一種酯酶及其編碼基因與應用的制作方法

專利名稱：一種酯酶及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域中的一種酯酶及其編碼基因與應用。
背景技術：
酯酶和脂肪酶都是羧酸酯水解酶，并且被分為8個族。酯酶(Esterases)水解少 于10個碳原子的短鏈脂肪酸的酯鍵，而脂肪酶(Lipase)則水解多于10個碳原子的長鏈脂 肪酸的酯鍵。酯酶和脂肪酶都是分解脂肪的酶，可利用底物范圍非常廣泛。目前，酯酶和脂 肪酶被廣泛用于洗滌劑行業、油脂化工、生物化工、食品工業、飼料行業、醫療醫藥、手性合 成等行業中，每年全球需求量高達1000噸。由于酯酶和脂肪酶的商業重要性，使得酯酶和脂肪酶的研究一直受到重視。微生 物酯酶和脂肪酶具有比動植物酯酶和脂肪酶的作用PH范圍、作用溫度范圍以及對底物的 專一性類型更廣，便于工業生產中獲得高純度制劑等優勢，因此微生物酯酶和脂肪酶研究 已成為世界各國新酶研發的重要來源。已報道的產酶微生物的種類非常廣泛，主要包括青 霉、白地霉、根霉、假絲酵母等屬的真菌以及無色桿菌、不動桿菌、堿桿菌、節桿菌、芽孢桿 菌、乳桿菌、假單胞菌、葡萄球菌等屬細菌。盡管人們已從微生物中獲得不少酯酶和脂肪酶，而且目前工業上應用的微生物酯 酶和脂肪酶大多數都是采用傳統的微生物純培養的方法獲得的，但是這種方式有很大的局 限性。一方面，據估計自然界存在的各種微生物類群中獲得純培養的還不到1%，這使得只 有很少一部分的微生物酯酶和脂肪酶得以研究利用，而近年來發展起來的宏基因組克隆技 術使我們全面研究自然界廣泛存在的未培養微生物的基因資源成為可能。另一方面，通過 傳統的微生物純培養方法獲得微生物酯酶和脂肪酶通常產量較低，而通過構建基因工程菌 的方式發酵獲得目的蛋白，其產量遠非傳統方式可比，最高能達到總蛋白量的50%。因此， 采用宏基因組克隆等高通量篩選分子生物學技術開展微生物酯酶和脂肪酶的研究，對豐富 微生物酯酶和脂肪酶家族成員，推動酯酶和脂肪酶的廣泛應用都具有重要意義。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種蛋白質，該蛋白質為酯酶。本發明所提供的蛋白質，命名為EstOl，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有酯酶活性的由1)衍生的蛋白質。所述蛋白質的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。所述編碼基因為如下1)-3)中任一所述的DNA分子
1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼具有酯酶活性蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98% 或至少具有99%同源性且編碼具有酯酶活性蛋白的DNA分子。含有所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系、表達盒或重組病毒也屬于 本發明的保護范圍。所述重組載體為將所述的編碼基因插入載體pET30a的多克隆位點得到的重組載 體。所述重組菌為將所述的重組載體轉入宿主菌E. coli BL2(DE3)得到的重組菌。擴增所述編碼基因全長或任一片段的引物對；所述引物對如下所示一條引物序 列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。所述蛋白質、所述編碼基因、所述重組載體和/或所述重組菌在水解短鏈脂肪酸 脂中的應用也屬于本發明的保護范圍。所述水解的溫度為10°C -60°c或 10°C -40°c或 10°C -30°C或 20°C -40°C，優選為 20°C ；所述水解的 pH 值為 5. 0-10. 0 或 7. 0-10. 0 或 8. 0-10. 0 或 8. 0-9. 0，優選為 8. 0。所述短鏈脂肪酸脂為對硝基苯丁酸酯、對硝基苯乙酸酯、對硝基苯辛酸酯、對硝基 苯癸酸酯和/或三丁酸甘油酯。本發明應用宏基因組克隆技術獲得的酯酶為能夠水解短鏈脂肪酸的新型微生物 酯酶，該酶在水解短鏈脂肪酸反應中的最適溫度為20°C，最適pH值為8. 0，最適底物為對硝 基苯丁酸酯。本發明對利用宏基因組克隆技術開發獲得新酶產品具有重要的意義。


