專利名稱：利用茉莉酸促進雨生紅球藻生產蝦青素的方法
技術領域：
本發明提供一種利用茉莉酸促進雨生紅球藻生產蝦青素的方法，屬于生物技術領 域。
背景技術：
天然蝦青素(3，3' _ 二羥基_4，4' _ 二酮基_β，β'-胡蘿卜素，C4tlH52O4)是 一種脂溶性的次生類胡蘿卜素，是目前自然界中已發現的最強抗氧化劑。有研究顯示蝦青 素的抗氧化活性顯著高于β-胡蘿卜素(10倍以上)、花青素0PC(17倍)玉米黃素、角黃 質、維生素C和維生素E(550倍)等常見抗氧化物質。超強的抗氧化活性賦予了蝦青素突 出的生理功能，如提高動物免疫力、抑制腫瘤、清除自由基和活性氧等，不僅可以用作珍貴 水產動物養殖的餌料添加劑、人類的食品添加劑，在藥品、化妝品和高級營養保健品等領域 也具有非常廣闊的應用潛力。目前國際上已具備的蝦青素生產工藝有化學合成和生物提取 兩種，但化學合成的蝦青素在結構、功能、應用和安全性等方面均較天然蝦青素遜色。動物 和人體實驗的結果已經證明，天然蝦青素無任何毒副作用，對人體絕對安全。雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是一種雙鞭毛單細胞綠藻，在多種脅迫 條件下，如強光、高溫、營養鹽(氮、磷)饑餓、高鹽等，能夠迅速合成并大量積累蝦青素，其 積累量遠遠高于從水產品廢棄物(蝦、蟹等甲殼)中提取和利用紅發夫酵母發酵生產蝦青 素的產量，因此被公認是目前自然界中生產天然蝦青素最理想的工具。美國FDA認為從雨 生紅球藻中提取的天然蝦青素使用安全可靠，對動物和人類使用過程中絕對不產生任何毒 副作用，已經通過了富含蝦青素的雨生紅球藻安全性論證，并明文禁止化學合成的蝦青素 進入保健品市場。國外已于上世紀90年代末在美國和瑞典的少數幾家大公司實現了利用 雨生紅球藻大規模生產天然蝦青素，并在技術上形成了壟斷，從而導致天然蝦青素的國際 市場價格居高不下。國內對利用雨生紅球藻生產蝦青素的研究始于本世紀初，目前還處于 實驗室階段，至今尚未具備規模化生產的相關技術和專利，同時存在許多難以解決的技術 問題。過去關于刺激雨生紅球藻積累蝦青素的誘導因子研究大多集中在物理因子(如 紫外線、X、Y射線、激光輻射等)和化學因子(如鹽脅迫、重金屬離子、亞硝基胍、疊氮化合 物等)，同上述誘導因子相比較，植物激素具有用量小、效益高、殘毒少等優勢。為一種抗逆 激素，茉莉酸(JA)對植物生長發育和逆境條件下的抗性起著重要調節作用，而雨生紅球藻 正是在逆境脅迫條件下才能大量積累蝦青素。外源應用茉莉酸能夠激發植物防御基因的表 達，誘導植物的化學防御，產生與機械損傷和昆蟲取食相似的效果，并且在作用過程中與其 它植物激素如脫落酸、水楊酸、乙烯等有著密切聯系，因此茉莉酸應該會促進雨生紅球藻大 量積累蝦青素。目前，國內市場上已經有一些生產蝦青素的相關專利技術，如“從甲殼質、殼聚糖 生產廢水中回收蝦青素和蛋白質的方法”(CN200510047267. 7)，主要是從甲殼質、殼聚糖生 產廢水中回收蝦青素，雖然能變廢為寶，但是蝦青素的提取效率較低。“一種培養雨生紅球藻生產蝦青素的方法(CN02138827.X)公開了一種培養雨生紅球藻生產蝦青素的方法，包 括培養基配方、一步法生產工藝、培養基的循環使用和用二氧化碳調節培養液PH值誘導紅 球藻孢子的形成及蝦青素積累的方法。寧波大學的“大規模培養雨生紅球藻和轉化蝦青素 的裝置及其方法”(200610154678. 0)公開了一種大規模培養雨生紅球藻和轉化蝦青素的裝 置及方法，整個培養裝置由設置在固定架上的光生物反應器系統、充氣裝置、培養液灌輸裝 置和靜細胞收集裝置組成，固定架上設置浮沉控制裝置；中山大學的“光生物反應器促進雨 生紅球藻生長增殖及調控蝦青素合成和積累的方法”(CN02134387. X)，涉及幾種可調控的 全天候封閉式大規模運行系統光生物反應器培養和促進雨生紅球藻生長增殖及提高種群 密度和調控細胞內次生代謝產物蝦青素合成和積累的方法。“產蝦青素的藻類和酵母混合 培養發酵生產蝦青素的方法”(CN03105314. 9)，公開了一種產蝦青素的藻類和酵母混合培 養發酵生產蝦青素的方法，屬于生物法生產蝦青素技術。該方法是在裝有特定培養基的反 應器內，同時接種包括雨生紅球藻在內的藻類和包括紅發夫酵母在內的酵母進行混合培養 發酵生產蝦青素。上述相關專利技術雖然先進，但均涉及光生物反應器等專業設施，對設備 要求比較高，技術工藝比較復雜，操作有難度，而且費用很高，這無疑增加了生產成本和技 術推廣的難度。
