專利名稱：野生茄子耐鹽基因StNHX1及其抗除草劑植物表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及了 一個(gè)野生茄子 iTorvumVigor' (Solanum torvum Swartz)耐鹽基因StNHXl基因及其抗除草劑植物表達(dá)載 體。
背景技術(shù)：
土壤鹽漬化對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的威脅是一個(gè)全球性的熱點(diǎn)問題，也是當(dāng)前我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì) 發(fā)展所面臨的生態(tài)危機(jī)之一。鹽對(duì)于植物的毒害作用主要是由于水分虧缺導(dǎo)致的滲透脅 迫以及過量的Na+對(duì)重要生化過程的毒害。植物克服鹽脅迫的機(jī)制是Na+的外排和液泡 區(qū)室化。質(zhì)膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白利用質(zhì)膜H+-ATPase產(chǎn)生的跨膜質(zhì)子梯度將Na+排出 細(xì)胞，減少Na+向葉片中的長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)而保護(hù)光合組織免受鹽的毒害。液泡膜Na+/H+反向 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白則利用液泡膜質(zhì)子泵(H+-ATPase和H+-PPase)產(chǎn)生的跨膜質(zhì)子梯度將Na+區(qū)室 化進(jìn)入液泡，不僅減輕了過多Na+的累積對(duì)細(xì)胞質(zhì)的毒害，而且可以利用NaCl作為溶質(zhì)維 持滲透勢(shì)以驅(qū)動(dòng)水分進(jìn)入細(xì)胞。因此，Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物耐鹽性中發(fā)揮著重要作 用。利用Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白耐鹽機(jī)理，將NHXl基因構(gòu)建成植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物以提 高其耐鹽性，至2009年止，已獲得多種轉(zhuǎn)NHXl基因植物，如水稻(①Zhao F, Guo S，Zhang H, Zhao Y. Expression of yeast S0D2 in transgenic rice results in increasedsalt tolerance. Plant Sci. 2006,170 :216_224 ；② Verma D, Singla-Pareek SL, Rajagopal D, Reddy MK, Sopory SK. Functional validation of a novel isoform ofNa./H+antiporter from Pennisetum glaucum for enhancing salinity tolerance in rice.JBiosci. 2007, 32 :621-628)、小麥(Xue ZY，Zhi DY，Xue GP，Zhao YX, Xia GM. Enhanced salt tolerance of transgenic wheat(Triticum aestivum L.)expressing avacuolar Na./H+antiporter gene with improved grain yield in saline soils in the fieldand a reduced level of IeafNa+. Plant Sci. 2004，167 :849_859)、番茄(Zhang HX, Blumwald Ε.Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but notin fruit. Nat Biotechnol. 2001，19 :765_768)、玉米(Yin XY, Yang AF, Zhang Kff, Zhang JR. Production and analysis of transgenic maize with improved salt toleranceby the introduction of AtNHXl gene. Acta Bot Sin. 2004，46 :854_861)等農(nóng)作物，這些轉(zhuǎn)基因 植株在耐鹽性方面都有了很大的提高(Ashraf M,Akram NA. Improvingsalinity tolerance of plants through conventional breeding and genetic engineering Ananalytical comparison. Biotechnology Advances. 2009,27 :744_752)。bar 基因(bialaphos resistance gene)最早從 口及 7_K 鏈 β 菌 (Streptomycehygroscopicus)中分離得到的，其編碼產(chǎn)物膦絲菌素N-乙酰 轉(zhuǎn)移酶(phosphinothricin acetyltransferase, PAT)能使草丁膦有效成分 PPT(phosphinothricin)降解成乙?