專利名稱：：一種竹黃菌發酵生產漆酶的方法
技術領域：
：一種竹黃菌發酵生產漆酶(Laccase)的方法，屬于生物工程
技術領域：
。本發明涉及利用竹黃菌株(5iraiasp.)SUPER-H168保藏號為CCTCCNO=M207104，已在ZL200710132510.4公開，通過液態發酵獲得漆酶。
背景技術：
：漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，具有廣泛的底物，不僅能催化氧化多種芳香族化合物，還能降解木質素，去除許多有毒酚類物質如苯氧基類除草劑等的毒性，還可以使多種染料脫色及去除石油工業廢水的毒性；因此在造紙、環保、食品、醫藥衛生、生物檢測等領域具有較大的研究和應用價值，近年來，人們對漆酶的研究越來越深入，其應用范圍也越來越廣泛。漆酶最早是由日本學者Yoshida于1883年在漆樹、Rhusvennicifen)的汁液中發現的，后來由Bertraucl第一次命名為“漆酶(Lacease)”。此后隨著研究的深入，發現漆酶廣泛存在于多種植物，如馬鈴薯、毒萵苣、香蕉、桃子、咖啡豆、苜蓿花等，和部分細菌，如節桿菌(Arthrobacter)和鏈霉菌i^Streptomycete)等，以及各種真菌，如擔子菌iBasidiomycetes)、子囊菌(Ascomycete)和半知菌(Adelomycete)。此夕卜,一些動物腎臟和血清中也有漆酶的發現。按其來源主要分為漆樹漆酶(RhusLaccase)和真菌漆酶(FungalLaccase)兩大類，其中真菌中的白腐菌(White-rotfungi)是漆酶的主要生產者。盡管漆酶在自然界中廣泛分布，但真正具有較高漆酶產量的菌株并不多，其漆酶產量還不能滿足工業生產所需的酶量，且發酵周期較長(714天)。當前用于漆酶生產的菌株主要有黃孢原毛平革菌(PhanerochaetechrysosporiuH色WM(Jrametesversicolor)、彩絨革蓋菌{Coriolushisutus)、雜色云芝{Coriolusversicolor)、血紅密孔菌、Pycnoporussanguineus)以及糙皮側耳、Pleurotusostreatus)等，但目前未見竹黃菌、Shiraiabambusicola)產漆酶的研究報道。竹黃是一種藥用真菌，具有很高藥用價值和保健功效。竹黃發酵生產漆酶具有發酵周期短和酶活力高的優勢，同時發酵過程還可產生高活性的超氧化物歧化酶(SOD)和茈醌色素，開發前景廣闊。
發明內容本發明的目的是，利用竹黃菌株(幼iraiasp.)SUPER-H168，保藏號為CCTCCNO=M207104，已在ZL200710132510.4公開，通過液態發酵法生產漆酶，通過調整各種培養基成份提高漆酶產量。本發明的技術方案一種竹黃菌發酵生產漆酶的方法，出發菌株為竹黃菌株)SUPER-H168，保藏號為CCTCCNO=M207104；液態發酵培養基組成為碳源5-50g/L，氮源5-50g/L,K2HPO42-4g/L,KH2PO42-4g/L,馬鈴薯汁200g/L，用純水配制；液態發酵條件為在發酵罐內裝入發酵罐體積60%_70%(ν/ν)的液態發酵培養基，滅菌冷卻后接入竹黃菌，接種量為5%-10%，種齡為10-48小時，起始ρΗ和發酵過程ρΗ均為自然，發酵溫度為24-32°C，發酵周期為2-5天；在發酵過程中可以添加表面活性劑，以提高漆酶的產量。發酵過程中添加的表面活性劑主要有Tween20,Tween40,Tween60,Tween80、TritonX-100、TritonX-114,TritonX-116,TritonX-405、TX-4、TX-6、TX-9、TX-10、AE0-3、AE0-7、AE0-9、一乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺。最終發酵液中漆酶活力最高可達500U/mL。所述的竹黃菌菌株，能夠同時發酵產漆酶、超氧化物歧化酶SOD和茈醌色素。所述的竹黃菌發酵生產漆酶的方法，可利用的產漆酶碳源為葡萄糖、果糖、可溶淀粉、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、或半乳糖。