專利名稱：基于重組ul51蛋白的鴨瘟病毒抗體的檢測方法
技術領域：
本發明涉及動物醫學領域，特別涉及基于重組UL51蛋白的鴨瘟病毒抗體檢測方 法。
背景技術：
鴨瘟(duck plague，DP)是由皰疹病毒科中的DPV引起的常見于鴨、鵝、天鵝等 水禽的一種高度致死性傳染病，在世界各養鴨地區都有分布，其預防和控制已直接關系到 水禽養殖業的持續穩定發展。臨床和實驗室試驗證實DPV弱毒疫苗是預防控制DP的有效 生物制劑，而對DPV特異性抗體的監測是評價DPV弱毒疫苗免疫效果及制定合理的免疫程 序的關鍵。目前，用于檢測DPV抗體的方法主要有中和試驗(neutralization test，NT)、 酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、瓊脂凝膠擴散試驗、 Dot-ELISA測定法和被動血凝試驗。其中經典的方法是血清中和試驗，但其敏感性不夠理 想，且耗時費力，不適于大批量血清樣品的檢測。ELISA具有特異性強、敏感度高、快速準確、 易于操作等特點，是DPV感染早期快速診斷和免疫抗體監測的有效手段；但是，由于DPV全 病毒純化方法的復雜性以及純度不夠理想，阻礙了包被全病毒的ELISA方法(DPV-ELISA) 的大規模應用。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種基于重組UL51蛋白為抗原的鴨瘟病毒抗 體檢測方法，該方法避免了繁瑣的病毒純化步驟，且操作簡單，特異性、靈敏性較高。為實現上述目的，本發明的技術方案為基于重組UL51蛋白的鴨瘟病毒抗體檢測方法，具體步驟為a固相抗原的制備將包被濃度大于或等于2. 5μ g/ΙΟΟμ L的重組UL51蛋白液與 固相載體連接，用封閉液封閉，洗滌去除未結合的抗原及雜質，得固相抗原；b 一抗結合將待檢血清作體積小于或等于200倍的稀釋，得稀釋血清，即一抗，通 過保溫反應使所述稀釋血清與步驟a所得固相抗原結合形成固相抗原抗體復合物，洗滌去 除固相載體上雜質；c 二抗結合將酶標二抗作體積小于或等于2000倍的稀釋，得酶標二抗稀釋液，將 所述酶標二抗稀釋液與步驟b所得固相抗原抗體復合物結合，得抗原_抗體_ 二抗復合物；d顯色在步驟c所得抗原_抗體_ 二抗復合物中加入色原底物避光顯色后，加入 終止液終止反應得顯色樣品液；e檢測及結果判定將步驟d所得顯色樣品液用酶標儀測定OD45tlnm值，當OD45tlnm值 > 0. 216時判為陽性，當OD45tlnm彡0. 216時判為陰性。進一步，所述的基于重組UL51蛋白的鴨瘟病毒抗體檢測方法，其特征在于，具體 步驟為a固相抗原的制備將包被濃度等于2. 5μ g/ΙΟΟμ L的重組UL51蛋白液與固相載體連接，用封閉液封閉，洗滌去除未結合的抗原及雜質，得固相抗原；b 一抗結合將待檢血清作等于200倍的稀釋，得稀釋血清，即一抗，通過保溫反 應使所述稀釋血清與所述固相抗原結合形成固相抗原抗體復合物，洗滌去除固相載體上雜 質；c 二抗結合將酶標二抗作等于2000倍的稀釋，得酶標二抗稀釋液，將所述酶標二 抗稀釋液與所述固相抗原抗體復合物結合，得抗原_抗體_ 二抗復合物；d顯色在步驟c所得抗原_抗體_ 二抗復合物加入色原底物避光顯色后，加入終 止液終止反應得顯色樣品液；e檢測并判定將步驟d所述顯色樣品液用酶標儀測OD45tlnm值，所述OD45tlnm值> 0. 216為陽性，所述OD450nm彡0. 216則為陰性；進一步，步驟a中所述重組UL51蛋白液、步驟b中所述稀釋血清及步驟c中所述 酶標二抗稀釋液的加入量為等體積且大于或等于100μ L ；進一步，步驟c中所述酶標二抗為羊抗鴨IgG-HRP ；進一步，步驟a中所述的封閉液為體積百分濃度為的牛血清白蛋白溶液；進一步，步驟d中所述色原底物為四甲基聯苯胺；進一步，步驟d中避光顯色的時間為20分鐘；進一步，所述方法還包括空白對照實驗和陰性對照實驗。