；苌锒Щ?。目前，已創(chuàng)制出一系列耐除草劑(如 草甘膦)作物，如大豆(Zhang Ζ,Xing A, Staswick P,Clemente Τ. The use of glufosinateas aselective agent in Agrobacterium—mediated transformation of soybean. Plant CellTissue Organ Culture, 1999，56 :37_46)、水稻(Toki S, Takamatsy S, Nojiri C. Expression of a maize ubiquitin gene promoter-bar chimeric gene in transgenic riceplants. Plant Physiol. 1992，100 :1503_1507)、小麥(梁輝，唐順學(xué)，張馳.提高小 麥基因槍法轉(zhuǎn)化頻率的研究.遺傳學(xué)報(bào).1999，26 :643-648)、甘薯(Yi G，Shin YM, Choe G, Shin B, Kim YS, Kim M. Production of herbicide-resistant sweetpotatoplants transformed with the bar gene. Biotechnol Lett. 2007, 29 :669_675)等。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為解決提高農(nóng)作物耐鹽性的問題，提供一種新的野生茄子耐鹽基 因 StNHXl。本發(fā)明的另一目的是為同時(shí)解決農(nóng)作物耐鹽性及抗除草劑的問題，提供該耐鹽基 因StNHXl的抗除草劑植物表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。構(gòu)建的野生茄子耐鹽基因StNHXl抗除 草劑植物表達(dá)載體可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鹽敏感或除草劑敏感農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制耐 鹽、抗除草劑新種質(zhì)，提高鹽敏感農(nóng)作物的耐鹽性、賦予除草劑敏感農(nóng)作物抗除草劑特性， 可用于農(nóng)作物品種改良。本發(fā)明的技術(shù)問題可通過如下技術(shù)方案解決野生茄子耐鹽基因StNHXl (Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因)，該基因的序列為SEQ ID N0. 1。野生茄子耐鹽基因StNHXl抗除草劑植物表達(dá)載體，由本發(fā)明所述的野生茄子耐 鹽基因StNHXl與抗除草劑植物表達(dá)載體構(gòu)成。其中，所述的抗除草劑植物表達(dá)載體優(yōu)選中間載體PCAMBIA3301-121，該載體是通 過分別用 Hind III/EcoR I 雙酶切 pBI121 和 pCAMBIA3301,回收 pBI121 中 3005bp 的小片 段與PCAMBIA3301中11251bp的大片段，連接所述兩個(gè)片段得到的。野生茄子耐鹽基因StNHXl及其抗除草劑植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步 驟1)野生茄子耐鹽基因StNHXl的克隆選用野生茄子‘Torvum Vigor'作為試驗(yàn)材料，取幼嫩葉片，提取總RNA，取其2μ g 反轉(zhuǎn)錄cDNA，用RNase消化cDNA產(chǎn)物，根據(jù)NCBI上公布的番茄(Solanum lycopersicum) 耐鹽基因NHXl序列信息設(shè)計(jì)特異引物，在合成的野生茄子葉片cDNA中擴(kuò)增StNHXl，PCR產(chǎn) 物純化后連接到PMD19-T載體上，命名為pMD19-StNHXl，BamH I/Sac I雙酶切、測(cè)序驗(yàn)證；2)中間載體 pCAMBIA3301-121 的構(gòu)建pBI121 和 pCAMBIA3301 分別 Hind III/EcoR I 雙酶切，回收 pBI121 中 3005bp 的 小片段與和PCAMBIA3301中11251bp的大片段(含有bar基因)，T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒用AxyPr印質(zhì)粒DNA小量試劑盒提取純化，Hind III/EcoR I雙酶切驗(yàn)證，得到構(gòu)建成功的中間載體PCAMBIA3301-121 (含有bar基因)；3) StNHXl 植物表達(dá)載體 pCAMBIA3301_StNHXl 的構(gòu)建pMD19-StNHXl 與中間載體 pCAMBIA3301_121 分別 BamH I/Sac I 雙酶切，回收 pMD19-StNHXl 中 1605bp 的小片段與 pCAMBIA3301_121 中 12445bp 的大片段，用 T4DNA 連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5A感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒用AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒提取純化，分 別BamH I/Sac I雙酶切、Hindlll/EcoR I雙酶切、Xho I單酶切驗(yàn)證，得到構(gòu)建成功的植物 表達(dá)載體pCAMBIA3301-StNHXl (含有bar基因)。