專利名稱：一株沙門氏菌噬菌體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株噬菌體菌株及其應用，特別涉及一株沙門氏菌(Salmonella)強 裂解性噬菌體PSA-6在預防食品及控制食品加工環境凈化方面的應用。
背景技術：
沙門氏菌(Salmonella)是一種常見的人獸共患病原菌，為人類食物中毒引起胃 腸炎的主要病原菌之一，在醫學、獸醫和公共衛生上均有十分重要的意義。WHO將沙門氏菌 列入具有嚴重危害的食物傳播性病原。目前，在我國發生的各類細菌性食物中毒中，由沙門 氏菌污染而引起的食物中毒屢居首位。據資料統計，由沙門氏菌引起的食品安全事故占我 國細菌性食物中毒的70% 80%。由此可見，沙門氏菌等微生物污染已對我們的食品安全 構成了主要的威脅。而預防和控制這類細菌最常用的方法是采用抗生素，但使用抗生素易在食品中殘 留，長期使用還會使沙門氏菌產生耐藥性，因此，亟待研究開發一種新型的療法和產品，以 解決和應對細菌對抗生素耐藥性問題，以控制食物細菌性污染。噬菌體是一類細菌依賴性病毒，可以吞噬、侵染細菌，并在菌體內繁殖使細菌裂解 而殺滅細菌。其被發現于1個世紀以前，前蘇聯和東歐的許多國家臨床使用噬菌體已有80 多年經驗。但隨抗生素的發現，科學家幾乎停滯了對噬菌體的研究。現今，隨著耐藥菌株日 益顯現和抗生素的使用弊端，噬菌體又被科學家重新認識并利用其可以特異性裂解病原菌 的特性，開展新的細菌性感染治療途徑。噬菌體在溶解其特異性宿主細菌時非常有效，且殺 死細菌的機制與抗生素不同，不易產生耐藥性和殘留，是一種潛在的新型抗菌劑。
發明內容
本發明的目的在于提供一種對沙門氏菌(Salmonella)有強裂解性的噬菌體。本發明的另一目的是針對目前食品中沙門氏菌污染嚴重、給人類健康帶來一定 的危害等問題，提供一種新的防治產品和防治手段，開發一種新的對沙門氏菌引起的食品 污染有顯著防治效果的單一或組合藥物產品和防治方法。該噬菌體PSA-6可以特異性的滅 活沙門氏菌，為工業化生產噬菌體殺菌劑提供噬菌體來源。本發明的目的是這樣實現的一株沙門氏菌噬菌體，其特征在于保藏號為 CCTCCM 2010226，該噬菌體命名為 PSA-6，其對沙門氏菌 ATCC 13076、ATCC 13311 和 CVCC 2184都有裂解作用；該噬菌體具有呈正多面體的頭部結構和可伸縮性的尾部，頭部直徑約64nm，尾部 長約114nm;噬菌體株在固體培養基上可以形成較大透亮空斑，周圍無暈環，邊緣清晰規 則，直徑為1 2mm;取純化的噬菌體顆粒，用蛋白酶K消化噬菌體衣殼，釋放出核酸，酚氯 仿抽提，溶解定量后分別采用Dnase I, Rnase A及限制性核酸內切酶Hind III酶切噬菌體 基因組核酸，酶切圖譜顯示該噬菌體核酸是雙鏈DNA分子(dsDNA)；根據國際病毒分類委員 會(ICTV) 2005年發表的《病毒分類一國際病毒分類委員會第八次報告》為標準，該噬菌體應屬于肌尾病毒科。在本發明中所述的噬菌體在30 60°C中放置60min，其活性穩定，在70°C中放 置60min效價降低兩個數量級，在80°C中則失活；pH為4時，其效價降低約兩個數量級；pH 為5. 0 10. 0時，其效價與初始效價無顯著性差異。一種上述噬菌體的應用，其特征在于將沙門氏菌噬菌體純化后，用于抑制沙門氏菌。在所述的噬菌體的應用中將獲得的噬菌體用于控制食品中沙門氏菌的污染。在所述的噬菌體的應用中將噬菌體用水稀釋后，作為噴灑液或淋洗液，用于對食 品的生產環境或生產器具或相應的生產設備進行噴灑消殺，用于控制沙門氏菌對所述的環 境或器具或設備的污染。在所述的噬菌體的應用中所述食品是指由糧食、肉類、蔬菜、蛋類中擇一的加 工制品，或由它們組合的加工制品。在所述的噬菌體的應用中所述食品是指水果或乳類，或由它們擇一加工或組 合加工后獲得的制品，所述的制品為固體類或液體類。本發明的優點在于沙門氏菌噬菌體對沙門氏菌具有較強的裂解活性，且不會產 生耐藥菌株的特點；是一種新型的控制食品中食源性病原菌污染的產品和手段；經小鼠試 驗，沙門氏菌噬菌體毒副作用小，安全性高；由于沙門氏菌噬菌體具有較好的親水相，容易 配制成噴灑液或淋洗液，對環境或器具進行消殺。