發明內容
本發明的目的是提供一種能夠克服現有技術中存在的缺陷、工藝簡單、成本低且 能顯著提高雨生紅球藻生產蝦青素效率的利用茉莉酸促進雨生紅球藻生產蝦青素的方法。 其具體的技術方案為—種利用茉莉酸促進雨生紅球藻生產蝦青素的方法，其特征在于采用如下步驟(1)制備藻液培養雨生紅球藻細胞到對數生長期，獲得誘導培養的藻液；(2)積累蝦青素先用2倍體積的無水乙醇溶解茉莉酸，再用超純水配制成20mg/ L的茉莉酸母液，將茉莉酸母液添加到上述已培養好的藻液中至茉莉酸終濃度為0. 95 1. 05mg/L ；然后將上述添加了茉莉酸的藻液在25 28°C、光強4500 50001x、日光燈連續 光照及營養鹽饑餓的復合脅迫條件下進行培養，直至光學顯微鏡下觀察到雨生紅球藻細胞 完全變紅，此時蝦青素產量達到最高。所述的利用茉莉酸促進雨生紅球藻生產蝦青素的方法，步驟(1)中，雨生紅球藻 采用712藻株，采用MCM培養基，在溫度19 21 °C，光強1500 18001x，光暗比為12h/12h 的條件下培養，日光燈下培養至雨生紅球藻細胞達到對數生長期，細胞濃度達IO8個/mL。所述的利用茉莉酸促進雨生紅球藻生產蝦青素的方法，茉莉酸采用SIGMA公司生 產的茉莉酸。本發明與現有技術相比，其優點是1、本發明簡單易行、成本低廉，原材料雨生紅球藻細胞可以按常規方法自行培養。2、本發明能大幅提高雨生紅球藻中蝦青素的積累效率，實驗證明，添加0.95 1.05mg/L茉莉酸處理組比空白對照組雨生紅球藻細胞完成蝦青素積累的周期縮短了 45. 5 50. 0%，蝦青素產量比空白對照提高了 34. 4 36. 9 %，達16. 04 16. 35mg/L藻 液。
具體實施例方式實施例1 步驟1、制備藻液雨生紅球藻選用712藻株，采用MCM培養基，在溫度19 °C、 15001x光強、光暗比為12h/12h的條件下培養，日光燈下培養至雨生紅球藻細胞達到對數 生長期，細胞濃度達IO8個/mL，即獲得誘導培養的藻液；步驟2、誘導雨生紅球藻積累蝦青素茉莉酸采用SIGMA公司生產的茉莉酸。先用 2倍體積的無水乙醇溶解茉莉酸，再用超純水配制成20mg/L的茉莉酸母液，將茉莉酸母液 添加到上述已培養好的藻液中至茉莉酸濃度為0. 95mg/L ；然后將上述添加了茉莉酸的藻 液與空白對照組藻液同時在25°C、光強45001x、日光燈連續光照及營養鹽饑餓的復合脅迫 條件下進行培養，24天后雨生紅球藻細胞完全變紅即完成蝦青素積累，此時蝦青素含量達 到最高。實施例2:步驟1、制備藻液雨生紅球藻選用712藻株，采用MCM培養基，在溫度20°C、光強 18001x、光暗比為12h/12h的條件下培養，日光燈下培養至雨生紅球藻細胞達到對數生長 期，細胞濃度達IO8個/mL，即獲得誘導培養的藻液；步驟2、誘導雨生紅球藻積累蝦青素茉莉酸采用SIGMA公司生產的茉莉酸。先用 2倍體積的無水乙醇溶解茉莉酸，再用超純水配制成20mg/L的茉莉酸母液，將茉莉酸母液 添加到上述已培養好的藻液中至茉莉酸濃度為1. Omg/L ；然后將上述添加了茉莉酸的藻液 與空白對照組藻液同時在26°C、光強48001x、日光燈連續光照及營養鹽饑餓的復合脅迫條 件下進行培養，23天后雨生紅球藻細胞完全變紅即完成蝦青素積累，此時蝦青素含量達到 最尚。實施例3:步驟1、制備藻液雨生紅球藻選用712藻株，采用MCM培養基，在溫度21°C、光強 16001x、光暗比為12h/12h的條件下培養，日光燈下培養至雨生紅球藻細胞達到對數生長 期，細胞濃度達IO8個/mL，即獲得誘導培養的藻液；步驟2、誘導雨生紅球藻積累蝦青素茉莉酸采用SIGMA公司生產的茉莉酸。