圖1為含有酯酶基因陽性克隆的水解圈。圖2為PCR擴增酯酶基因estOl的電泳結果。圖3為酯酶基因的誘導表達后的SDS-PAGE電泳結果。圖4為粗酶裂解液的平板定性檢測酯酶水解活性的結果。圖5為純化的酯酶Est 01的平板定性檢測酯酶水解活性的結果。圖6為牛血清蛋白(BSA)濃度-0D595吸光值標準曲線。圖7為對硝基苯酚(P-NP)濃度-0D405吸光值標準曲線。圖8為純化的酯酶Est 01最適酶反應溫度測定結果。圖9為純化的酯酶Est 01最適酶反應pH值測定結果。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1酯酶基因的獲得及酯酶功能驗證一、酯酶基因的獲得1、酯酶陽性克隆的篩選及序列測定分析從四川江油縣戶用沼氣池采集沼液樣品，構建沼氣發酵微生物宏基因組文庫。采 用含100yg/mL氨芐青霉素和(w/v)乳化三丁酸甘油酯的LB培養基作為選擇性培養 基，從該文庫中篩選酯酶陽性克隆。將經過活化的96孔文庫細胞培養板用影印接種針復制到直徑為150mm的固體選擇性培養基平板上，37°C下培養2天，篩選菌落周圍有水解圈出現 的陽性克隆。為了排除假陽性，提取所篩選的陽性克隆質粒，重新轉化至大腸桿菌E. coli DH5a宿主細胞中，同時向Ε. coli DH5 α宿主細胞中轉入空載體pBluescript SK(+)作為 陰性對照，在選擇性平板上培養兩天后仍有水解圈出現，則證明為真陽性克隆，結果如圖1 所示，圖1中A為轉入酯酶陽性克隆質粒的E. coli DH5a在選擇性平板上培養兩天后有水 解圈出現，B為轉入空載體pBluescript SK(+)的E. coliDH5 α在選擇性平板上培養兩天 后的未出現水解圈。從圖1可見，與對照相比，轉入酯酶陽性克隆質粒的E. coli DH5a培 養兩天后仍有水解圈出現，則證明為真陽性克隆。提取所獲得的陽性克隆質粒，送至上海生工生物工程有限公司測序，得到一個 3857bp 的核苷酸序列，采用 NCBI ORF Finder (http //www, ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html)及DNAMAN序列分析軟件對序列進行開放性閱讀框(ORF)分析，并對可能的ORF進行 Blast在線相似性分析，結果顯示，其中長度為1194bp的ORF398 (序列表中序列1所示)與 β-內酰胺酶相似性為45%。2、酯酶全長基因estOl的克隆人工合成序列表中序列1所示DNA。根據ORF398序列，設計擴增出完整開放性閱讀框的引物，上游引物為est OlF =CGG GGTACCATGAATAATTCAATAACGATTG ；下游引物為 est OlR CCGGAATTCTCAAATAATTGAAGAAAAA ATTAC，并在上下游引物中分別引入限制性內切酶位點(引物est OlF上引入Kpn I酶切 位點，引物est OlR上引入EcoR I酶切位點，已用下劃線標出)。以序列表中序列1所示 DNA為模板，以est OlF和est OlR為引物，進行PCR擴增，反應體系為EX Taq酶(2. 5U/ μ L Takara 公司)1 μ L，10 倍緩沖液 5 μ L，質粒 DNA 模板 1 μ L, dNTPs (2. 5mmol/L) 4 μ L，上 下游引物(10ymol/L)各1 μ L，超純水補足50 μ L。擴增程序為94°C，3min ；94°C Imin, 580C lmin, 72°C 2min，30個循環；72°C，lOmin。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如 圖2所示(圖2中1為PCR擴增條帶，M為2kb DNA Ladder)，從圖2可見，擴增得到了約 1. 2kb的片段，回收此大小約1. 2kb的片段。將所回收的約1. 2kb的PCR擴增片段連接于 PGEM-T Easy后轉化DH5 α，選取陽性克隆進行測序，測序結果表明該擴增產物的序列包含 如序列表中序列1所示的序列，序列1由1194個核苷酸組成。其編碼區為序列1自5’末 端第1-1194位核苷酸，將該基因命名為estOl，該基因編碼的蛋白的氨基酸序列為序列表 中的序列2所示，由397個氨基酸組成。將該蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列經蛋白質數 據庫和核苷酸數據庫分別進行搜尋比較，未發現有任何相同氨基酸序列和核苷酸序列，該 蛋白屬于新型酯酶，歸屬于酯酶第VIII家族，將其命名為EstOl。二、酯酶功能驗證1、含有酯酶編碼基因的重組菌的獲得將上述步驟一所回收的約1.2kb的擴增片段經過KpnI和EcoRI酶切，連接于 經同樣雙酶切的表達載體pET30a(表達載體pET30a購自Novagen公司，產品目錄號為 69909-3)，，獲得重組質粒轉化至大腸桿菌E. coli DH5 α (大腸桿菌E. coli DH5 α購自 Takara公司，產品目錄號為D9057)中。通過藍白篩選挑取陽性克隆，提取陽性克隆的質 粒DNA，經PCR擴增和雙酶切的方法雙重驗證獲得的重組質粒，結果表明該重組質粒構 建正確，將該重組質粒命名為PCX01。