所述的竹黃菌發酵生產漆酶的方法，可利用的產漆酶的氮源為無機銨鹽、無機硝酸鹽、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米漿、或豆餅粉。所述的竹黃菌發酵生產漆酶的方法，添加Cu2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、Mg2+、Mn2+、Na+、K+可以提高竹黃菌的漆酶產量。最終發酵液中漆酶活力最高可達500U/mL。在漆酶發酵過程中，菌體還會生成茈醌色素，產量最高可達7g/L左右，其中竹紅菌甲素占90%左右，竹紅菌乙素占5%左右。同時發酵過程還能產生SOD酶，酶活達100-200U/mL。漆酶酶活測定是以2，6_二甲氧基酚(DMP)為底物，以每分鐘氧化1μmol的DMP(ε=49.6L/(mmol·cm)所需要的酶量定義為1個酶活力單位，測定方法和活力定義詳見DLitthauer,MJVanVuuren,AVanTonder,F。IWolfaardt(2007)PurificationandkineticsofathermostablelaccasefromPycnoporussanguineus.EnzymeMicrobTechnol,2007，40(4):563568.SOD酶活的測定方法是基于SOD抑制氮藍四唑(NBT)在光下的還原作用。SOD活力測定方法和SOD活力定義詳見Chin-WenLin,Jeng-HuhYangandLieh-ChiSu,(1997)Theextractionandpropertiesofsuperoxidedismutasefromporcineblood,MeatScience,46(3):303-312.茈醌色素的產量采用液相色譜法測定，詳見=Xiao-HuiLianga,Yu-JieCai,Xiang-RuLiao,Kangffu,LeiWang,Da-BingZhangandQiangMeng(2009).IsolationandidentificationofanewhypocrellinA—producingstrainShiraiaspSUPER-H168.MicrobiologicalResearch164(1):9-17.本發明有如下特點(1)用于Laccase發酵的碳源可以是葡萄糖、果糖、可溶淀粉、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖。氮源可以是無機銨鹽、無機硝酸鹽、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、玉米漿、豆餅粉。馬鈴薯汁既可以補充碳源也可以補充氮源，200g/L是指稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水IOOOmL煮沸半個小時，紗布過濾得到濾液，所有濾液加入到培養基中，培養基終體積為1000mL。(2)竹黃菌發酵漆酶可采用機械攪拌或氣升式發酵罐。對于機械攪拌發酵罐，攪拌轉速為70-150r/min，通風量1:0.1-1:0.5v/v/m。對于氣升式發酵罐，通風量為1:0.3-1:1.5v/v/m。通風量數值與單位說明1:0.5v/v/m指1個體積的發酵液每分鐘通0.5體積的無菌空氣。發酵罐體積為5-500L，結合本領域的基本常識可根據生產情況調整發酵罐大小。(3)竹黃菌生產漆酶的過程，伴隨著如下所示的三種母核為基本結構的茈醌色素的生成，其中主要是竹紅菌甲素。同時該菌可產生以此三種母核結構進行基團修飾的多種茈醌類化合物。可在2，3，6，7，11，12，17，18，26，28，29，30，32，36，37，45，46，53，55，56，58，62，63，71，72位置修飾上各種化學基團，如CH3、0CH3、C0CH3、CH(0H)CH3、CH0、0H、H等，這些化學基團之間還可以進一步形成更為復雜的結構。隨著發酵條件的不同，各茈醌色素的產量和比例會略有不同。伴隨SOD產生的茈醌色素母核(4)竹黃菌生產漆酶的過程，伴隨著SOD酶的生成。