專利名稱：制備唾液酸的方法和專用固定化大腸桿菌細胞的制作方法
技術領域：
本發明涉及制備唾液酸的方法和專用固定化大腸桿菌細胞。
背景技術：
唾液酸(Sialic acid)是一族神經氨酸(Neuraminic acid)衍生物，是含有9個 碳原子并具有吡喃糖結構的酸性氨基糖，它是生物雜聚物的重要組成部分，主要以短鏈殘 基的形式存在于糖蛋白和糖脂的末端。從1957年發現這種物質以來，唾液酸已經被證明對 體內多種生物學功能具有重要意義。目前主要應用領域有三個方面一是藥物前體市場，二 是嬰兒食品市場，三是保健品市場.無論是作為具有保健功能的食品添加劑還是用于生產具有治療功能的臨床藥物， 唾液酸都具有廣泛的應用前景和較高的市場價值，但是，唾液酸的生產則一直處于較低水 平，難以滿足將來市場大規模的需求。唾液酸單體的生產主要有化學合成法、提取法、酶法合成和微生物發酵四種。化學 合成法成本高，需要用到貴重金屬銦，反應條件苛刻，純化困難。提取法從植物或動物組 織中提取唾液酸，如燕窩、雞蛋、動物臟器和部分植物等，由于唾液酸的含量低，來源少，受 客觀因素影響大，污染也很大，不利于工業推廣。酶法合成唾液酸醛縮酶不易獲得，同時需 要N-乙酰-D-甘露糖胺和丙酮酸作為底物，原料成本高，導致終產品價格昂貴。而最常用 的是微生物發酵，其生產原理是通過微生物發酵工藝，使特定的細菌在生長過程中合成胞 外多聚唾液酸。將菌體去除后，上清液即為多聚唾液酸，多聚唾液酸經過進一步精制后，在 特定的條件下進行解聚，獲得唾液酸單體。運用離子柱層析純化唾液酸單體，獲得純的唾液 酸單體制品。微生物發酵屬于生化過程，所以原料費用低廉，產品成本很低，但常規發酵方 法菌種培養需要較多的時間、人力與物力，其生產效率還不高。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種固定化大腸桿菌細胞。本發明所提供的固定化大腸桿菌細胞，是通過包括如下步驟的方法得到的1)將聚乙烯醇水溶液和海藻酸鈉水溶液混合，得到I液；2)將步驟1)得到的I液與大腸桿菌菌懸液混合，得到II液；3)將步驟2)得到的II液滴加到氯化鈣和硼酸的混合水溶液中，放置，得到固定化 大腸桿菌細胞。所述大腸桿菌菌懸液是大腸桿菌的生理鹽水溶液；所述將步驟1)得到的I液與大腸桿菌菌懸液混合的體積比為10 1;所 述II液中，聚乙烯醇、海藻酸鈉和大腸桿菌的配比為Ig聚乙烯醇0. Ig海藻酸 鈉1 X IO8-I X IO9CFU大腸桿菌，具體為Ig聚乙烯醇0. Ig海藻酸鈉1 X IO8CFU大腸 桿菌或Ig聚乙烯醇0. Ig海藻酸鈉IX IO9CFU大腸桿菌；所述步驟3)中所述II液的溫度為38°C -42°c，具體為38°C、40°C或42°C ；所述氯化鈣和硼酸的混合水溶液的溫度為4°C ；所述II液與所述氯化鈣和硼酸的混合水溶液的體 積比為1 50。所述聚乙烯醇的數均分子量為1750g/mol ；所述I液中聚乙烯醇的濃度為100g/L，海藻酸鈉的濃度為10g/L ；所述大腸桿菌菌懸液中菌濃度為1 X 108CFU/ml-l X 109CFU/ml，具體為1 X IO8CFU/ ml 或 1 X 109CFU/ml ；所述氯化鈣和硼酸的混合水溶液中氯化鈣的濃度為20g/L，硼酸的濃度為40g/L。所述放置的方法為先在25°C放置4小時，然后在4°C下放置16-20小時，具體為16 小時、18小時或20小時；所述滴加的方法為用注射器滴加；所述注射器的針頭直徑為0. 