將重組質粒pCXOl轉入表達宿主大腸桿菌Ε. coliBL21(DE3)(大腸桿菌E. coli BL21(DE3)購自Takara公司，產品目錄號為D9126)中，進行 抗性篩選，挑取陽性克隆，將陽性克隆進行液體培養，提純重組質粒PCX01，進行測序驗證， 測序結果表明，獲得的重組質粒為在表達載體pET30a的KpnI和EcoRI位點間插入了序列 表中序列1中第1-1194位的核苷酸序列。將篩選得到的轉酯酶基因的基因工程菌株命名 為 E. coli BL21(DE3) · pCXOl。同時將空載體 pET30a 轉化表達宿主 Ε. coli BL2 (DE3)，獲 得轉空載體陰性對照菌株E. coliBL21 (DE3) · pET30a。2、酯酶基因的誘導表達將步驟1獲得的基因工程菌E. coli BL21 (DE3) · pCXOl及轉空載體陰性對照菌 株E. coli BL21(DE3) · pET30a接種于LB培養基，于37°C培養至OD6tltlnm約為0. 6時，加入 IPTG(終濃度為lmmol/L)進行誘導，繼續培養10小時。同時設不加IPTG誘導的基因工程菌 E. coli BL21(DE3) 'pCXOl作為對照。離心收集菌體，超聲波破碎菌體，離心收集上清，采用 SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達情況，結果如圖3所示，圖3中M為蛋白分子量標準；1為基因 工程菌E. coli BL21 (DE3) · pCXOl經誘導表達的產物；2為轉空載體陰性對照菌株E. coli BL21 (DE3) 'pET30a經誘導表達的產物；3為基因工程菌E. coli BL21 (DE3) pCXOl未經誘 導表達的產物。從圖3中可見，基因工程菌E. coliBL21(DE3) -pCXOl經誘導表達后產生了 表觀分子量約為44kDa的蛋白，與預期的酯酶大小一致；而轉空載體陰性對照菌株E. coli BL21 (DE3) · pET30a經誘導后以及基因工程菌E. coli BL21 (DE3) · pCXOl未經誘導均未產 生此蛋白。3、酯酶的純化采用 Invitrogen 公司的His標簽蛋白純化試劑盒Proband Purification system 進行酯酶蛋白的純化，取步驟2誘導表達后的基因工程菌Ε. coli BL21(DE3) · pCXOl菌 液50ml至離心管中，于5000g 25 °C離心30min，收集菌體。加入15ml Tris-HCl (50mM pH 8.0)，重懸菌體。于 5000g，25°C離心 30min，收集菌體，加入 8ml IXNative binding buffer (pH8. 0)，渦旋混勻后，加入8mg (20000U/mg)溶菌酶，上下顛倒數次混勻。于冰上， 超聲波破碎儀高強度破碎6次，每次10s，中間間隔10s。將細胞破碎物于4°C 15000g離心 30min，收集上清。按照說明書方法填充Ni柱，將8ml裂解液加至純化柱。結合50分鐘，期 間在雜交爐中緩慢搖動，以防止樹脂沉降。自然沉降lOmin，吸去上清。加入SmllXNative wash buffer重懸，自然沉降，吸去上清。重復此步驟再三次。將注子固定于垂直架上，打開 底蓋，用8mllXNative elutionbuffer洗脫柱子，收集成Iml的小份，SDS-PAGE電泳檢測 每管中的蛋白含量，選取含量最高的進行透析脫鹽，透析液為50mM Tris-HCl (10% ν/ν甘 油)。透析過夜后，分裝成50uL的小管，液氮速凍，保存至超低溫冰箱中。4、功能驗證平板定性檢測酯酶水解活性(1)粗酶液活性檢測將步驟2中基因工程菌E. coli BL21 (DE3) · pCXOl和轉空載體對照菌株 E. coliBL21 (DE3) · pET30a經IPTG誘導表達后，再將菌體超聲波破碎，收集裂解液，將裂解 液分別點接于發色底物平板(含有0.01%苯酚紅、乳化三丁酸甘油酯、10mmOl/LCaCl2 和2%瓊脂粉，用0. IN NaOH將pH調至7. 3-7. 4)上，于37°C保溫lOmin，由于酯酶可以將平 板中的三丁酸甘油酯水解，產生脂肪酸，脂肪酸將原本PH為7. 3-7. 4的發色底物pH降低，從而進入指示劑苯酚紅的顯色范圍(PH6. 6-8. 0，顏色黃-紅)，所以在紅色的發色底物平板 上會產生黃色斑點。如圖4所示，滴加基因工程菌E. coliBL21 (DE3) -pCXOl裂解液的位置 出現黃色斑點(圖4中A)，而滴加對照菌E. coliBL21 (DE3) · pET30a裂解液的位置則沒有 出現黃色斑點(圖4中B)。此結果說明，基因工程菌E. coli BL21(DE3) 'pCXOl經IPTG誘 導表達后的產物有酯酶水解活性，而轉空載體對照菌株E. coli BL21(DE3) ·ρΕΤ30ει經IPTG 誘導表達后的產物沒有酯酶水解活性。