有益效果1.本發(fā)明提供的野生茄子耐鹽基因StNHXl是一種新的耐鹽基因，該基因可提高 農(nóng)作物耐鹽性。2.本發(fā)明將野生茄子耐鹽基因StNHXl克隆至含抗除草劑基因bar的中間載體 PCAMBIA3301-121中，構(gòu)建的野生茄子耐鹽基因SNHXl抗除草劑植物表達(dá)載體為茄子中首 次報(bào)道，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鹽敏感或除草劑敏感農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化，使轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物 具有抗除草劑特性并提高其耐鹽性，創(chuàng)制農(nóng)作物耐鹽及耐除草劑新種質(zhì)，對(duì)于進(jìn)一步培育 耐鹽新品系提供重要理論基礎(chǔ)。野生茄子耐鹽基因StNHXl抗除草劑植物表達(dá)載體的構(gòu)建 方法在創(chuàng)制耐鹽、耐除草劑作物方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
圖 lpMD19-StNHXl 質(zhì)粒 BamH I/Sac I 雙酶切檢測(cè)，1 =DL 2，000DNA Marker (TaKaRa),2 :pMD19-StNHXl 質(zhì)粒，3 :pMD19-StNHXl/BamH I/Sac I。圖 2pCAMBIA3301-121 中間載體 Hind III/EcoR I 雙酶切檢測(cè)，1 :DL 2，000DNA Marker (TaKaRa),2 1Kb Ladder DNA Maker (AXYGEN)，3 :pCAMBIA3301 質(zhì)粒，4、5 :pCAMBIA3301-121/Hind III/EcoR I，6 :pBI121/Hind III/EcoR I,7、pCAMBIA3301/Hind III/EcoR I，8 :1Kb Ladder DNA Maker (AXYGEN)。圖 3pCAMBIA3301-StNHXl 質(zhì)粒 BamH I/Sac I 雙酶切、Hind III/EcoR I 雙酶切及 Xho I單酶切檢測(cè)，1 :DL 2，000DNA Marker (TaKaRa),2、3、4、5 :pCAMBIA3301-StNHXl/BamH I/Sac I，6、7 :pCAMBIA3301-StNHXl/Xho I，8、9 :pCAMBIA3301-StNHXl/Hind III/EcoR I，10 =IKbp DNA Ladder Maker (TaKaRa)。圖4pCAMBIA3301-StNHXl植物表達(dá)載體質(zhì)粒圖譜。
五具體實(shí)施例方式實(shí)施例1野生茄子耐鹽基因StNHXl的克隆選用野生茄子‘Torvum Vigor，(Solanum torvum Swartz ；日本砧木品種，購(gòu)自日 本Takii種苗株式會(huì)社)作為試驗(yàn)材料，幼苗長(zhǎng)至八片真葉時(shí)，IOOmmol · L^lNaCl脅迫處理3天，取幼嫩葉片，按照Total RNA提取試劑盒(TaKaRa)說明提取總RNA，取2 μ g總RNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA(ReverTra Ace-a-TMcDNA合成試劑盒，東洋紡(上海)生物技術(shù)有限公司)； 根據(jù) NCBI 上公布的番茄 NHXl 的序列信息(Access NO. :AJ306630. 1 ；Venema K, Belver A, Marin-Manzano MC, Rodriguez-Rosales MP, Donaire JP.A novel intracellular K+/ H+antiporter related toNa./H+antiporters is important for K+ionhomeostasis in plants. J Biol Chem. 2003，278 :22453_22459)，用 01igo6. O 引物設(shè)計(jì)軟件(德國(guó) Merck 公 司)設(shè)計(jì)特異引物，上游引物(F)序列為SEQ ID NO. 2，下游引物(R)序列為SEQ ID NO. 3， 進(jìn)行PCR反應(yīng)，在野生茄子葉片cDNA中擴(kuò)增StNHXl基因①利用上、下游引物(F、R)以野生茄子cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系 (20 μ L) :ddH20 10. 2 μ L, 5 X Buffer 4μ L, dNTP (2. 5mmol · L-1) 1· 6 μ L，F(xiàn) (SEQID Ν0· 2)、 R(SEQ ID NO. 3)弓丨物(20 μ mol · L-1)各 1 μ L，cDNA( < 1 μ g) 1 μ L，DNA STAR 1 μ L ；PCR 擴(kuò)增程序95°C預(yù)變性4min，93°C變性30s, 56. 