本發明的有益效果在于本發明基于純化的重組UL51蛋白建立的間接ELISA法， 其特異性好，對鴨病毒性肝炎病毒(DHV)、鴨疫里默氏菌(RA)和鴨大腸桿菌(E.coli)的 陽性血清進行檢測，結果均為陰性；該方法對批內或批間重復試驗顯示變異系數均小于 10%，能檢出經1 3200倍稀釋的DPV陽性血清。
為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進 一步的詳細描述，其中圖I-A為DPV UL51基因的PCR擴增M指DL2000相對分子質量標準；1指以正常 DEF基因組DNA為模板的PCR擴增產物；2指以DPV CHv毒株基因組DNA為模板的PCR擴 增產物(箭頭所示的是其分子量大小，約為760bp)；圖I-B為重組質粒pMD18-UL51的雙 酶切鑒定M指相對分子質量標準III，1指重組質粒pMD18-UL51用EcoR I和Xho I雙酶 切得到的兩個片段(箭頭所示小片段的分子量大小約為760bp)；圖I-C為重組表達載體 pET28a-UL51的雙酶切鑒定M指相對分子質量標準III ； 1指重組表達載體pET28a_UL51，2 指重組表達載體pET28a-UL51用EcoR I和Xho I雙酶切得到的兩個片段(箭頭所示小片 段的分子量大小約為760bp)。圖2-A為重組表達蛋白的SDS-PAGE鑒定M為蛋白質相對分子質量標準；1為陰性 對照(未加IPTG誘導)；2為IPTG誘導(箭頭所示的蛋白質分子量大小約為34KD)；圖2-B 為誘導劑IPTG不同終濃度誘導表達結果1-7的IPTG濃度分別為0,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0 和1. 2mmol/L ；圖2-C為不同溫度誘導pET28a_UL51表達結果1_3的溫度分別為20、30和 37°C ；圖2-D為不同時間誘導pET28a-UL51表達結果1_8的誘導時間分別為1、2、3、4、5、6、 7 和 8h。
圖3為重組UL51蛋白的檢測(a) SDS-PAGE分析M為蛋白標準(KD) ；1為發酵培 養的全菌液；2為包涵體洗滌法純化的重組UL51蛋白；3為透析復性后的重組UL51蛋白； (b) Western blotting分析1是以兔抗DPV抗體為一抗檢測重組UL51蛋白(約為34KD)。圖4為敏感性試驗檢測結果。圖5為特異性試驗結果。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面結合附圖對本發明的優選 實施例進行詳細的描述。本實施例首先對所述重組UL51蛋白的獲得是通過構建原核表達 質粒pET28a-UL51、轉化表達菌并發酵培養，收集到大量的含有重組UL51蛋白的菌體沉淀， 再通過超聲波破碎菌體、重組UL51蛋白包涵體冼滌、純化及梯度透析而獲得的；同時，用 Westernblotting分析證實該蛋白可與抗DPV陽性血清發生強烈的免疫反應；進一步確定 了重組UL51蛋白的包被濃度及一抗、二抗的稀釋度，從而制備了鴨瘟病毒抗體檢測方法。實施例基于重組UL51蛋白的鴨瘟病毒抗體的檢測方法一鴨瘟病毒UL51基因的克隆、原核表達及UL51蛋白的純化1、材料方法以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未注明 具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。