專利名稱：一種橡膠樹白粉病菌離體培養方法及其培養基的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物病理技術領域，尤其是涉及一種橡膠樹白粉病菌離體培養方法及
其培養基。
背景技術：
橡膠樹白粉病是由橡膠樹粉孢屬(oidium heveae B. A. Steinm)真菌侵染引起的 巴西橡膠樹最重要葉部病害之一，自從1918年在印度尼西亞爪哇首次發現以來，迄今已遍 布全球各橡膠種植區。發病嚴重時，白粉病引起橡膠樹落葉、落花，使膠乳減產、橡膠樹生勢 衰弱，新梢枯死，對橡膠樹生長和產量影響非常大。橡膠樹白粉病作為一種氣候病害，主要在春季氣候冷涼、陰濕的條件下爆發流行， 且橡膠樹白粉菌屬于專性寄生菌，在人工配制的培養基上不能生長，只能在鮮活的植物組 織材料上培養和保存。研究所需的橡膠樹白粉病材料，只有在春季白粉病爆發時從大田中 采集。因此，橡膠樹白粉病存在受自然條件影響大、存在時間短、不容易控制保存等缺陷，給 研究帶來不便。在橡膠樹白粉病的病害鑒定、抗病育種等實驗研究中，人工培養和保存橡膠樹白 粉病的方法主要是在保證溫濕度的條件下，將橡膠樹白粉病孢子接種在橡膠樹袋裝苗的幼 嫩葉片上，使其發病保存。但袋裝苗保存法存在占地面積較大，可使用的幼嫩葉片較少等缺 點，很難達到試驗需求。
發明內容
本發明提供一種簡便、長期高效、規模較大的橡膠樹白粉病菌培養保存的方法，利 用保鮮營養液使橡膠樹葉片保持較長時間生活力，實現了橡膠樹白粉病菌在葉片上的離體 培養，解決了橡膠樹白粉病菌的培養和保存問題。為實現上述目的，本發明采用如下技術方案—種橡膠樹白粉病菌離體培養方法，包括步驟A)營養液和培養盤準備Al、配制營養液氯化鈣100 200mg/L、6-芐氨基嘌呤5 10mg/L、水楊酸10 80mg/L、維生素C 0. 2 0. 8mg/L、硫代硫酸鈉0. 2 0. 8g/L、活性炭1 5g/L、0. 2倍MS 培養基大量元素，所述0. 2倍MS培養基大量元素包括硝酸銨3. 3g/L、硝酸鉀3. 8g/L、二水 氯化鈣0. 88g/L、七水硫酸鎂0. 74g/L、磷酸二氫鉀0. 34g/L ；A2、在無菌培養盤中裝入過40目或以下細篩的細沙，以不超過沙面的無菌水保持 細沙濕潤，將PCR板置于沙中，用移液槍轉營養液入PCR板孔內；B)離體葉片準備Bi、選擇橡膠樹處于變色期的幼嫩葉片；B2、將采集的新鮮橡膠樹葉片用無菌水沖洗二至三遍后，在0. 3-0. 5%次氯酸鈉溶 液中浸泡3-5分鐘，再用無菌水沖洗二至三遍，浙干；
C)將處理后的離體葉片插入裝有營養液的PCR板孔內，用在75%酒精中消毒晾 干后毛筆或毛刷輕刷感病橡膠樹葉片上的白粉病菌至經過營養液處理的離體葉片上，置于 23°C、濕度為90%的人工氣候箱中，每天進行16小時光培養，8小時暗培養。本發明目的之二在于提供一種用于橡膠樹白粉病菌離體培養的培養基，包括氯化鈣100 200mg/L、6-芐氨基嘌呤5 10mg/L、水楊酸10 80mg/L、維生素 C 0. 2 0. 8mg/L、硫代硫酸鈉0. 2 0. 8g/L、活性炭1 5g/L、0. 2倍MS培養基大量元素 (硝酸銨3. 3g/L、硝酸鉀3. 8g/L、二水氯化鈣0. 88g/L、七水硫酸鎂0. 74g/L、磷酸二氫鉀 0. 34g/L)。本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果本發明通過大量的探索研究，配置出能使橡膠樹離體葉片保持較長時間生活力的 保鮮營養液(培養基)，通過6-芐氨基嘌呤、水楊酸、維生素C與0. 2倍MS培養基大量元素 協同作用，模擬橡膠樹白粉病菌最佳生長環境，實現了橡膠樹白粉病菌在葉片上的離體培 養，解決了橡膠樹白粉病菌的培養和保存問題。本發明所述方法簡單，操作方便，占用空間 小，通過橡膠樹離體葉片進行白粉病菌培養，能在短期內繁殖出大量的白粉病菌用于橡膠 樹種質資源的人工接種，解決橡膠樹白粉病抗性鑒定的重要問題，并促進橡膠樹白粉病形 態學、生物學和分子生物學的研究，為即時、高效地開展橡膠樹白粉病菌研究奠定了基礎。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。1、離體葉片準備A、選擇橡膠樹處于變色期的幼嫩葉片；B、將采集的新鮮橡膠樹葉片用無菌水沖洗三遍后，在0. 