8°C退火30s，72°C延伸100s，30個(gè)循環(huán)，再 72°C延伸 IOmin ；②PCR產(chǎn)物產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN，愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公 司)純化后連接到PMD19-T載體(TaKaRa，寶生物工程(大連)有限公司)上，連接體系 (IOyL) :pMD19-T 載體 lyL，PCR產(chǎn)物 4yL，Solution I 5 μ L ;4°C過夜連接；連接產(chǎn)物(命 名為pMD19-StNHXl)轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(南京天為生物科技有限公司)，進(jìn)行BamH I/ Sac I雙酶切驗(yàn)證(圖1)和序列測(cè)定，序列如SEQ ID NO. 1所示，后續(xù)試驗(yàn)中備用；實(shí)施例21)野生茄子耐鹽基因StNHXl的克隆同實(shí)施例1。2)中間載體 pCAMBIA3301-121 的構(gòu)建pBI121 (Promega，普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)和pCAMBIA3301 (CAMBIA, 澳大利亞)分別Hind III/EcoR I雙酶切，回收pBI121中的小片段(3005bp)與 PCAMBIA3301中的大片段(11251bp)，按4 1的比例用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接，命名 為PCAMBIA3301-121，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行Hind III/EcoR I雙 酶切驗(yàn)證，具體步驟如下①取pBI121 和 pCAMBIA3301 質(zhì)粒各 10μ L，分別用 Hind III/EcoR I 雙酶切， 酶切反應(yīng)體系(50 μ L) :ddH20 31. 5 μ L, IOXBuffer E 5 μ L, BSA 0· 5 μ L，ρΒΙ121 或 PCAMBIA3301 plasmid 10 μ L，Hind III(Promega)1. 5 μ L, EcoR I(Promega)1. 5 μ L ;37°C, 反應(yīng)2h;酶切產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收pBI121中的小片段(3005bp)與 PCAMBIA3301 中的大片段(Il25Ibp)。②回收得到的pBI121中的小片段(3005bp)與pCAMBIA3301中的大片段 (11251bp)按4 1的比例用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接，連接體系(IOyL) :ddH20 3 μ L， ρΒΙ121 中的小片段(3005bp)4y L, pCAMBIA3301 中的大片段(11251bp) 1 μ L, IOXBuffer luL, T4連接酶IyL ;4°C，過夜連接；連接產(chǎn)物(命名為pCAMBIA3301_121)轉(zhuǎn)化DH5 α感 受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后，Hind III/EcoR I雙酶切驗(yàn)證(圖2)，得到構(gòu)建成功的中間載體ρ PCAMBIA3301-121。3)植物表達(dá)載體 pCAMBIA3301-SNHXl 的構(gòu)建pMD19-StNHXl 與中間載體 pCAMBIA3301_121 分別 BamH I/Sac I 雙酶切，回收 pMD19-StNHXl 中的小片段(1605bp)與 pCAMBIA3301_121 中的大片段(12445bp)，按 4 1的比例用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切驗(yàn)證①取質(zhì)粒pMD19-StNHXl 與中間載體 pCAMBIA3301_121 各 10 μ L，分別用 BamH I/Sac I 雙酶切，酶切反應(yīng)體系(50 μ L) :ddH20 31. 5 μ L, IOXBuffer E 5 μ L, BSA 0·5 μ L，pMD19-StNHXl 或 pCAMBIA3301_121 plasmid 10 μ L, BamH I/(Promega)1· 5 μ L， Sac I (Promega) 1. 5 μ L ;37 °C，反應(yīng)2h ；酶切產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收 pMD19-StNHXl 中的小片段(1605bp)與 pCAMBIA3301_121 中的大片段(12445bp)。②回收得到的pMD19-StNHXl中的小片段(1605bp)與pCAMBIA3301_121中的 大片段(12445bp)按4 1的比例用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接，連接體系(IOyL) ddH20 3 μ L, pMD19-StNHXl 中的小片段(1604bp)4y L, pCAMBIA3301_121 中的大片段 (12445bp)lyL,10XBuffer IyL, T4連接酶1 μ L ;4 °C，過夜連接；連接產(chǎn)物(命名為 PCAMBIA3301-StNHXl)轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后，分別BamH I/Sac I雙酶 切、Hind III/EcoR I雙酶切、Xho I單酶切驗(yàn)證(圖3)，得到構(gòu)建成功的植物表達(dá)載體 pCAMBIAl301-StNHXl (圖 4)。