4mm。所述大腸桿菌為大腸桿菌菌種C8。所述固定化細胞的直徑為2mm-4mm。本發明的另一個目的是提供一種制備唾液酸的方法。本發明所提供的制備唾液酸的方法，是將所述的固定化大腸桿菌細胞發酵培養， 得到唾液酸。所述方法中，在所述發酵培養后，包括如下提取步驟將所述發酵培養后得到的發 酵液中的固定化大腸桿菌細胞取出后，將剩余的發酵液離心，取上清液經超濾濃縮后，加入 硫酸銨水溶液，在0°c進行沉淀，取上清再離心，得到的上清液為唾液酸；所述發酵液為發 酵容器內的所有物質。所述發酵培養的培養基由以下成分組成山梨醇、硫酸銨、胰蛋白胨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂和水；以上成分在所述培養基中濃度分別為山梨醇25g/L、硫酸銨5g/L、胰蛋白胨15g/L、磷酸氫二鉀20g/L和硫酸鎂0. 4g/L ；所述發酵培養的溫度為37°C ；所述發酵培養的pH值為7. 8 ；所述發酵培養的時間為65小時；所述發酵培養中固定化細胞的用量為5粒-15粒所述固定化大腸桿菌細胞/50ml 發酵培養基，具體為5粒所述固定化大腸桿菌細胞/50ml發酵培養基、10粒所述固定化大腸 桿菌細胞/50ml發酵培養基或15粒所述固定化大腸桿菌細胞/50ml發酵培養基。所述的固定化大腸桿菌細胞在制備唾液酸中的應用也屬于本發明保護的范圍。本發明所提供的制備唾液酸的固定化大腸桿菌細胞和發酵方法，可將固定化大腸 桿菌細胞連續培養10批以上，且大腸桿菌產唾液酸的能力不下降，不需另制備菌種種子 液，具有省時、省料、提高產率和降低成本等的優點。本發明所提供的固定化大腸桿菌細胞 的制備方法簡單，整個工藝易于操作，效果顯著。因此，本方法在開發唾液酸及其衍生物產 品方面，具有廣闊的應用前景。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
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聚乙烯醇(數均分子量1750g/mol ；購自北京博恩創奇科貿中心，產品目錄號為 00636)；海藻酸鈉(購自北京中生百欣科技服務有限公司，產品目錄號為5-84)。實施例1、制備固定化大腸桿菌細胞方法I固定化大腸桿菌細胞的制備方法如下1)將聚乙烯醇的水溶液和海藻酸鈉的水溶液混合，得到I液；I液中聚乙烯醇的濃 度為100g/L，數均分子量為1750g/mol，海藻酸鈉的濃度為10g/L。2)將步驟1)得到的I液與大腸桿菌菌懸液按照體積比為10 1的比例混合， 得到II液；II液中，聚乙烯醇、海藻酸鈉和大腸桿菌的配比為Ig聚乙烯醇0. Ig海藻酸 鈉IX IO8CFU大腸桿菌。大腸桿菌菌懸液是大腸桿菌的生理鹽水溶液，在大腸桿菌菌懸 液中菌濃度為lX108CFU/ml。3)將步驟2)得到的II液放在溫度為38°C的水浴鍋中溫浴，然后取IOml II液用 5ml注射器滴(注射器的針頭直徑為0. 4mm)加到4°C的500mL氯化鈣和硼酸的混合水溶液 (含有20g/L氯化鈣和40g/L硼酸)中，邊滴加邊攪拌，25°C放置4小時，然后在4°C (冰 箱冷藏室)下放置16小時進行硬化，制備得到固定化細胞。得到的固定化細胞為直徑為 2mm-4mm的顆粒。所述滴加的II液與所述氯化鈣和硼酸的混合水溶液的體積比為1 50。