專利名稱：與植物耐逆性相關蛋白ZmFBL2及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種與植物耐逆性相關蛋白ZmFBL2及其編碼基因與應用。
背景技術：
全世界有3. 8億公頃鹽堿土地。在我國耕地中有10%為鹽漬化土壤，嚴重影響著現代農業的發展。在人口不斷增長的今天，擴大可耕種土地面積，提高耕地單位面積產量以解決糧食問題已經成為亟待解決的問題。與利用工程手段改變環境以適應植物的需要相比，運用生物手段改變植物本身，使之適應環境是更為積極主動且長期有效的措施。因此， 植物基因工程研究已經成為改良作物、提高產量的重要手段，因而克隆獲得抗鹽性較好的基因已經成為植物基因工程研究的重心。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種與植物耐逆性相關蛋白ZmFBL2及其編碼基因。本發明所提供的蛋白質，名稱為ZmFBL2，人工合成，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由1)衍生的蛋白質。上述序列表中序列2由368個氨基酸殘基組成。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述與植物耐逆性相關的蛋白的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。所述編碼基因為如下1)或2)或3)或4)所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5’末端第64-1170位核苷酸所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交且編碼所述與植物耐逆性相關蛋白質的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98% 或至少具有99%同源性且編碼所述與植物耐逆性相關蛋白質的DNA分子。其中，序列表中序列1由12 位脫氧核糖核苷酸組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'末端第64-1170位堿基。所述嚴格條件也可為在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65 °C下雜交，然后用 2 XSSC,0. 1% SDS 和 1XSSC，0. 1% SDS 各洗膜一次。含有上述蛋白編碼基因的重組表達載體、重組菌、轉基因細胞系或表達盒也屬于本發明的保護范圍。所述重組表達載體具體為在pCAMBIA3301的Bgl II和Riil I位點間插入所述編碼基因得到的 pCAMBIA3301-ZmFBL2。
擴增上述任一所述編碼基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。引物對中的一條引物為序列表中序列3所示的DNA分子，另一條引物為序列表中序列 4所示的DNA分子。本發明的另一個目的是提供培育耐逆性提高的轉基因植物的方法。本發明所提供的方法，是將所述的編碼基因導入目的植物得到的轉基因植物，所述轉基因植物的耐逆性高于所述目的植物。所述耐逆性為耐鹽性。所述編碼基因是通過所述重組表達載體導入所述目的植物中。所述植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物優選為擬南芥。本發明的實驗證明，用克隆的方法得到ZmFBL2基因，將其導入擬南芥中得到的轉基因擬南芥，與野生型擬南芥相比，轉基因擬南芥的耐逆性高于野生型擬南芥，耐逆性表現在耐鹽性。本實驗得到的ZmFBL2基因和轉基因擬南芥在植物遺傳育種方面有重要的意義。
圖1為重組質粒表達載體圖2為菌液PCR鑒定轉化pCAMBIA3301-ZmFBL2的GV3101陽性克隆圖3為T3代擬南芥過表達株系的PCR鑒定圖4為150mM NaCl條件下野生型擬南芥及過表達株系存活情況圖5為150mM NaCl條件下野生型擬南芥及過表達株系的存活率
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、ZmFBL2的獲得提取玉米(CN165，Zea mays L.)的RNA，逆轉錄獲得cDNA，用正向引物 5 ‘ -CTGTCGTCTTATGTAAGCTGCC-3 ‘和反向引物 RP 5 ‘ -CCCCCAGGCATGCGTCCCCATTCG-3 ‘， 進行PCR擴增，得到PCR產物；也可人工合成序列1，用正向引物5' -CTGTCGTCTTATGTAAGCTGCC-3'和反向弓丨物 RP :5 ‘ -CCCCCAGGCATGCGTCCCCATTCG-3 ‘進行 PCR 擴增，同樣得到 PCR 產物。將該步驟獲得的PCR產物連接至pMD18-T (Takara)，轉化大腸桿菌ToplO (天根生化科技北京有限公司)，進行測序，結果為該PCR產物具有序列表中序列1自5'末端第 1-12 位核苷酸，該PCR產物的基因命名為ZmFBL2，該基因的編碼區為序列表中序列1的自5'末端第64-1170位核苷酸，該基因編碼的蛋白命名為ZmFBL2，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。序列1由12 個核苷酸組成，序列2由368個氨基酸組成。實施例2、轉ZmFBL2擬南芥的獲得及功能研究一、轉ZmFBL2擬南芥的獲得1、表達載體構建及PCR分子檢測將實施例1得到的PCR產物經BglII和Riil I雙酶切得到的片段與經過同樣酶切得到的 PCAMBIA3301 (以下簡稱 p3301，Canberra, Australia,，Zhao J.