(5)為了提高漆酶的產量，本發明通過添加表面活性劑，以改善竹黃菌細胞膜的通透性。添加時間為發酵開始后的0-40小時，使發酵液中表面活性劑的濃度達0.1%-2%(w/w)，隨后的發酵不再補加表面活性劑。結果表明所有表面活性劑對于漆酶的產量均有促進作用，其中Tween80添加量為0.8%時的效果最好。(6)為了提高漆酶的產量，本發明可通過添加金屬離子，以刺激菌體生產漆酶。在發酵開始前添加離子，離子主要有Cu2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、Mg2+、Mn2+、Na+、K+，濃度控制在0_4mmol/L。結果表明這些離子對于漆酶的產量均有一定的促進作用。本發明的有益效果目前未見竹黃菌、Shiraiabambusicola)產漆酶的研究報道。竹黃是一種藥用真菌，具有很高藥用價值和保健功效。竹黃發酵生產漆酶具有發酵周期短和酶活力高的優勢，同時發酵過程還可產生高活性的超氧化物歧化酶(SOD)和茈醌色素，開發前景廣闊。圖1碳源對漆酶、SOD酶、茈醌色素發酵的影響。圖2氮源對漆酶、SOD酶、茈醌色素發酵的影響。圖3表面活性劑對漆酶、SOD酶、茈醌色素發酵的影響。圖4金屬離子對漆酶、SOD酶、茈醌色素發酵的影響。具體實施例方式實施例15培養基組成為碳源20g/L，馬鈴薯200g/L，蛋白胨20g/L，NH4N0310g/L，玉米漿粉12g/L，K2HPO42g/L,KH2PO42g/L,pH自然，接種量為10%，種齡24小時，發酵溫度為30V，300L氣升式發酵罐，裝液量70%，通風量為1:1.5v/v/m，發酵時間為3天。在此條件進行8批發酵，每批發酵所采用的碳源不同，依次為葡萄糖、果糖、可溶淀粉、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖，每批碳源濃度為20g/L。漆酶、SOD和茈醌色素的產量如圖1所示。實施例2培養基組成為葡萄糖20g/L，氮源30g/L，K2HPO44g/L,KH2PO44g/L,pH自然，接種量為5%，種齡48小時，發酵溫度為24°C，300L氣升式發酵罐，裝液量60%，通風量為11.5v/v/m，發酵時間為3天。在此條件進行9批發酵，每批發酵所采用的氮源不同，依次為氯化銨、硝酸銨、硫酸銨、尿素、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米漿、豆餅粉，每批氮源濃度為30g/L。漆酶、SOD和茈醌色素的產量如圖2所示。實施例3培養基組成為葡萄糖20g/L，NH4N0310g/L,KH2PO44g/L,蛋白胨10g/L，表面活性劑0.08g/L,pH自然。接種量為10%，種齡15小時，培養溫度為28°C，50L機械攪拌發酵罐，裝液量60%，通風量為1:0.5v/v/m，攪拌轉速為150r/min，發酵時間為3天。當發酵開始后，發酵液中立即加入表面活性劑。在此條件進行18批發酵，每批發酵所采用的表面活性劑不同，依次為Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、TritonX-100、TritonX-114>TritonX-116、TritonX-405、TX-4、TX-6、TX-9、TX-10、AE0-3、AE0-7、AE0-9、一乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺，每批表面活性劑濃度為0.08g/L。漆酶、SOD和茈醌色素的產量如圖3所示。實施例4培養基組成為葡萄糖20g/L,K2HPO44g/L,牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，玉米漿粉12g/L，某種金屬離子2mmol/L，pH自然，接種量為10%，種齡24小時，發酵溫度為26°C，5L機械攪拌發酵罐，裝液量70%，通風量為1:0.3v/v/m，攪拌轉速為100r/min，發酵時間為2天。在此條件進行8批發酵，每批發酵所添加的金屬離子不同，依次為Cu2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、Mg2+、Mn2+、Na+、K+。