圖1為PSA-6噬菌體電鏡圖；圖2為PSA-6噬菌體雙層平板；圖3為PSA-6噬菌體酶切圖；圖4不同溫度對PSA-6噬菌體的作用結果；圖5不同pH條件對PSA-6噬菌體的作用結果；圖6噬菌體PSA-6裂解沙門氏菌的陽性結果，其中A =ATCC 13076 ；B =ATCC 13311 ；C =CVCC 2184。
具體實施例方式實施例1、噬菌體PSA-6的分離制備本發明中的糞液污水樣品采自江蘇省農業科學院獸醫所動物實驗場；宿主菌為腸炎沙門氏菌ATCC 13076。將糞液污水樣品經雙層濾紙過濾，8000rpm離心20min，再分別用0. 45 μ m和 0. 22 μ m濾膜過濾上清。取50mL上清，加入500 μ 1噬菌體宿主菌(沙門氏菌)過夜培養物，再加入CaCl2 母液至終濃度ImM混勻后，加入20mL LB培養基，放置于37°C培養12 16h。次日，取上述 培養物以12000rpm離心lOmin，取上清并加入0. 3%氯仿，形成噬菌體原液。取三塊1. 5%的普通營養瓊脂平板，標記為1、2和3，分別吸取宿主菌液0. ImL滴 于正中央，用涂棒將菌液均勻地涂開，5min后，平板1滴加0. 05mL噬菌體原液，平板2滴加0.05mL0. 85%生理鹽水，平板3不滴加任何溶液，待自然晾干后，置于37°C溫箱培養IOh后， 觀察三塊平板的變化。對上述鑒定后含有噬菌體的水樣進行以下操作取噬菌體原液0. lmL，進行10倍 稀釋，取IO2UO4和IO6稀釋液各0. ImL與過夜培養的宿主菌液0. ImL混勻，室溫作用15min 后，加入約4mL 0.7% LB培養基，混勻后迅速傾倒入LB培養基平板上層，搖勻平置5min，待 其凝固，置于37°C培養1 后觀察，獲得形成噬菌斑的雙層平板。實施例2、噬菌體的擴增培養和純化在形成噬菌斑的雙層平板上，用移液器的槍頭挑取直徑較大的單個噬菌斑，接種 于3 5mL LB培養基中，加入噬菌體宿主菌液0. lmL，混勻，室溫作用15min，37°C培養10 14h, 12000rpm, 4°C，離心 IOmin,取上清，加入 0. 3 %氯仿。取ImL新鮮培養的宿主菌，加0. ImL噬菌體裂解液(以單個噬菌體培養物與宿主 菌分別按照1 1、1 10和1 100的比例)。37°C溫育20min，使噬菌體顆粒吸附于宿 主菌；加入IOOmL LB液體培養基，再加入CaCl2母液至終濃度ImM，37°C搖振培養12 16h， 12000rpm, 4°C，離心lOmin，取上清，得到噬菌體裂解液。在裂解液中加入RNase A、DNase I 至 1 μ g/mL，37°C溫育 30min ；加 9. 3g PEG 8000,5. 8g NaCl，搖勻至溶解，冰浴Ih或4°C過夜；4°C離心IOOOOrpm lOmin，去上清液； 加2mL SM液，充分洗滌管壁及沉淀，室溫作用Ih;通過加入等體積的氯仿抽提，溫和振蕩 30s ；4°C，5000rpm離心IOmin以分離有機相和親水相，回收含有噬菌體顆粒的親水相，獲得 純化的噬菌體，雙層平板檢測純化噬菌體(圖2)。