，Sun Ζ.，Zheng J. , Guo Χ. , Dong Ζ. , Huai J. , Gou Μ. , He J. , Y. Jin, Wang J. and Wang G., Cloning and characterization of a novel CBL-interacting protein kinase from maize, Plant Mol Biol 69(2009) :661-674.，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。)載體大片段連接，得到的連接產物轉化大腸桿菌感受態ToplO，得到轉化子，提取轉化子的質粒經過PCR鑒定，正向引物5 ‘ -TGGTCATCGTGGCGTCTGGTGT-3 ‘，反向引物 5 ‘ -AACCGCACAAGTCTACGGCTCTG-3，得到555bp的片段為PCR陽性克隆，經陽性質粒送去測序，結果為該質粒為將序列表中序列1自5'末端第1-12 位核苷酸位核苷酸插入到 PCAMBIA3301載體(以下簡稱p3301)的Bgl II和Riil I酶切位點得到的載體，命名為 pCAMBIA3301-ZmFBL2(結構示意圖如圖 1 所示)。且 pCAMBIA3301_ZmFBL2 中 ZmFBL2 的編碼區位于啟動子CaMV35S下游，為植物超表達載體。2、GV3101/pCAMBIA3301-ZmFBL2 的獲得將上述pCAMBIA3301-ZmFBL2 轉入根癌農桿菌 GV3101(Zhao J. , Sun Ζ. , Zheng J. , Guo Χ. , Dong Ζ. , Huai J. , Gou Μ. , He J. , Y. Jin, Wang J. and Wang G. . (2009) Cloning and characterization of a novel CBL-interacting protein kinase from maize, Plant Molecular Biology，69 :661-674.，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。)中，在含有lOOyg/ml Kan和125μβ/πι1 Rif的YEB平板篩選， 得到的轉化子，進行菌液PCR鑒定，正向引物5 ‘ -TGGTCATCGTGGCGTCTGGTGT-3 ‘， 反向引物5 ‘ -AACCGCACAAGTCTACGGCTCTG-3，結果如圖2所示，+為陽性對照 pCAMBIA3301-ZmFBL2,-為水，得到55^ρ的片段為PCR陽性克隆，將PCR鑒定陽性克隆提取質粒，送去測序，結果為該質粒為pCAMBIA3301-ZmFBL2，含有該質粒的陽性克隆命名為 GV3101/pCAMBIA3301-ZmFBL2。常用培養基和溶液的配制YEB液體培養基(IL)酵母提取物Ig牛肉膏5g蛋白胨5g蔗糖5gMgSO4. 7H200. 5g加蒸餾水定容至1L，調PH至7. 0，高壓滅菌。YEB固體培養基每升液體培養基中加入15g瓊脂粉，高壓滅菌。含有抗生素的YEB培養基在高壓滅菌后的YEB培養基中，當溫度降至50°C左右時加入所需抗生素(100mg/L 的 Rif，100mg/L 的 Kan)，搖勻。3、轉ZmFBL2擬南芥的獲得及分子檢測(1)轉化擬南芥將GV3101/pCAMBIA3301-ZmFBL2菌株擴大培養，用蘸花法轉化野生型擬南芥 Columbia(Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia) (Clough, S. J. , and Bent, A.F. (1998). Floral dip :A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal, 16, 735-743. , ^TiA中國農業科學院作物科學研究所獲得。)，得到TO代轉ZmFBL2擬南芥。收獲TO代轉ZmFBL2擬南芥的種子，播種得到Tl代轉ZmFBL2擬南芥，收獲Tl代轉ZmFBL2擬南芥種子，播種得到T2代轉ZmFBL2擬南芥，收獲T2代轉ZmFBL2擬南芥的種子，播種得到T3代轉ZmFBL2擬南芥。采用相同的方法將空載體PCAMBIA3301導入野生型擬南芥Columbia中，得到轉空載體擬南芥。經過PCR鑒定，正向引物5' -TGGTCATCGTGGCGTCTGGTGT-3‘，反向引物 5 ‘ -AACCGCACAAGTCTACGGCTCTG-3，轉空載體擬南芥沒有目的基因。(2)分子鑒定提取T3代轉ZmFBL2擬南芥葉片的基因組DNA作為模板，分別以特異引物和bar 基因引物進行PCR，特異引物正向引物5'-TGGTCATCGTGGCGTCTGGTGT-3‘，反向引物5 ‘ -AACCGCACAAGTCTACGGCTCTG-3 ‘，bar 基因引物Barp-F 5' -GCGGTCTGCACCATCGTC-3 ‘Barp-R 5' -GTACCGGCAGGCTGAAGTCCA-3‘。以野生型擬南芥(W)、水為對照，以質粒pCAMBIA330 l_ZmFBL2為陽性對照。結果見圖3A和:3B所示，圖3A為基因特異引物擴增結果；圖為bar基因 (PCAMBIA3301上有bar基因)擴增結果；其中，-表示陰性對照(水)，W表示野生型擬南芥，1-10表示轉基因株系，+為陽性對照pCAMBIA3301-ZmFBL2，從圖3A中看出，得到大小為 555bp的片段為陽性T3代轉ZmFBL2擬南芥；-和W均無片段。