上述大腸桿菌菌懸液是通過如下步驟的方法得到(1)將大腸桿菌菌種C8(保藏在中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心(簡 稱CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 4214)(公眾可從中圍科學樣微生物研究所獲得該大腸桿菌 菌種C8，記載過該材料的非專利文獻是郭良棟，錢世鈞，葉軍，張樹政.產多聚唾液酸的菌 種篩選及產酸條件.微生物學報，1998，38(2)，103-107)按5%的接種量(體積百分比)接 入培養基A，在pH值為7. 8、37°C和250rpm的條件下培養65小時得到發酵液；(2)取50ml步驟1得到發酵液，4000rpm離心lOmin，去掉上清，收集大腸桿菌細 胞；(3)將步驟(2)收集的大腸桿菌細胞用0. 85%的生理鹽水洗滌2次后，溶于5ml 生理鹽水，制備得到大腸桿菌菌懸液；所述培養基A由以下成分組成山梨醇、硫酸銨、胰蛋白胨(購自北京鼎國生物技術有限責任公司，產品目錄號為 DH378)、磷酸氫二鉀、硫酸鎂和水；以上成分在所述培養基A中濃度分別為山梨醇25g/L、硫酸銨5g/L、胰蛋白胨15g/L、磷酸氫二鉀20g/L和硫酸鎂0. 4g/L。方法II固定化細胞的制備方法如下1)與方法I中步驟1)相同。2)將步驟1)得到的I液與大腸桿菌菌懸液按照體積比為10 1的比例混合， 得到II液；II液中，聚乙烯醇、海藻酸鈉和大腸桿菌的配比為Ig聚乙烯醇0. Ig海藻酸 鈉IX IO8CFU大腸桿菌。大腸桿菌菌懸液是大腸桿菌的生理鹽水溶液，在大腸桿菌菌懸 液中菌濃度為lX108CFU/ml。
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3)將步驟2)得到的II液放在溫度為40°C的水浴鍋中溫浴，然后取IOml II液用 5ml注射器(注射器的針頭直徑為0. 4mm)滴加到4°C的500mL氯化鈣和硼酸的混合水溶液 (含有20g/L氯化鈣和40g/L硼酸)中，邊滴加邊攪拌，25°C交聯4小時，然后在4°C (冰 箱冷藏室)下放置18小時進行硬化，制備得到固定化細胞。得到的固定化細胞為直徑為 2mm-4mm的顆粒。所述滴加的II液與所述氯化鈣和硼酸的混合水溶液的體積比為1 50。上述大腸桿菌菌懸液的制備方法與方法I中相同。方法III固定化細胞的制備方法如下1)與方法I中步驟1)相同。2)將步驟1)得到的I液與大腸桿菌菌懸液按照體積比為10 1的比例混合， 得到II液；II液中，聚乙烯醇、海藻酸鈉和大腸桿菌的配比為Ig聚乙烯醇0. Ig海藻酸 鈉IX IO9CFU大腸桿菌大腸桿菌菌懸液是大腸桿菌的生理鹽水溶液，在大腸桿菌菌懸 液中菌濃度為lX109CFU/ml大腸桿菌。3)將步驟2)得到的II液放在溫度為42°C的水浴鍋中溫浴，然后取IOml II液用 5ml注射器(注射器的針頭直徑為0. 4mm)滴加到4°C的500mL冷卻的氯化鈣和硼酸的混 合水溶液(含有20g/L氯化鈣和40g/L硼酸)中，邊滴加邊攪拌，25°C交聯4小時，然后在 40C (冰箱冷藏室)下放置20小時進行硬化，制備得到固定化細胞。得到的固定化細胞為 直徑為2mm-4mm的顆粒。所述滴加的II液與所述氯化鈣和硼酸的混合水溶液的體積比為 1 50。上述大腸桿菌菌懸液的制備方法與方法I中相同。