥，有效利用土壤中有機磷，減少磷肥施用量，改善土壤微環境，提高 農產品的品質。
具體實施例方式
圖1為植酸酶標準曲線。在下面的實施例中所用菌種均為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) XF-8CCTCCN0 =M 2010182，實施例中不同培養基及溶液配方如下1.LB 培養基:1000ml 水，10. Og 蛋白胨，5. Og 酵母浸粉，5. OgNaCl，pH 7.0-7.2。2.蹄選培養基1000ml 水，20. OOg葡萄糖，2. OOg CaCl2, 5. OOg NH4NO3,0. 50g KCl, 0. 50g · MgSO4 · 7Η20，0· Olg FeSO4 · 7Η20，0· Olg MnSO4, 3. OOg 植酸鈣，15. OOg 瓊脂。3.產酶培養基稱取IOOg麥麩加入900ml H2O中，121°C下60min，6層紗布過濾，濾 液定容至 1L，加入 0. 4g (NH4)2SO4jO. 2g MgSO4 · 7H20，0. 5g KH2PO4,0. 4g K2HPO4, 2. Og CaCl2, 10. Og酪蛋白胨。4.酶活測定溶液酶稀釋液2mmol/LCaCl2, 50mmol/L Tris-HCl, ρΗ 7·0，10%甘油；底物溶液2mmol/L植酸鈉(lOOmmol/LTris-HCl ρΗ 7. 0,2mmol/L CaCl2)終止液20%三氯乙酸(TCA)；硫酸亞鐵 硫酸銨顯色液[(1. 5%鉬酸銨5. 5%硫酸)(2. 7%硫酸亞鐵)= 4 1，ν/ν]1. 5g鉬酸銨溶于水，加入98%濃硫酸5. 6mL，定容至IOOmL ；0. 68g硫酸亞鐵溶于 25mL水，兩部分混勻，存放于4°C。5.磷標準液(用于計算直線回歸方程)A、50mM磷酸鹽母液1. 3609g ΚΗ2Ρ04(干燥)溶于200ml重蒸水中(定容)。B、磷標準液將母液按一定比例，分別稀釋成0. 2mM,0. 4mM,0. 8mM, 1. 6mM, 3. 2mM
的工作液。實施例1、分離鑒定枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)XF-8，CCTCC NO :M2010182實驗材料來自山東省濟寧市田間土壤。具體實施步驟如下在無菌操作下，稱取1. Og 土樣溶于9ml無菌生理鹽水中，充 分振蕩后，置于85°C水浴鍋中15min，并梯度稀釋后，涂布于已制好的篩選平板上。倒放于 28 30°C恒溫箱中培養2 3天，用接種針挑起有透明圈的菌落，進一步分離、純化。再 將菌株接于產酶培養基中，進行復篩，以確定產植酸酶的菌株。經過革蘭氏染色、16S rDNA 基因序列分析及BIOLOG鑒定確定該菌株為枯草芽孢桿菌，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) XF-8，經保藏編號為CCTCC NO :M 2010182。實施例2、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)XF-8,CCTCC NO :M 2010182 的產酶
培養實驗1采用產酶培養基，具體步驟如下菌種接至LB培養基，30°C振蕩培養過夜，以 1.0%接種量接種于產酶培養基中，25°C，pH 5. 5，160rpm振蕩培養2天。4°C，5000rpm，離 心15min，取上清，得到中性植酸酶粗酶；稀釋10倍后，測定發酵液的酶活。磷標準曲線的繪制采用溶液4、5制作磷標準曲線。具體步驟如下用不同濃度的磷標準溶液250 μ 1 加入Iml底物溶液，37°C水浴30min后，加入1. 25ml終止液；對照組為250 μ 1雙蒸水中加 入1. 25ml終止液，37°C水浴30min后，加入Iml底物溶液，實驗組和對照組均加入2. 5ml顯色液，生成磷鉬酸鹽在700nm下測定OD值。得到的磷標準曲線如說明書附圖1所示。枯草芽孢桿菌(Bacillussubti 1 is)XF-8，CCTCC NO :M2010182產生的中性植酸酶 酶活測定酶活定義為在pH 7.0時，每分鐘釋放1 μ M磷所需的酶的量。