從圖中看出，能夠擴增出230bp的目的條帶和470bp的bar基因為陽性T3代轉ZmFBL2擬南芥。既得到55^p的片段又得到bar基因陽性的為陽性T3代轉ZmFBL2擬南芥，共得到得到15株陽性T3代轉 ZmFBL2擬南芥。野生型擬南芥與轉空載體擬南芥結果無顯著差異。將編號為2-1、3-2、3-7、3-12、3-13、4-3的陽性T3代轉ZmFBL2擬南芥進行 ZmFBL2表達分析，以野生型擬南芥與轉空載體擬南芥為對照，具體為提取編號為2_1、 3-2、3-7、3-12、3-13、4-3的陽性T3代轉ZmFBL2擬南芥葉片的基因組RNA，反轉錄得到 eDNA作為模板，以特異引物正向引物5 ‘ -TGGTCATCGTGGCGTCTGGTGT-3 ‘，反向引物 5 ‘ -AACCGCACAAGTCTACGGCTCTG-3 ‘，進行 PCR，以 Actin 基因作為對照，Actin 引物為 5 ‘ -ATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGT-3 '和 5 ‘ -GAAACATTTTCTGTGAACGATTCC-3 ‘)，結果見圖 3C所示，圖3C為野生型和轉基因純合株系中ZmFBL2的表達分析，其中W為野生型擬南芥， 可以看出，在編號為2-1、3-2、3-7、3-12、3-13、4-3的陽性T3代轉ZmFBL2擬南芥中，ZmFBL2 均得到表達。野生型擬南芥與轉空載體擬南芥結果無顯著差異。4、轉ZmFBL2擬南芥表型分析將上述獲得的編號為3-7、3_13的陽性T3代轉ZmFBL2擬南芥、野生型擬南芥、轉空載體擬南芥分別進行如下處理在含有150mM NaCl的MS培養基上，分三個區域(圖4)點播各株系擬南芥種子， 每個株系60粒。在22°C、16小時光照/8小時黑暗條件下，生長15天統計存活率，實驗重復三次，結果取平均值。結果如下野生型擬南芥(W)的存活率為45. 2 士 5. 12% ；
編號為3-7 (F3-7)的陽性T3代轉ZmFBL2擬南芥(F3-7)的存活率為 81. 5士7. 76% ；編號為3-13(F3-13)的陽性T3代轉ZmFBL2擬南芥(F3-13)的存活率為 79. 7士6. 85% ；野生型擬南芥與轉空載體擬南芥結果無顯著差異。結果作圖如圖5所示，可以看出，與野生型擬南芥相比，轉ZmFBL2基因擬南芥具有較好的抗鹽性狀。
權利要求
1.一種蛋白質，是如下1)或幻的蛋白質1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由1)衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述蛋白質的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)或2)或3) 或4)所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5’末端第64-1170位核苷酸所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或幻限定的DNA分子雜交且編碼所述與植物耐逆性相關蛋白質的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與所述植物耐逆性相關蛋白質的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述編碼基因的重組表達載體、重組菌、轉基因細胞系或表達品.ο
5.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為將權利要求2或3所述的編碼基因插入載體PCAMBIA3301的多克隆位點得到的重組表達載體。
6.擴增權利要求2或3所述的編碼基因全長或其任意片段的引物對，引物對中的一條引物為序列表中序列3所示的DNA分子，另一條引物為序列表中序列4所示的DNA分子。
7.一種培育耐逆性提高的轉基因植物的方法，是將權利要求2或3所述的編碼基因導入目的植物得到轉基因植物，所述轉基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于 所述耐逆性為耐鹽性。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于權利要求2或3所述編碼基因是通過權利要求4或5所述重組表達載體導入所述目的植物中。
10.根據權利要求7-9任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物優選為擬南芥。
全文摘要
本發明公開了一種與植物耐逆性相關蛋白ZmFBL2及其編碼基因與應用。本發明提供了的蛋白質，名稱為ZmFBL2，來源于玉米，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由1)衍生的蛋白質。本發明的實驗證明，用克隆的方法得到ZmFBL2基因，將其導入擬南芥中得到的轉基因擬南芥，與野生型擬南芥相比，轉基因擬南芥的耐逆性高于野生型擬南芥，耐逆性表現在耐鹽性。本實驗得到的ZmFBL2基因和轉基因擬南芥在植物遺傳育種方面有重要的意義。
文檔編號C12N1/15GK102453082SQ20101052556
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月29日 優先權日2010年10月29日
發明者劉穎慧, 宋燕春, 張中保, 張登峰, 李會勇, 王天宇, 石云素, 黎裕 申請人:中國農業科學院作物科學研究所