實施例2、制備唾液酸方法I1、固定化細胞的培養取實施例1制備得到的直徑為2mm-4mm的固定化細胞顆粒5粒，用無菌水洗滌后， 放入裝有50ml已滅菌好的發酵培養基的250ml的三角瓶中，在pH值為7. 8、37°C和250rpm 的條件下培養65h得到發酵液。所述發酵液為發酵容器內的所有物質。上述發酵培養的培養基由以下成分組成山梨醇、硫酸銨、胰蛋白胨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂和水；以上成分在所述培養基中濃度分別為山梨醇25g/L、硫酸銨5g/L、胰蛋白胨15g/L、磷酸氫二鉀20g/L和硫酸鎂0. 4g/L。2、固定化細胞的連續培養將步驟1得到的發酵液倒出，取出5粒固定化細胞顆粒，用無菌水沖洗后，再接入 裝有50ml已滅菌好的上述發酵培養基的250ml三角瓶中，在與步驟1同樣的條件下搖瓶培 養，發酵完畢，用同樣方法取出5粒固定化細胞顆粒，繼續下一批培養。按此方法連續培養13批。3、分離提取唾液酸將步驟2每批培養得到的發酵液中的固定化細胞顆粒取出后，將剩余發酵液離 心，取上清液經超濾濃縮后，加入濃度為291g/L的硫酸銨水溶液使超濾濃縮后的上清液達 到50%飽和度，在0°C進行沉淀，取上清再離心，得到的上清液即為唾液酸。
4、唾液酸含量的測定將所得的唾液酸進行含量測定，方法如下R-試劑將間苯二酚0. 2ml溶解在IOml水中，并力卩入80ml濃HCL和 0. 25ml0. lmol/L的硫酸銅，用水定容到100ml。取0.1ml步驟3得到的唾液酸，加1.9ml蒸餾水，加2ml R-試劑，在沸水中煮 15min，冷卻后加入4ml 丁酸丁酯正丁醇(體積比為85 15)，劇烈振蕩，并在冰水中冷卻 lOmin，離心(1000g，5min)，將有機相轉到Icm比色杯中，以未加入樣品的為對照，在580nm 處測光密度。測定結果表明，每批培養所得的發酵液中的唾液酸的含量沒有明顯的變化(表 1)，沒有出現唾液酸的含量下降趨勢。具體的數據如下表1發酵液中的唾液酸的含量
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權利要求
一種固定化大腸桿菌細胞，是通過包括如下步驟的方法得到的1)將聚乙烯醇水溶液和海藻酸鈉水溶液混合，得到I液；2)將步驟1)得到的I液與大腸桿菌菌懸液混合，得到II液；3)將步驟2)得到的II液滴加到氯化鈣和硼酸的混合水溶液中，放置，得到固定化大腸桿菌細胞。
2.根據權利要求1中所述的固定化大腸桿菌細胞，其特征在于 所述大腸桿菌菌懸液是大腸桿菌的生理鹽水溶液；所述將步驟1)得到的I液與大腸桿菌菌懸液混合的體積比為10 1 ； 所述II液中，聚乙烯醇、海藻酸鈉和大腸桿菌的配比為Ig聚乙烯醇0. Ig海藻酸 鈉IX IO8CFU大腸桿菌-Ig聚乙烯醇0. Ig海藻酸鈉IXlO9CFU大腸桿菌，具體 為Ig聚乙烯醇0. Ig海藻酸鈉IXlO8CFU大腸桿菌或Ig聚乙烯醇0. Ig海藻酸 鈉1 X IO9CFU大腸桿菌；所述步驟3)中所述II液的溫度為38°C -42°C，具體為38°C、40°C或42°C ；所述氯化鈣 和硼酸的混合水溶液的溫度為4°C ；所述II液與所述氯化鈣和硼酸的混合水溶液的體積比 為 1 50。
