一種流感病毒神經氨酸酶抗體的快速檢測方法

專利名稱：一種流感病毒神經氨酸酶抗體的快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種流感病毒神經氨酸酶抗體的快速檢測 方法。
背景技術：
特定血清型流感病毒感染、感染后恢復、隱性感染、以及疫苗接種的人或動 物，在其體液(如血清、支氣管灌洗液、血漿、組織液等)中會出現流感病毒神經氨酸酶 抗體，通過檢測特定血清型流感病毒的抗體，可以判斷、診斷或確診該人或該動物是否 感染(包括早期感染、隱性感染或感染后恢復等)該特定血清型的流感病毒、或接種過流 感病毒疫苗、或評價其對特定血清型流感病毒的抵抗力等。
流感病毒表面主要存在著2種抗原性較強的糖蛋白刺突，即血凝素NA和神經氨 酸酶NA，當流感病毒感染或隱性感染或接種疫苗后，人或動物的機體會針對HA和NA 都產生抗體，正是如此，流感病毒中的甲型流感病毒根據HA的抗原性分為H1-H16等16 個亞型，NA的抗原性分為N1-N9等9個亞型，在甲型流感病毒中根據HA和NA亞型的 不同組合方式形成了眾多亞型，如H5N1 (即H5亞型與Nl亞型組合)。因此，如檢測流 感病毒抗體，除需檢測HA血清型外，還需要對NA血清型進行檢測。
目前檢測待檢樣品中是否存在某一特定血清型的流感病毒抗體的方法，主要有 血凝抑制實驗(HAI)和中和實驗，即將某一特定血清型的流感病毒先與待檢樣品混合， 然后加入紅細胞或敏感細胞中，判斷待檢樣品是否能夠抑制該病毒的血凝反應或細胞病 變效應來進行判定，其缺點是需要使用具有感染性的病毒，安全性存在隱患。而且上述 方法只能用于流感病毒血凝素(HA)抗體的檢測和血清型鑒定。
目前對NA血清型抗體的檢測，主要有神經氨酸酶酶活性抑制的方法檢測，以及 ELISA方法和乳膠凝集實驗方法來進行檢測。其中，ELISA方法是利用重組表達和純化 的流感病毒NA來檢測相應的抗體，這需要獲保持抗原特異性的重組蛋白的表達與純化， 且由于流感病毒有眾多亞型，即使同種亞型的血清交叉反應強度不一，對不同血清型的 NA抗原都進行重組蛋白的表達與純化，其工作量大、工藝要求高、批間穩定性差。乳膠 凝集方法相對于現有的其它方法(如ELISA方法和NA活性抑制檢測)而言，反應時間 短、適合現場檢測，但仍存在一些不足。乳膠凝集實驗方法是將重組表達和純化的流感 病毒NA蛋白偶聯在惰性乳膠顆粒表面，利用凝集反應進行檢測流感病毒相應的抗體，這 同樣需要重組表達和純化的流感病毒NA，并需要獲得保持抗原特異性的重組蛋白的表達 與純化，如需要檢測不同血清型的流感病毒NA抗體，就需要對不同毒株的NA進行重組 表達和純化，與ELISA方法一樣，存在工作量大、工藝要求高、批間穩定性差等問題。 而神經氨酸酶酶活性抑制的方法檢測，需要純化后的NA，且必需保持NA的生物活性， 即NA消化特定糖鏈的酶活性，將待檢樣品加入，如含有相應的NA抗體，其NA活性將 降低，通過特異性的底物進行檢測，即可判斷待檢樣品中是否含有NA抗體，該方法需要 更加復雜的工藝已獲得不同血清型的保持有酶活性的NA重組蛋白，同時需要特定處理(如含有熒光基團和熒光淬滅基團雙標記)的純化底物O’，3’ -唾液酸或2’，6’ -唾 液酸受體或衍生物等)，此外還需要借助熒光分光光度計或其它設備進行檢測。