將樣品用緩沖液做適當稀釋后，取250 μ 1酶液加入Iml底物溶液，37°C水浴30min 后，加入1. 25ml終止液，終止酶反應；對照組250 μ 1酶液加入1. 25ml終止液終止酶反應， 37°C水浴30min后，加入Iml底物溶液，實驗組和對照組均加入2. 5ml顯色液，生成磷鉬酸 鹽在700nm下測定OD值。根據標準曲線所得方程及酶活定義代入酶活計算公式酶活性(U/ml)= (1. 8149x-0. 0166) X4Xn/tχ :0D700 的值；4 250 μ 1稀釋酶液中的酶活換算成Iml酶液的酶活；η 酶液稀釋倍數；t 反應時間計算枯草芽孢桿菌(Bacillus subti lis) XF-8的中性植酸酶酶活為0. 32U/ml。實施例3、枯草芽孢桿菌(Bacillus subti lis) XF-8, CCTCC NO :M2010182 的產酶 培養實驗1采用產酶培養基，具體步驟如下菌種接至LB培養基，30°C振蕩培養過夜，以 2. 5%接種量接種于產酶培養基中，30°C，pH 6. 5，160rpm振蕩培養3天，4°C，5000rpm，離心 15min，取上清，得到中性植酸酶粗酶；稀釋10倍后，測定發酵液的酶活。磷標準曲線的繪制和中性植酸酶酶活測定方法同實施例2。根據標準曲線所得方程及酶活定義計算枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)XF-8 的中性植酸酶酶活為0. 51U/ml。實施例4、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)XF-8, CCTCC NO :M2010182 的產酶
培養實驗3采用產酶培養基，具體步驟如下菌種接至LB培養基，30°C振蕩培養過夜，以 5.0%接種量接種于產酶培養基中，37°C，pH 7. 5，160rpm振蕩培養4天。4°C，5000rpm，離 心15min，取上清，得到中性植酸酶粗酶；稀釋10倍后，測定發酵液的酶活。磷標準曲線的繪制和中性植酸酶酶活測定方法同實施例2。根據標準曲線所得方程及酶活定義計算枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)XF-8 的中性植酸酶酶活為0. 40U/ml。
權利要求
1.一株具有解磷作用的枯草芽孢桿菌(Bacillus subti 1 is) XF-8, CCTCC NO: M2010182。
2.利用枯草芽孢桿菌(Bacillussubti lis) XF-8, CCTCC NO :M2010182產生中性植酸 酶的方法，其特征在于包括如下步驟菌種接至LB培養基，30°C振蕩培養過夜，以1 5% 接種量接種于產酶培養基中，pH 5. 5 7. 5，25 37°C振蕩培養2 4天；4°C，5000rpm,離 心15min，取上清，得到中性植酸酶粗酶；稀釋10倍后，測定發酵液的酶活；其中產酶培養基 的碳源為麥麩，氮源為酪蛋白胨和(NH4)2S04。
全文摘要
本發明公開了一株具有解磷作用的枯草芽孢桿菌及其應用。涉及一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)XF-8，CCTCC NOM2010182以及利用該菌產生中性植酸酶的方法。菌種接至LB培養基，30℃振蕩培養過夜，以1～5％接種量接種于產酶培養基中，pH 5.5～7.5，25～37℃振蕩培養2～4天；4℃，5000rpm，離心15min，取上清，得到中性植酸酶粗酶；稀釋10倍后，測定發酵液的酶活；其中產酶培養基的碳源為麥麩，氮源為酪蛋白胨和(NH4)2SO4。該菌產生的中性植酸酶在pH 7.0時具有很高的酶活；能夠應用于魚類飼料開發，降低水體中磷的污染；還能用于研制生物菌肥，有效利用土壤中有機磷，減少磷肥施用量，改善土壤微環境，提高農產品的品質。
文檔編號C12R1/125GK102061273SQ201010532768
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月5日 優先權日2010年11月5日
發明者孫秀梅, 宋存江, 張偉, 曹名鋒, 李保賓, 李強, 王淑芳, 耿偉濤, 蘇文萍 申請人:南開大學