專利名稱：固定化漆酶的制備方法
技術領域：
本發明屬于固定化酶制備技術領域，具體涉及固定化漆酶的制備方法。
背景技術：
日本學者田彥六郎在漆樹樹液中發現能使“樹漆”氧化硬化的酶，后來貝特蘭德 (G. E. Bertrand, 1894)詳細地研究了東南亞所產漆中的酶，命名為漆酶。漆酶(Laccases) 是借助氧將對苯二酚(氫醌)氧化成對苯醌的酚氧化酶的一種，亦稱為對苯二酚氧化酶。 漆酶是結合有多個銅離子的蛋白質，屬于銅藍氧化酶，分子量約12萬，含4原子銅，可被 CN-抑制。漆酶存活于空氣中，發生反應后唯一的產物就是水，本質上是一種環保型酶。近 年來，隨著環保意識的逐漸加強，漆酶已成為眾多學者的研究對象。漆酶廣泛分布于真菌、植物和昆蟲中。在真菌中，漆酶存在于子囊菌綱的脈孢菌 (Neurospora)和柄孢殼菌(Podospora)、擔子菌綱的多孔菌(Poly-porus)和半知菌類的 曲霉菌(Aspergillus)等菌種中。目前發現漆酶也廣泛存在于細菌中，如生脂固氮螺菌 (Azospirlllum lipoferum)等。不同來源的漆酶其氨基酸序列的相似性并不高，因此漆酶 分子量的差異很大。漆酶可以催化空氣中的氧直接氧化分解各種酚類染料、氯酚、取代酚、硫酚、芳香 胺、雙酚A等，在漆酶介體(HBT、ABTS等)存在下，漆酶還可以催化降解與木質素相關的 N-取代對苯基二胺、二苯基甲烷、有機磷化合物(農藥)及二惡英等。由于它具有相當廣泛 的底物專一性和較好的穩定性，因此漆酶在治理含酚廢水、紡織印染廢水和造紙工業廢水 以及生物傳感器等方面有著巨大的應用前景。近年來研究發現，漆酶獨特的催化特性使其在生物檢測中有著廣泛的應用，作為 高效的生物檢測器而成為底物、輔酶、抑制劑等成分分析的有效工具和手段。漆酶構成的生 物檢測器主要有二種漆酶電極和漆酶酶標。酶作為蛋白質，具有蛋白質的普通特性(如不能重復利用、對變性劑及毒理作用 的高度敏感性)，在遇到高溫、強酸、強堿時會失去活性，毫無催化功能可言，這些都限制了 漆酶的有效使用，提高了使用成本；而較純凈的漆酶價格很高，也限制了漆酶的使用。近年 來出現的一種新技術就可部分解決這些問題——固定化酶技術。固定化酶(immobilized enzyme)是用物理或化學方法處理水溶性的酶，使之成為 不溶于水或固定于固相載體的但仍具有酶活性的酶衍生物。固定化酶比未固定的酶具有明 顯的優點①有一定的機械強度且穩定性好，可做成各種形狀(如顆粒狀、管狀、膜狀)裝在 反應槽中，便于取出，能連續、反復使用，可大大降低生產成本，還可使催化劑與系統分相， 便于產物的后期分離。②在使用前可充分洗滌，不帶進雜質，對反應影響小。③穩定性提高， 不易失去活性，使用壽命延長，可長期使用與儲藏，并可以再生。④便于自動化操作，同時也 為實現生產的管道化、連續化與自動化提供了可能，便于用電腦控制的連續生產。通常，酶的固定化方法分為物理方法和化學方法，其中，物理方法主要有吸附法、 包埋法和離子吸附法三種。化學方法主要有共價結合法和交聯法兩種。酶的固定化方法固
權利要求
一種固定化漆酶的制備方法，采用有多孔燒結玻璃環，其特征在于，包括以下步驟步驟一、以CuBr2為催化劑，2，2’ 聯吡啶為配體，2 溴丙酸乙酯為自由引發劑，以多孔燒結玻璃環為載體，制備具有甲基丙烯酸縮水甘油酯接枝聚合功能的多孔燒結玻璃環；步驟二、在漆酶溶液中，加入具有甲基丙烯酸縮水甘油酯接枝聚合功能的多孔燒結玻璃環，在30℃條件下震蕩或攪拌16～24小時后，加入戊二醛溶液至最終的質量濃度為1％，室溫下交聯1小時，過濾后純水洗滌，再離心去除表面水分，即得到吸附交聯在多孔燒結玻璃環上的固定化漆酶。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的具有甲基丙烯酸縮水甘油酯 接枝聚合功能的多孔燒結玻璃環的制備具體包括先取多孔燒結玻璃環加至二氯甲烷溶 劑中，攪拌并真空脫氣后，加入三乙胺和引發劑2-溴基異丁酰溴反應24小時，反應結束后 離心分離出固體，用二氯甲烷、四氫呋喃和丙酮溶劑依次洗滌，并于常溫下真空干燥，得鍵 合有引發劑2-溴基異丁酰溴的多孔燒結玻璃環；再將該多孔燒結玻璃環加至環己酮溶劑 中，攪拌并真空脫氣后，加入甲基丙烯酸縮水甘油酯、2，2’_聯吡唳、CuBr2、以及自由引發劑 2_溴丙酸乙酯；然后，通入氮氣驅除反應體系中的空氣，于_5°C 5°C冰浴中抽真空后，升 至室溫再通入氮氣，如此反復除去空氣；最后，在氮氣保護并攪拌下，30°C進行恒溫接枝聚 合反應，反應結束后，將反應體系冷卻至常溫，離心分離反應產物，即得具有甲基丙烯酸縮 水甘油酯接枝聚合功能的多孔燒結玻璃環。
3.根據權利要求1所述的固定化漆酶制備方法，其特征在于，所述漆酶溶液的質量濃 度為2 3%。
全文摘要
本發明公開了一種固定化漆酶的制備方法，是以CuBr2為催化劑，2，2’-聯吡啶為配體，2-溴丙酸乙酯為自由引發劑，以多孔燒結玻璃環為載體，制備具有甲基丙烯酸縮水甘油酯接枝聚合功能的多孔燒結玻璃環；再將該多孔燒結玻璃環加至漆酶溶液中，震蕩或攪拌16～24小時后，加入戊二醛溶液交聯1小時，過濾后純水洗滌，去除未吸附的游離酶，再離心去除表面水分，即得吸附交聯在多孔燒結玻璃環上的固定化漆酶。本發明結合物理吸附法和共價交聯法，取長補、優化配合，制備的固定化漆酶適用于白藜蘆醇二聚體的合成，以及在飲料加工中解決果汁澄清緩慢和長時間儲存所產生的后渾濁問題。
文檔編號C12N11/08GK101974507SQ20101050517
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月12日 優先權日2010年10月12日
發明者尉亞輝, 程亞剛, 郭斌, 馬丁 申請人:尉亞輝;馬丁;程亞剛;郭斌