5%次氯酸鈉溶液中浸泡 5分鐘，再用無菌水沖洗三遍，浙干；2、菌種選擇選擇橡膠樹病葉上新鮮的橡膠樹白粉病無性分生孢子；3、營養液和培養盤準備A、采用如下配方配制營養液氯化鈣100 200mg/L、6-芐氨基嘌呤5 10mg/L、 水楊酸10 80mg/L、維生素C 0. 2 0. 8mg/L、硫代硫酸鈉0. 2 0. 8g/L、活性炭1 5g/ L、0. 2倍MS培養基大量元素(硝酸銨3. 3g/L、硝酸鉀3. 8g/L、二水氯化鈣0. 88g/L、七水硫 酸鎂0. 74g/L、磷酸二氫鉀0. 34g/L)；B、在白磁盤中裝入過40目篩的細沙，以不超過沙面的無菌水保持細沙濕潤，將 PCR板置于沙中，用移液槍轉營養液入PCR板孔內；4、接種培養將處理后的離體葉片插入裝有營養液的PCR板孔內，毛筆在75%酒精中消毒晾干 后，輕刷感病橡膠樹葉片上的白粉病菌于經過營養液處理的離體葉片上，置于23°C、濕度為 90%的人工氣候箱中，每天進行16小時光培養，8小時暗培養。本實施例所述橡膠樹白粉病菌離體培養方法1、實現了白粉病菌離體培養，可快速、長期培養保存橡膠樹白粉病菌。橡膠樹白粉 病菌是一種專性寄生菌，只能寄生在鮮活的橡膠樹嫩葉、嫩芽、嫩梢和花序上，且生長條件 嚴格，在自然界中常常因為溫度、濕度和橡膠樹物候期等原因很難獲得大量的橡膠樹白粉病病菌。本方法克服了橡膠樹白粉病病害研究受氣候、物候等外部條件制約的困難，可以長 期、快捷地培養可用于研究的橡膠樹白粉病病菌。 2、實現了白粉病菌的規模化培養。本方法操作簡單，占用空間小，采集巴西橡膠樹 嫩葉，利用人工培養箱短期就可繁殖出大量白粉病菌，如此規模化的病菌離體培養是進行 橡膠樹白粉病研究的有效手段。
權利要求
1.一種橡膠樹白粉病菌離體培養方法，包括步驟A)營養液和培養盤準備Al、配制營養液氯化鈣100 200mg/L、6-芐氨基嘌呤5 10mg/L、水楊酸10 80mg/ L、維生素C 0. 2 0. 8mg/L、硫代硫酸鈉0. 2 0. 8g/L、活性炭1 5g/L、0. 2倍MS培養基 大量元素(硝酸銨3. 3g/L、硝酸鉀3. 8g/L、二水氯化鈣0. 88g/L、七水硫酸鎂0. 74g/L、磷酸 二氫鉀 0. 34g/L)；A2、在無菌培養盤中裝入過40目或以下細篩的細沙，以不超過沙面的無菌水保持細沙 濕潤，將PCR板置于沙中，用移液槍轉營養液入PCR板孔內；B)離體葉片準備Bi、選擇橡膠樹處于變色期的幼嫩葉片；B2、將采集的新鮮橡膠樹葉片用無菌水沖洗二至三遍后，在0. 3-0. 5%次氯酸鈉溶液中 浸泡3-5分鐘，再用無菌水沖洗二至三遍，浙干；C)將處理后的離體葉片插入裝有營養液的PCR板孔內，用在75%酒精中消毒晾干后毛 筆或毛刷輕刷感病橡膠樹葉片上的白粉病菌至經過營養液處理的離體葉片上，置于23°C、 濕度為90%的人工氣候箱中，每天進行16小時光培養，8小時暗培養。
2.一種用于橡膠樹白粉病菌離體培養的培養基，包括氯化鈣100 200mg/L、6-芐氨基嘌呤5 10mg/L、水楊酸10 80mg/L、維生素C 0. 2 0. 8mg/L、硫代硫酸鈉0. 2 0. 8g/L、活性炭1 5g/L、0. 2倍MS培養基大量元素，所 述0. 2倍MS培養基大量元素包括硝酸銨3. 3g/L、硝酸鉀3. 8g/L、二水氯化鈣0. 88g/L、七 水硫酸鎂0. 74g/L、磷酸二氫鉀0. 34g/L。
全文摘要
本發明公開了一種橡膠樹白粉病菌離體培養方法及其培養基，屬于植物病理技術領域。本發明所述的橡膠樹白粉病菌離體培養方法，包括步驟A)營養液和培養盤準備B)離體葉片準備C)將處理后的離體葉片插入裝有營養液的PCR板孔內，用在75％酒精中消毒晾干后毛筆或毛刷輕刷感病橡膠樹葉片上的白粉病菌至經過營養液處理的離體葉片上，置于23℃、濕度為90％的人工氣候箱中，每天進行16小時光培養，8小時暗培養。本發明所述的橡膠樹白粉病菌離體培養方法簡便、長期高效，能大規模培養橡膠樹白粉病菌，實現了橡膠樹白粉病菌在葉片上的離體培養，解決了橡膠樹白粉病菌的培養和保存問題。
文檔編號C12R1/645GK102002464SQ201010531470
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月3日 優先權日2010年11月3日
發明者華玉偉, 涂敏, 蔡海濱, 黃華孫 申請人:中國熱帶農業科學院橡膠研究所