先用 2倍體積的無水乙醇溶解茉莉酸，再用超純水配制成20mg/L的茉莉酸母液，將茉莉酸母液 添加到上述已培養好的藻液中至茉莉酸濃度為1. 05mg/L ；然后將上述添加了茉莉酸的藻 液與空白對照組藻液同時在28°C、光強50001x、日光燈連續光照及營養鹽饑餓的復合脅迫 條件下進行培養，22天后雨生紅球藻細胞完全變紅即完成蝦青素積累，此時蝦青素含量達 到最高。采用以下方法對本發明中含有茉莉酸的藻液及空白對照組藻液定期進行顯微觀 察，具體是每天取少量藻液樣品在光學顯微鏡下觀察藻細胞的顏色變化以及蝦青素積累情 況；然后按以下步驟對本發明含有茉莉酸的藻液及空白對照組藻液中的蝦青素含量進行測 定①每三天各取出3ml上述兩種藻液，5000r/min離心5min，棄上清得到藻細胞沉淀；② 分別向兩種藻細胞沉淀加入5% KOH和30%甲醇破壞葉綠素5min后，5000r/min離心收集 沉淀；③在收集的沉淀中分別加入3ml 二甲亞砜，利用超聲波破壁后(3次15sec破壁/5sec 間歇，輸出功率40W)，于70°C水浴中處理lOmin，抽提至藻體發白；④然后lOOOOr/min離心 lOmin，分別取上清于490nm下測定OD值；⑤按公式C(mg/L) = (4. 5AX490XVa)/Vb計算兩種上清中的蝦青素含量，其中A表示OD值，Va表示二甲亞砜的體積，Vb表示藻液體積。
結果表明空白對照組雨生紅球藻細胞完全變紅的時間為44天，此時蝦青素含 量為11.94mg/L藻液，茉莉酸處理組比空白對照組雨生紅球藻細胞完全變紅的周期縮短了 45. 5 50%，蝦青素產量卻比對照提高了 34. 4 36. 9%，達16. 04 16. 35mg/L藻液。
權利要求
一種利用茉莉酸促進雨生紅球藻生產蝦青素的方法，其特征在于采用如下步驟(1)制備藻液培養雨生紅球藻細胞到對數生長期，獲得誘導培養的藻液；(2)積累蝦青素先用2倍體積的無水乙醇溶解茉莉酸，再用超純水配制成濃度為20mg/L的茉莉酸母液，將茉莉酸母液添加到上述已經培養好的藻液中至茉莉酸終濃度為0.95～1.05mg/L；然后將上述添加了茉莉酸的藻液在25～28℃、光強4500～5000lx、日光燈連續光照及營養鹽饑餓的復合脅迫條件下進行培養，直至光學顯微鏡下觀察到雨生紅球藻細胞完全變紅，即完成蝦青素積累，此時蝦青素產量達到最高。
2.根據權利要求1所述的利用茉莉酸促進雨生紅球藻生產蝦青素的方法，其特征在 于步驟(1)中，雨生紅球藻采用712藻株，采用MCM培養基，在溫度19 21 °C，光強1500 18001x，光暗比為12h/12h的條件下培養，日光燈下培養至培雨生紅球藻細胞達到對數生 長期，此時細胞濃度達IO8個/mL。
3.根據權利要求1所述的利用茉莉酸促進雨生紅球藻生產蝦青素的方法，其特征在 于茉莉酸采用SIGMA公司生產的茉莉酸。
全文摘要
本發明提供一種利用茉莉酸促進雨生紅球藻生產蝦青素的方法，采用如下步驟(1)制備藻液培養雨生紅球藻細胞到對數生長期，獲得誘導培養的藻液；(2)積累蝦青素先用2倍體積的無水乙醇溶解茉莉酸，再用超純水配制成濃度為20mg/L的茉莉酸母液，將茉莉酸母液添加到上述已培養好的藻液中至茉莉酸終濃度為0.95～1.05mg/L；然后將上述添加了茉莉酸的藻液在25～28℃、光強4500～5000lx、日光燈連續光照及營養鹽饑餓的復合脅迫條件下進行培養，直至光學顯微鏡下觀察到雨生紅球藻細胞完全變紅，即完成蝦青素積累，此時蝦青素產量達到最高。本發明簡單易行、成本低廉、能大幅縮短雨生紅球藻細胞完全變紅的時間，并顯著增加蝦青素產量，從而大大提高雨生紅球藻生產蝦青素的效率。
文檔編號C12R1/89GK101974598SQ20101050595
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月14日 優先權日2010年10月14日
發明者葉乃好, 孟春曉, 王依濤, 羅韜, 高政權 申請人:山東理工大學