1. 1菌株、質粒和毒株質粒pMD18-T，購自大連寶生物工程有限公司；原核表達質粒pET28a(+)，Novagen 公司產品；克隆宿主菌E. coli DH5a、表達宿主菌E. coli BL21(DE3)和DPV CHv強毒株，由 四川農業大學禽病研究中心提供。1. 2試驗鴨胚和血清10日齡鴨胚，其種鴨DPV和抗體均為陰性；兔抗DPV抗體，由四川農業大學禽病研 究中心提供。1. 3主要試劑瓊脂糖、2X傻瓜PCRMix、DNA連接酶Mix、限制性內切酶EcoRI和Xhol、 UltraPure 質粒DNA小量提取試劑盒和UltraPureTMDNA回收試劑盒等分子生物學試劑及 試劑盒購自大連寶生物公司、北京賽百盛基因技術有限公司、華美生物工程公司和Bio-Rad 公司；其它試劑均為分析純，購自上海生工生物技術有限公司。2實驗方法2. IDPV UL51 基因的克隆2. 1. 1引物設計利用Primer Premier5. O 軟件，參考 UL51 基因序列(GenBank 登錄號DQ072725)， 由寶生物生物技術有限公司合成。引物DPV-UL51F 5’-CCGGAATTCATGTTAGCTTTTATCTCCAG-3，(劃線部分為 EcoRI 位點)引物 DPV-UL51R :5，-TCCCTCGAGTTAGACGGCTACCAACG-3，(劃 線部分為XhoI位點)。合成后，以適量滅菌去離子水溶解，使其終濃度為20mmol/L，-20°C
保存備用。
2. 1. 2DPV基因組DNA的提取2. 1. 2. IDEF的制作方法取IOd日齡健康鴨胚，分別用5%碘酒和75%酒精消毒 蛋殼表面。無菌操作條件下將胚體取出并用PBS將胚體洗凈，剪去頭、翅、腿和內臟，PBS沖 洗后將胚體剪成Imm大小的小塊，加PBS適量，之后置于三角瓶內，加細胞分散劑(體積分 數為2.5%的胰蛋白酶)15(^1/胚，于371水浴中消化31^11。立即將細胞懸液以4000r/ min離心5min，傾棄上清，細胞沉淀用適量的MEM懸浮后，用5層紗布過濾，向濾液中加入 10%小牛血清和100IU/mL雙抗后，分裝于IOOmL細胞培養瓶中，7mL/瓶，水平靜置于37°C 細胞培養箱中進行培養。2. 1. 2. 2DPV增殖取剛剛長成致密單層的DEF，棄生長營養液，用滅菌PBS清洗細 胞表面2次后，加入DPV病毒液2 3mL覆蓋細胞表面進行吸附，37°C吸附120min后棄病 毒液，然后加含3%小牛血清和100IU/mL雙抗的MEM維持營養液，之后37°C培養。同時做 未接毒的DEF對照。2. 1. 2. 3DNA提取方法直接從感染細胞中提取DPV基因組DNA的具體步驟如下 ⑴選取用DPV種毒感染后細胞病變(CPE)達60% 70%的DEF (IOOmL細胞瓶)；同時選 取細胞形態正常的DEF作對照；(2)傾去細胞培養液，加入500 μ L的細胞裂解液，同時加 蛋白酶K(10mg/mL)至終濃度為200 μ g/mL，輕輕混勻后，37°C孵育IOmin ； (3)將細胞懸浮 液倒入EP離心管中，并用500 μ L的飽和酚洗滌殘存于細胞瓶內的裂解物，倒入離心管中； (4)用飽和酚氯仿及氯仿抽提2次，再用水飽和乙醚處理2次；(5)加1/10倍體積3mol/ L NaAC,混勻后，加入2倍體積冷無水乙醇，-20°C放置30 60min ； (6) 13000r/min離心 20min,沉淀用預冷的70 %乙醇洗滌兩次；(7)真空抽干后，溶于適量TE緩沖液中，加入1 μ L RNA酶，37°C作用30min，_20°C保存備用。2. 1. 3PCR 擴增 DPV UL51 基因PCR反應體系為
權利要求