純化的噬菌體在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC M 2010226，保 藏日期為2010年9月12日，保藏單位地址中國武漢武漢大學，郵編430072。噬菌體具有以下微生物學特征1.形態學特性在透射電子顯微鏡下觀察噬菌體顆粒(見圖1)，該噬菌體具有呈正多面體的頭部 結構和可伸縮性的尾部，頭部直徑約64nm，尾部長約114nm。2.培養學特性噬菌體菌株在固體培養基上可以形成較大透亮空斑，周圍無暈環，邊緣清晰規則， 直徑為1 2mm(見圖2)。3.噬菌體基因組核酸類型鑒定取純化的噬菌體顆粒，用蛋白酶K消化噬菌體衣殼，釋放出核酸，酚氯仿抽提，溶 解定量后分別采用Dnase I.Rnase A及限制性核酸內切酶Hind III酶切噬菌體基因組核酸， 根據酶切圖譜(見圖3)分析得出，該噬菌體核酸是雙鏈DNA分子(dsDNA)。根據國際病毒分類委員會(ICTV) 2005年發表的《病毒分類-國際病毒分類委員會 第八次報告》中對噬菌體的新分類方法，根據該噬菌體的形態學特征判斷，應屬于肌尾病毒 科，我們把它命名為^ilmonella phage PSA-6。實施例3、溫度及pH對PSA-6噬菌體穩定性的影響以實施例2的PSA-6噬菌體為基礎，配制成6X K^pfu/mL純化噬菌體，分別取1.OmL在30 V、40°C、50 V、60°C、70 V、80°C、90 V水浴作用Ih后，提取樣品并將其冰浴冷卻 后測其效價，結果如圖4所示，PSA-6噬菌體在30 60°C分別作用Ih后，其活性無顯著變化；70°C作用Ih后，活性有所降低；80°C作用后，噬菌體全部被滅活。以實施例2的PSA-6噬菌體為基礎，配制成8 X l(fpfu/mL純化噬菌體備用；配制 pH值分別為3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. 0,9. 0,10. 0,11. 0的蛋白胨水備用，將備用的PSA-6 噬菌體分別與備用的不同PH值按照1 9的體積比混合，37°C水浴作用池后分別檢測它們 的效價，結果如圖5所示，PSA-6噬菌體在pH為3和11時，噬菌體全部被滅活；pH為4時， 其效價降低約兩個數量級；PH為5. 0 10. 0時，其效價與初始效價無顯著性差異。實施例4、噬菌體宿主譜分析以實施例2的PSA-6噬菌體為基礎，配制成效價為l(fpfu/mL的純化噬菌體備用。試驗選擇5種沙門氏菌標準菌株和20從食品中分離的沙門氏菌菌株，來做噬菌體 PSA-6的宿主譜分析，具體操作如下分別取所述的25株沙門氏菌的過夜培養物100μ 1，滴 加在1. 5% LB培養基平板中央，用涂棒分別將它們涂制成均勻的菌苔。然后將每個平板平 均分成兩個區域，其中一個區域，取10 μ 1噬菌體PSA-6滴加在菌苔表面，另一個區域滴加 10 μ 1生理鹽水作對照，待液滴干燥后倒置于37°C培養12 16h，觀察結果。結果顯示，PSA-6噬菌體對其中的3個沙門氏菌菌株ATCC 13076、ATCC 13311和 CVCC 2184都具有很好的裂解作用。如圖6所示，其中A為腸炎沙門氏菌ATCC 13076 ；B為 鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311 ;C為禽沙門氏菌CVCC 2184。實施例5、噬菌體安全性實驗