由于檢測流感病毒抗體對人或該動物是否感染(包括早期感染、隱性感染或感 染后恢復等)該特定血清型的流感病毒、或接種過流感病毒疫苗、或評價其對特定血清 型流感病毒的抵抗力等有重要意義，而且，目前尤其缺乏針對NA抗體的快速的適于現場 檢測的方法。而目前的NA酶活性抑制實驗、ELISA以及乳膠凝集等檢測手段，或需要 特定的實驗條件和設備，或工藝復雜，或檢測耗時長等缺點，因此，一種簡便、快速、 工藝相對簡單易控的流感病毒NA抗體檢測方法具有廣泛的應用價值。發明內容
本發明的目的在于根據現有技術中檢測流感病毒神經氨酸酶抗體中存在的工作 量大、耗時長等缺點，提供一種快速、簡單的基于種族表達流感病毒神經氨酸酶的真核 細胞凝集反應的流感病毒神經氨酸酶抗體的快速檢測方法。
本發明目的通過以下技術方案予以實現
一種流感病毒神經氨酸酶抗體的快速檢測方法，所述檢測方法是將流感病毒神 經氨酸酶基因克隆后轉染真核細胞，使真核細胞表面重組表達流感病毒神經氨酸酶蛋 白，以此為凝集反應基質，可以與待檢樣品中的流感病毒神經氨酸酶抗體結合，發生凝 集反應，根據是否發生凝集反應可以判定待檢樣品中是否存在流感病毒神經氨酸酶抗 體。
作為一種優選方案，所述流感病毒神經氨酸酶為完整全長的神經氨酸酶蛋白， 或流感病毒神經氨酸酶的一部分，或流感病毒神經氨酸酶的抗原表位，或將流感病毒神 經氨酸酶蛋白全長或部分肽段中的部分氨基酸進行突變或修飾。
流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒，其中甲型流感病 毒的NA可以分為9個亞型，同時，由于流感病毒NA的突變和進化，即使是同一亞型 的NA，其交叉反應性的強弱不一。因此，檢測某一特定血清型流感病毒抗體時，使用 本發明的方法，將重組表達該特定血清型毒株的NA的真核細胞與待檢樣品進行凝集實驗 即可。上述的流感病毒NA，是指甲型流感病毒的Ni、N2、N3、N4、N5、N6、N7、 N8、N9亞型，以及乙型流感病毒、丙型流感病毒的神經氨酸酶，可以根據檢測目的的需 要使用某一特定血清型的NA或其部分。
如是進行較廣泛血清型的流感病毒抗體檢測，則可以根據所檢測的目的血清型 毒株的NA進行抗原性分析，選用抗原性保守或抗原交叉性強的NA蛋白的一部分進行 重組表達真核細胞的構建，利用凝集反應對較廣泛血清型的流感病毒抗體檢測。上述的 流感病毒NA，可以是某一流感病毒毒株NA或其中一部分，也可以是不同流感病毒毒株 的NA或其中一部分或不同NA的拼接或混合，也可以是對流感病毒NA進行了突變和修 飾，也可以是人工合成的天然不存在的序列，但其核心是重組表達產物具有流感病毒NA 的抗原性。
上述的重組表達流感病毒神經氨酸酶(NA)的真核細胞，是指將編碼有流感病毒 NA的基因片段導入真核細胞，在真核細胞表面重組表達流感病毒的NA。真核細胞可以 是酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞，以及其它的真核細胞，重組表達的流感病毒NA位于細胞膜或細胞壁表面。其中，真核細胞優選哺乳動物細胞和昆蟲細胞，其重組表達的流 感病毒神經氨酸酶可以有更為接近病毒感染人或動物所獲得翻譯后修飾、空間構型和抗 原性，其與流感病毒相應抗體的反應特異性更佳。進一步，優選哺乳動物細胞重組表達 流感病毒NA。重組表達可以是瞬時表達，也可以是穩定表達。編碼有流感病毒NA的 基因片段可以是DNA，也可以是RNA，可以是單純的含有啟動子和編碼序列的片段，也 可以是質粒，也可以是病毒載體，其可以僅編碼流感病毒NA，也可以同時或獨立混合編 碼其它蛋白或多肽或肽段，其目的是將編碼流感病毒NA的基因片段在真核細胞中獲得重 組表達。