1.基于重組UL51蛋白的鴨瘟病毒抗體的檢測方法，其特征在于，具體步驟為a固相抗原的制備將包被濃度大于或等于2. 5 μ g/100 μ L的重組UL51蛋白液與固相 載體連接，用封閉液封閉，洗滌去除未結合的抗原及雜質，得固相抗原；b 一抗結合將待檢血清作體積小于或等于200倍的稀釋，得稀釋血清，即一抗，通過保 溫反應使所述稀釋血清與步驟a所得固相抗原結合形成固相抗原抗體復合物，洗滌去除固 相載體上雜質；c 二抗結合將酶標二抗作體積小于或等于2000倍的稀釋，得酶標二抗稀釋液，將所述 酶標二抗稀釋液與步驟b所得固相抗原抗體復合物結合，得抗原_抗體_ 二抗復合物；d顯色在步驟c所得抗原_抗體_ 二抗復合物中加入色原底物避光顯色后，加入終止 液終止反應得顯色樣品液；e檢測及結果判定將步驟d所得顯色樣品液用酶標儀測定OD45tlnm值，當OD45tlnm值> 0. 216時判為陽性，當OD45tlnm彡0. 216時判為陰性。
2.根據權利要求1所述的基于重組UL51蛋白的鴨瘟病毒抗的體檢測方法，其特征在 于，具體步驟為a固相抗原的制備將包被濃度等于2. 5 μ g/100 μ L的重組UL51蛋白液與固相載體連 接，用封閉液封閉，洗滌去除未結合的抗原及雜質，得固相抗原；b 一抗結合將待檢血清作等于200倍的稀釋，得稀釋血清，即一抗，通過保溫反應使所 述稀釋血清與所述固相抗原結合形成固相抗原抗體復合物，洗滌去除固相載體上雜質；c 二抗結合將酶標二抗作等于2000倍的稀釋，得酶標二抗稀釋液，將所述酶標二抗稀 釋液與所述固相抗原抗體復合物結合，得抗原_抗體_ 二抗復合物；d顯色在步驟c所得抗原_抗體_ 二抗復合物加入色原底物避光顯色后，加入終止液 終止反應得顯色樣品液；e檢測并判定將步驟d所述顯色樣品液用酶標儀測OD45tlnm值，所述OD45tlnm值> 0. 216 為陽性，所述OD45tlnm ( 0. 216則為陰性。
3.根據權利要求1或2所述的基于重組UL51蛋白的鴨瘟病毒抗體的檢測方法，其特征 在于步驟a中所述重組UL51蛋白液、步驟b中所述稀釋血清及步驟c中所述酶標二抗稀 釋液的加入量為等體積且大于或等于100 μ L。
4.根據權利要求1或2所述的基于重組UL51蛋白的鴨瘟病毒抗體的檢測方法，其特征 在于步驟c中所述酶標二抗為羊抗鴨IgG-HRP。
5.根據權利要求1或2所述的基于重組UL51蛋白的鴨瘟病毒抗體的檢測方法，其特征 在于步驟a中所述的封閉液為體積百分濃度為的牛血清白蛋白溶液。
6.根據根據權利要求1或2所述的基于重組UL51蛋白的鴨瘟病毒抗體的檢測方法，其 特征在于步驟d中所述色原底物為四甲基聯苯胺。
7.根據權利要求1或2所述的基于重組UL51蛋白的鴨瘟病毒抗體的檢測方法，其特征 在于步驟d中避光顯色的時間為20分鐘。
8.根據權利要求1或2所述的基于重組UL51蛋白的鴨瘟病毒抗體的檢測方法，其特征 在于所述方法還包括空白對照實驗和陰性對照實驗。
全文摘要
本發明涉及動物醫學領域，特別涉及用于檢測鴨瘟病毒抗體的方法，具體包括固相抗原的制備、一抗結合、二抗結合、顯色及檢測并判定等步驟，本方法是基于純化的重組UL51蛋白建立的間接ELISA法，其特異性好，對鴨病毒性肝炎病毒(DHV)、鴨疫里默氏菌(RA)、鴨大腸桿菌(E.coli)的陽性血清進行檢測，結果均為陰性；該方法的批內或批間重復試驗顯示變異系數均小于10％，能檢出經1∶3200倍稀釋的DPV疫苗免疫鴨陽性血清。
文檔編號C12N15/38GK102004150SQ201010299560
公開日2011年4月6日 申請日期2010年9月30日 優先權日2010年9月30日
發明者汪銘書, 沈嬋娟, 程安春, 陳孝躍 申請人:四川農業大學實驗動物工程技術中心