3.根據權利要求1或2所述的固定化大腸桿菌細胞，其特征在于 所述聚乙烯醇的數均分子量為1750g/mol ；所述I液中聚乙烯醇的濃度為100g/L，海藻酸鈉的濃度為10g/L ； 所述大腸桿菌菌懸液中菌濃度為lX108CFU/ml-lX109CFU/ml，具體為lX108CFU/ml 或 1 X 109CFU/ml ；所述氯化鈣和硼酸的混合水溶液中氯化鈣的濃度為20g/L，硼酸的濃度為40g/L。
4.根據權利要求1-3中任一所述的固定化大腸桿菌細胞，其特征在于所述放置的方法為先在25°C放置4小時，然后在4°C下放置16小時-20小時，具體為 16小時、18小時或20小時；所述滴加的方法為用注射器滴加；所述注射器的針頭直徑為0. 4mm。
5.根據權利要求1-4中任一所述的固定化大腸桿菌細胞，其特征在于所述大腸桿菌 為大腸桿菌菌種C8。
6.根據權利要求1-5中任一所述的固定化大腸桿菌細胞，其特征在于所述固定化大 腸桿菌細胞的直徑為2mm-4mm。
7.制備唾液酸的方法，是將權利要求1-6中任一所述的固定化大腸桿菌細胞發酵培 養，得到唾液酸。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述發酵培養后，包括如 下提取步驟將所述發酵培養后得到的發酵液中的固定化大腸桿菌細胞取出后，將剩余的 發酵液離心，取上清液經超濾濃縮后，加入硫酸銨水溶液，在0°C進行沉淀，取上清再離心， 得到的上清液為唾液酸；所述發酵液為發酵容器內的所有物質。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于 所述發酵培養的培養基由以下成分組成山梨醇、硫酸銨、胰蛋白胨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂和水； 以上成分在所述培養基中濃度分別為山梨醇25g/L、硫酸銨5g/L、胰蛋白胨15g/L、磷酸氫二鉀20g/L和硫酸鎂0. 4g/L ； 所述發酵培養的溫度為37°C ； 所述發酵培養的PH值為7.8; 所述發酵培養的時間為65小時；所述發酵培養中固定化大腸桿菌細胞的用量為5粒-15粒所述固定化大腸桿菌細胞 /50ml發酵培養基，具體為5粒所述固定化大腸桿菌細胞/50ml發酵培養基、10粒所述固定 化大腸桿菌細胞/50ml發酵培養基或15粒所述固定化大腸桿菌細胞/50ml發酵培養基。
10.權利要求1-6中任一所述的固定化大腸桿菌細胞在制備唾液酸中的應用。
全文摘要
本發明公開了制備唾液酸的方法和專用固定化大腸桿菌細胞。本發明所提供的固定化大腸桿菌細胞，是通過包括如下步驟的方法得到的1)將聚乙烯醇水溶液和海藻酸鈉水溶液混合，得到I液；2)將步驟1)得到的I液與大腸桿菌菌懸液混合，得到II液；3)將步驟2)得到的II液滴加到氯化鈣和硼酸的混合水溶液中，放置，得到固定化大腸桿菌細胞。本發明所提供的制備唾液酸的方法，是將所述固定化大腸桿菌細胞發酵培養，得到唾液酸。本發明所提供的制備唾液酸的固定化大腸桿菌細胞和發酵方法，可將固定化大腸桿菌細胞連續培養10批以上，且大腸桿菌產唾液酸的能力不下降，不需另制備菌種種子液，具有省時、省料、提高產率和降低成本等的優點。
文檔編號C12N11/08GK101979534SQ20101052112
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月21日 優先權日2010年10月21日
發明者張國青, 楊敬, 石家驥, 鈔亞鵬, 錢世鈞 申請人:中國科學院微生物研究所