綜上所述，本發(fā)明構(gòu)建的野生茄子耐鹽基因StNHXl基因及該基因的抗除草劑植 物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StNHXl為茄子中首次報(bào)道，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鹽敏感或 除草劑農(nóng)敏感作物遺傳轉(zhuǎn)化，提高鹽敏感農(nóng)作物耐鹽性和賦予除草劑敏感農(nóng)作物抗除草劑 特性，消除鹽堿地逆境和除草劑對(duì)農(nóng)作物的危害，可進(jìn)行農(nóng)作物品種改良。
權(quán)利要求
野生茄子耐鹽基因StNHX1，其特征在于該基因的序列為SEQ ID NO.1。
2.野生茄子耐鹽基因StNHXl抗除草劑植物表達(dá)載體，其特征在于由權(quán)利要求1所述的 野生茄子耐鹽基因StNHXl與抗除草劑植物表達(dá)載體構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的野生茄子耐鹽基因StNHXl抗除草劑植物表達(dá)載體，其特 征在于所述的抗除草劑植物表達(dá)載體為分別用Hind III/EcoR I雙酶切質(zhì)粒pBI121和 PCAMBIA3301,回收pBI121中的3005bp的小片段與pCAMBIA3301中的11251bp的大片段， 連接所述的兩個(gè)片段得到的中間載體PCAMBIA3301-121。
4.權(quán)利要求3所述的野生茄子耐鹽基因SNHXl抗除草劑植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其 特征在于包括如下步驟1)野生茄子‘TorvumVigor’耐鹽基因StNHXl的克隆選用野生茄子‘Torvum Vigor’作為試驗(yàn)材料，取葉片，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA， 用RNase消化cDNA產(chǎn)物，根據(jù)NCBI上公布的番茄耐鹽基因NHXl序列信息設(shè)計(jì)特異引物， 在合成的野生茄子葉片cDNA中擴(kuò)增StNHXl，PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD19_T載體上，命名 為 pMD19-StNHXl，BamH I/SacI 雙酶切、測(cè)序驗(yàn)證；2)中間載體pCAMBIA3301-121的構(gòu)建PBI121 和 pCAMBIA3301 分別 Hind III/EcoR I 雙酶切，回收 pBI121 中 3005bp 的 小片段和PCAMBIA3301中11251bp的大片段，T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感 受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒經(jīng)提取純化后，Hind III/EcoR I雙酶切驗(yàn)證，得到構(gòu)建成功的中間載體 PCAMBIA3301-121 ；3)StNHXl植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StNHXl的構(gòu)建pMD19-StNHXl 與中間載體 pCAMBIA3301_121 分別 BamH I/Sac I 雙酶切，回收 pMD19-StNHXl 中 1605bp 的小片段與 pCAMBIA3301_121 中 12445bp 的大片段，用 T4DNA 連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒經(jīng)提取純化后，分別BamH I/Sac I 雙酶切、Hind III/EcoR I雙酶切、Xho I單酶切驗(yàn)證，得到構(gòu)建成功的植物表達(dá)載體 PCAMBIA3301-StNHXl ο
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了野生茄子耐鹽基因StNHX1及其抗除草劑植物表達(dá)載體。本發(fā)明所述的野生茄子耐鹽基因StNHX1序列為SEQIDNO.1。該基因的抗除草劑植物表達(dá)載體是將StNHX1基因插入到中間載體pCAMBIA3301-121的BamHI/SacI酶切位點(diǎn)間得到的。該植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)作物后將會(huì)使其具有抗除草劑特性并可提高其耐鹽性，對(duì)提高我國(guó)農(nóng)作物分子育種的技術(shù)水平具有重要理論和實(shí)踐意義。
文檔編號(hào)C12N15/66GK101974538SQ20101052257
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月28日
發(fā)明者朱月林, 楊立飛, 蓋鈞鎰, 陳國(guó)戶 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)