導入真核細胞的方式可以使用電擊、脂質體轉染、病毒介導等，目的是將編碼 流感病毒NA的基因片段進入真核細胞以得到重組表達。上述的重組表達流感病毒神經 氨酸酶(NA)的真核細胞，其核心在于獲得在細胞表面表達有流感病毒NA的真核細胞， 其目的是利用所表達NA的抗原性，通過凝集實驗，檢測流感病毒抗體。在本發明的一 個實施方案中，公布了重組表達流感病毒神經氨酸酶(NA)的真核細胞的方法。
上述的重組表達流感病毒神經氨酸酶(NA)的真核細胞，作為用于凝集反應的 顆粒抗原基質，可以是天然的重組表達流感病毒神經氨酸酶的真核細胞，或是經過胰酶 處理、機械分散、酶解分散、固定劑固定、穩定劑處理、防腐劑處理的等工藝同時或選 擇性處理后的重組表達流感病毒神經氨酸酶的真核細胞，以更好的使“凝集反應基質” 進行保存、防止自凝、增加凝集反應檢測的靈敏性和穩定性。在本發明的一個實施方案 中，公布了重組表達流感病毒神經氨酸酶(NA)的真核細胞的處理方法，以提高凝集反應 檢測的靈敏性和穩定性。
作為一種優選方案，所述待檢樣品為人或動物體液，如血清、支氣管灌洗液、 血漿或組織液。
作為一種優選方案，所述流感病毒神經氨酸酶抗體為IgG、IgM, IgA、IgE、IgD中的一種或幾種的混合物。
作為一種優選方案，所述重組表達為瞬時表達或穩定表達。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
本發明是以重組表達流感病毒NA的細胞為載體，利用凝集反應，檢測待檢樣品 中是否存在相應流感病毒的抗體。利用RT-PCR克隆特定血清型流感病毒的NA基因或 其片段，構建真核表達載體，轉染真核細胞，細胞表面會存在重組表達的NA，經醛化固 定后，該細胞即成為表面含有NA抗原的致敏顆粒，與待檢樣品混合后，如待檢樣品中含 有流感病毒的NA抗體，即會在數分鐘發生凝集反應。該方法不涉及具有感染性的病毒 顆粒；相比ELISA和NA酶活性抑制實驗所需的數小時至數天，重組表達NA的細胞凝集 反應僅需數分鐘，反應時間快速；利用通用引物和載體可對不同血清型的NA基因進行 克隆與轉染表達，即可得到不同NA抗原的致敏細胞顆粒，可以更加廣泛地對不同NA血 清型流感病毒進行檢測。
具體實施方式
以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。
實施例1重組表達流感病毒神經氨酸酶(NA)的真核細胞的制備
本實施例以一株H5N1 亞型的毒株 A/Chicken/Guangdong/1/2005 (H5N1)為例，進行重組表達流感病毒神經氨酸酶NA真核表達細胞的制備。A/Chicken/ Guangdong/1/2005 (H5N1)是2005年在廣東省的雞中分離得到的一株H5N1亞型流感病 毒，其NA的基因序列可在公共數據庫GenBank上獲得，NA的序列號為EU874900.2。 將該株病毒增殖后使用Viral RNA Miniprep ICit提取病毒RNA，用Uni_12弓丨物 (5，-AGCAAAAGCAGG-3 ‘)和SuperScript III或M-MLV逆轉錄酶進行逆轉錄，得到 病毒cDNA。根據該毒株NA的基因序列，設計一對用于NA全長基因克隆的引物，其引 物序列具體如下上游引物N INA-F 序列為5，-GTAAAGCTTACCATGAATCCAAAT CAGAAG-3，，從5’端依次為3個保護性堿基、HindIII酶切位點、KOZAK序列、起 始密碼子和配對區；下游引物N1NA-R，序列為5，-CACGGATCCCTACTTGTCAATG GTGAATG-3，，從5’端依次為3個保護性堿基、BamH I酶切位點、終止密碼子和配 對區。利用這對引物，用高保真T^aq酶對病毒cDNA進行PCR擴增，擴增NA片段。
PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳回收后NA基因片段后，與表達載體pcDNA3分別進 行使用Hind III和BamH I雙酶切，再次電泳回收后利用T4DNA連接酶將酶切回收后的 NA片段與載體進行連接，分別轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，涂布Amp抗性平板。菌 落經PCR后，提取質粒酶切鑒定和DNA測序，獲得含有NA基因片段的真核表達質粒即 pcDNA-NlNA。
含有pcDNA-NlNA質粒的細菌，經含有50 μ g/ml的氨芐青霉素(Amp)的LB培 養過夜后，用高純度質粒提取試劑盒提取pcDNA-NlNA質粒。根據Lipofectamine 2000 試劑盒說明，將3 μ g pcDNA-NlNA質粒和10 μ 1 Lipofectamine2000轉染復合物，轉染一 個35mm直徑培養皿含有生長密度約為80% -90%融合率的人胚腎HEK-239細胞，轉染 后&h去除轉染復合物，更換新鮮的完全培養基(含有10%胎牛血清的DMEM培養基)。
轉染后，HEK-239細胞即可瞬時重組表達NA，即得到瞬時重組表達流感病毒 NA的細胞。
為進一步優化，可以篩選獲得穩定重組表達NA的細胞在轉染7Zh后將轉染細 胞吹打分散，將細胞懸液的1/20接種一個新的35mm直徑培養皿中，補充完全培養基至 3ml，經過夜貼壁后，補加G418至濃度為600 μ g/ml。此后每3至5天的更換一次含有 600 μ g/ml G418的完全培養基，約3周后可見篩選出現的抗性細胞集落。將抗性細胞集 落經胰酶消化后，按10-20個細胞/ml接種96孔板培養，加入含有600 μ g/ml G418的完 全培養基培養至長至單層后，進行傳代，獲得用于檢測的備份培養96孔板。將檢測用的 96孔板的細胞用4%多聚甲醛室溫固定5分鐘，經PBS漂洗后，加入抗Nl亞型NA的抗 體為一抗、Cy3熒光標記的二抗進行免疫熒光檢測，選擇熒光陽性信號強、熒光陽性細 胞比例高的孔，對細胞繼續重復的克隆化和免疫熒光，至陽性細胞比例接近100%，即可 得到穩定重組表達該毒株NA的細胞。
實施例2重組表達流感病毒神經氨酸酶(NA)的真核細胞的處理
瞬時或穩定重組表達該毒株NA的細胞，經培養后，用EDTA 二鈉(0.02% )室 溫溫和處理細胞約2分鐘，將細胞懸液進行離心，去除上清后用含有2% BSA的PBS進 行重懸，獲得EDTA處理后的細胞懸液。加入等體積的10%的冷甲醛，于4°C固定2小 時。經離心、PBS重懸的方式進行3次洗滌。最后將細胞沉淀，按107個/ml的濃度重懸于含有0.2%尼泊爾金酯、2%BSA、15%甘油、0.5%肝素的PBS緩沖液中，使其能夠 穩定地長時間保存，即得到了處理后的重組表達NA抗原的真核細胞。
實施例3使用重組表達流感病毒神經氨酸酶的真核細胞進行凝集反應檢測流感 病毒抗體