漆酶、SOD和茈醌色素的產量如圖4所示。實施例5培養基組成為馬鈴薯200g/L，乳糖20g/L，NH4N0310g/L，Mg2+4mmol/L(MgSO4)、蛋白胨10g/L，pH自然。接種量為10%，種齡10小時，培養溫度為30°C，500L機械攪拌發酵罐，裝液量60%，通風量為1:0.5v/v/m，攪拌轉速為150r/min，發酵時間為3天。當發酵開始后，發酵液中立即加入TritonX-1001.5%。在該條件下，發酵液中漆酶活力為428U/mL,SOD活力為316U/mL。茈醌色素產量為0.53g/L，其中竹紅菌甲素占93%，竹紅菌乙素占3%。實施例6培養基組成為，葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，尿素10g/L，pH自然。接種量為10%，種齡48小時，培養溫度為30500L機械攪拌發酵罐，裝液量70%，通風量為1:0.4v/v/m，攪拌轉速為120r/min，發酵時間為5天。當發酵開始后40小時，發酵液中立即加入Tween800.3%。在該條件下，發酵液中漆酶活力達460U/mL,SOD活力為380U/mL。茈醌色素產量為0.92g/L，其中竹紅菌甲素占91%，竹紅菌乙素占5%。權利要求一種竹黃菌發酵生產漆酶的方法，其特征在于出發菌株為竹黃菌株(Shiraiasp.)SUPERH168，保藏號為CCTCCNOM207104；液態發酵培養基組成為碳源550g/L，氮源550g/L，K2HPO424g/L，KH2PO424g/L，馬鈴薯汁200g/L，用純水配制；液態發酵條件為在發酵罐內裝入發酵罐體積60%70%(v/v)的液態發酵培養基，滅菌冷卻后接入竹黃菌，接種量為5%10%，種齡為1048小時，起始pH和發酵過程pH均為自然，發酵溫度為2432℃，發酵周期為25天；在發酵過程中添加表面活性劑，以提高漆酶的產量；所添加的表面活性劑選用Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、TritonX100、TritonX114、TritonX116、TritonX405、TX4、TX6、TX9、TX10、AEO3、AEO7、AEO9、一乙醇胺、二乙醇胺、或三乙醇胺。2.根據權利要求1所述的竹黃菌發酵生產漆酶的方法，其特征在于竹黃菌株，能夠同時發酵產漆酶、超氧化物歧化酶SOD和茈醌色素。3.根據權利要求1所述的竹黃菌發酵生產漆酶的方法，其特征在于可利用的產漆酶碳源為葡萄糖、果糖、可溶淀粉、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、或半乳糖。4.根據權利要求1所述的竹黃菌發酵生產漆酶的方法，其特征在于可利用的產漆酶的氮源為無機銨鹽、無機硝酸鹽、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米漿、或豆餅粉。5.根據權利要求1所述的竹黃菌發酵生產漆酶的方法，其特征在于添加Cu2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、Mg2+、Mn2+、Na+、K+可以提高竹黃菌的漆酶產量。全文摘要一種竹黃菌發酵生產漆酶的方法，屬于生物工程
技術領域：
。本發明涉及利用竹黃菌株Shiraiasp.SUPER-H168保藏號為CCTCCNOM207104，已在ZL200710132510.4公開，通過液態發酵獲得漆酶。目前未見竹黃菌(Shiraiabambusicola)產漆酶的研究報道。竹黃是一種藥用真菌，具有很高藥用價值和保健功效。竹黃發酵生產漆酶具有發酵周期短和酶活力高的優勢，同時發酵過程還可產生高活性的超氧化物歧化酶(SOD)和苝醌色素，開發前景廣闊。文檔編號C12N9/02GK101942421SQ20101050121公開日2011年1月12日申請日期2010年10月9日優先權日2010年10月9日發明者丁彥蕊,廖祥儒,張大兵,李枝玲,胡明明,胡艷,蔡宇杰,馬文寅申請人:江南大學