8周齡雌性SPF級BALB/c小鼠，27g士 2g，共20只，購自揚州大學比較醫學中心。隨 機分為2組，每組10只；其中一組口服噬菌體PSA-6 109pfu/0. ImL/只(實施例2提供)； 對照組口服等體積PBS。連續口服14d后，每組脫勁致死5只小鼠，觀察內臟、消化道及黏膜 變化情況；每組剩余的5只小鼠繼續飼喂，每天取其糞便檢測噬菌體數量變化。結果顯示，此劑量噬菌體對小鼠日常行為沒有影響，解剖檢查未見異常，且在口服 噬菌體結束兩天后，在小鼠糞便中檢測不到噬菌體。實施例6、噬菌體在固體食品中的殺菌效果實驗此試驗選取火腿腸作為試驗樣品，將火腿腸切為2X2X2cm小塊，高壓滅菌備用。 以腸炎沙門氏菌ATCC 13076配制效價為5 X 105Cfu/mL的宿主菌，備用。以實施例2的噬菌 體 PSA-6 為基礎，制備 5XKfpfu/mUMOI 10)禾口 5X IO8 (Μ0Ι 1000)的 PSA-6 噬菌體樣品， 備用。在無菌環境下，先將沙門氏菌菌液以20ul滴于火腿腸小塊表面，約5min后，再分成實 驗組和對照組，其中，將不同濃度的PSA-6噬菌體各20ul分別滴于已滴加過細菌的實驗組 火腿塊表面，對照組則滴加20ul的PBS ；將制備好的樣品置于4°C，于lh、2hjh、24h和4 分別將實驗組和對照組單獨對照，檢測沙門氏菌的數量。結果如表1所示，與細菌對照組相比較，4°C作用Mi后，MOI 10和MOI 1000的噬 菌體幾乎均可以完全殺滅沙門氏菌，且能夠對食品提供長久的保護。表1噬菌體在固體食品中的殺菌效果實驗
權利要求
1.一株沙門氏菌噬菌體，其特征在于保藏號為CCTCC M 2010226，該噬菌體對沙門 氏菌 ATCC 13076, ATCC 13311 和 CVCC 2184 有裂解作用；該噬菌體具有呈正多面體的頭部結構和可伸縮性的尾部，頭部直徑約64nm，尾部長約 114nm;噬菌體株在固體培養基上可以形成較大透亮空斑，周圍無暈環，邊緣清晰規則，直徑 為1 2mm;取純化的噬菌體顆粒，用蛋白酶K消化噬菌體衣殼，釋放出核酸，酚氯仿抽提， 溶解定量后分別采用Dnase I、foiaseA及限制性核酸內切酶Hind III酶切噬菌體基因組核 酸，酶切圖譜顯示該噬菌體核酸是雙鏈DNA分子(dsDNA)；該噬菌體應屬于肌尾病毒科。
2.根據權利要求1所述的一株沙門氏菌噬菌體，其特征在于所述的噬菌體在30 600C中放置60min，其活性穩定，在70°C中放置60min效價降低兩個數量級，在80°C中則失 活；PH為4時，其效價降低約兩個數量級；pH為5. 0 10. 0時，其效價與初始效價無顯著性 差異。
3.—種如權利要求1或2所述噬菌體的應用，其特征在于將沙門氏菌噬菌體純化后， 用于殺滅沙門氏菌。
4.根據權利要求3所述的噬菌體的應用，其特征在于將獲得的噬菌體用于控制食品 中沙門氏菌的污染。
5.根據權利要求3所述的噬菌體的應用，其特征在于將噬菌體用水稀釋后，作為噴灑 液或淋洗液，用于對食品的生產環境或生產器具或相應的生產設備進行噴灑消殺，用于控 制沙門氏菌對所述的環境或器具或設備的污染。
6.根據權利要求4或5所述噬菌體的應用，其特征在于所述食品是指由糧食、肉類、 蔬菜、蛋類中擇一的加工制品，或由它們組合的加工制品。
7.根據權利要求4或5所述噬菌體的應用，其特征在于所述食品是指水果或乳類， 或由它們擇一加工或組合加工后獲得的制品，所述的制品為固體類或液體類。
全文摘要
本發明一株沙門氏菌噬菌體，其保藏號為CCTCC No:M 2010226，該噬菌體對沙門氏菌ATCC 13076、ATCC 13311和CVCC 2184有裂解作用；本發明將沙門氏菌的噬菌體用于控制沙門氏菌對食品的污染，以及用于控制沙門氏菌對食品生產環境和生產器具以及相應的設備表面的細菌性污染。
文檔編號C12N7/00GK102041247SQ201010508259
公開日2011年5月4日 申請日期2010年10月15日 優先權日2010年10月15日
發明者包紅朵, 張輝, 王冉 申請人:江蘇省農業科學院