(2)純化酶活性檢測將步驟3中經過純化的酯酶及經100°C加熱處理IOmin的純化酯酶各5 μ L點至發 色底物平板上，37°C保溫lOmin，純化的酯酶在發色底物平板上有顯色反應(圖5中A)，而 經過高溫失活處理的純化的酯酶則在發色底物平板上沒有顯色反應(圖5中B)。實施例2酯酶Est 01的酶學特性研究一、酯酶活性定量測定1、酯酶蛋白含量測定采用Brandford法對實施例1步驟3中經過純化的酯酶蛋白含量進行測定定量， 按照天根生化科技有限公司Brandford蛋白定量試劑盒所述的方法，首先以牛血清蛋白 (BSA)標樣的濃度(見表1)對595nm波長處吸光值0D595制作蛋白標準曲線(圖6)，得出牛 血清蛋白(BSA)濃度-0D595吸光值標準曲線方程為y = 0. 2175x+0. 0051 (R2 = 0. 9991)； 然后取酶液5 μ L，加入PBS補足體積為75 μ L，加入1. 425mL考馬斯亮藍染液，混勻，室溫放 置5min。于測定595nm波長處光吸收值0D595。三次重復測定結果分別為0. 021、0. 023、 0. 020，取平均值0. 021，根據蛋白標準曲線可計算出，5 μ L酶液含酶蛋白量為0. 11 μ g。表1牛血清蛋白(BSA)標樣的不同濃度下的0D595吸光值
權利要求
一種蛋白質，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有酯酶活性的由1)衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述蛋白質的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)-3)中任一 所述的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼具有酯酶活性蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具 有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至 少具有99%同源性且編碼具有酯酶活性蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系、表達盒或重 組病毒。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為將權利要求2或3所 述的編碼基因插入載體pET30a的多克隆位點得到的重組載體。
6.根據權利要求4所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為將權利要求4或5所述 的重組載體轉入宿主菌E. coli BL2(DE3)得到的重組菌。
7.擴增權利要求2或3所述編碼基因全長或任一片段的引物對；所述引物對如下所 示一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。
8.權利要求1所述蛋白質、權利要求2或3所述編碼基因、權利要求4或5所述重組載 體和/或權利要求4或6所述的重組菌在水解短鏈脂肪酸脂中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述水解的溫度為10°C-60°C或 10 V -40 V或10 V -30 V或20 V -40 V，優選為20 V ；所述水解的pH值為5. 0-10. 0或 7. 0-10. 0 或 8. 0-10. 0 或 8. 0-9. 0，優選為 8. 0。
10.根據權利要求8或9所述的應用，其特征在于所述短鏈脂肪酸脂為對硝基苯丁酸 酯、對硝基苯乙酸酯、對硝基苯辛酸酯、對硝基苯癸酸酯和/或三丁酸甘油酯。
全文摘要
本發明公開了一種酯酶及其編碼基因與應用。本發明所提供的酯酶，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有酯酶活性的由1)衍生的蛋白質。本發明應用宏基因組克隆技術獲得的酯酶為能夠分解短鏈脂肪酸的新型微生物酯酶，該酶在水解短鏈脂肪酸中的最適水解溫度為20℃，最適pH值為8.0，最適底物為對硝基苯丁酸酯。本發明對利用宏基因組克隆技術開發獲得新酶產品具有重要的意義。
文檔編號C12N1/15GK101979528SQ201010521640
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月21日 優先權日2010年10月21日
發明者劉華偉, 張姝, 成曉杰, 王敏, 程敏, 高俊蓮 申請人:北京農業生物技術研究中心