將實施例2中的處理后的重組表達NA抗原的真核細胞懸液1滴(約50 μ 1)加 到潔凈的載玻片上，然后加入50 μ 1的待檢樣品(血清、支氣管灌洗液、血漿、組織液 等)，前后左右輕輕晃動載玻片或使用微量移液器吸頭將其混勻，室溫下1-3分鐘觀察是 否出現細胞凝集。
設立陽性血清和陰性血清對照，如對照樣品符合預期結果，待檢樣品發生未凝 集時，說明待檢樣品中不含有與該毒株NA具有反應性的流感病毒NA抗體或抗體濃度低 于該方法所能達到的檢測濃度。
待檢樣品發生凝集時，說明待檢樣品中含有與該毒株NA具有反應性的流感病毒 NA抗體。此時可以進一步進行相對定量分析，即，將待檢樣品1進行連續的倍比稀釋， 然后分別與實施例2中的處理后的重組表達NA抗原的真核細胞懸液進行凝集反應，得到 所能發生凝集的最高稀釋度，設為dl。同樣方法可得到待檢樣品2的凝集反應陽性最高 稀釋度d2。以此橫向比較不同待檢樣品中流感病毒NA抗體的濃度差異和相對比例。
權利要求
1.一種流感病毒神經氨酸酶抗體的快速檢測方法，其特征在于所述檢測方法是將流 感病毒神經氨酸酶基因克隆后轉染真核細胞，使真核細胞表面重組表達流感病毒神經氨 酸酶蛋白，以此為凝集反應基質，可以與待檢樣品中的流感病毒神經氨酸酶抗體結合， 發生凝集反應，根據是否發生凝集反應可以判定待檢樣品中是否存在流感病毒神經氨酸 酶抗體。
2.根據權利要求1所述的流感病毒神經氨酸酶抗體的快速檢測方法，其特征在于所述 流感病毒神經氨酸酶為完整全長的神經氨酸酶蛋白，或流感病毒神經氨酸酶的一部分， 或流感病毒神經氨酸酶的抗原表位，或將流感病毒神經氨酸酶蛋白全長或部分肽段中的 部分氨基酸進行突變或修飾。
3.根據權利要求1所述的流感病毒神經氨酸酶抗體的快速檢測方法，其特征在于所述 流感病毒神經氨酸酶為甲型流感病毒的Ni、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9亞 型、乙型流感病毒或丙型流感病毒的神經氨酸酶。
4.根據權利要求1所述的流感病毒神經氨酸酶抗體的快速檢測方法，其特征在于所述 真核細胞為酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或其它真核細胞，重組表達的流感病毒血凝 素位于細胞膜或細胞壁表面。
5.根據權利要求1所述的流感病毒神經氨酸酶抗體的快速檢測方法，其特征在于所述 重組表達流感病毒神經氨酸酶為單獨的流感病毒神經氨酸酶蛋白或部分肽段，或者是與 其它蛋白、多肽、肽段進行融合表達或共同獨立表達。
6.根據權利要求1所述的流感病毒神經氨酸酶抗體的快速檢測方法，其特征在于所 述凝集反應基質為天然的重組表達流感病毒神經氨酸酶的真核細胞，或者是經過胰酶處 理、機械分散、酶解分散、固定劑固定、穩定劑處理、防腐劑處理的方法同時或選擇性 處理后的重組表達流感病毒神經氨酸酶的真核細胞。
7.根據權利要求1所述的流感病毒神經氨酸酶抗體的快速檢測方法，其特征在于所述 待檢樣品為人或動物體液。
8.根據權利要求1所述的流感病毒神經氨酸酶抗體的快速檢測方法，其特征在于所述 待檢樣品為人或動物的血清、支氣管灌洗液、血漿或組織液。
9.根據權利要求1所述的流感病毒神經氨酸酶抗體的快速檢測方法，其特征在于所述 流感病毒神經氨酸酶抗體為IgG、IgM, IgA、IgE、IgD中的一種或幾種的混合物。
10.根據權利要求1 9中任意一條所述的流感病毒神經氨酸酶抗體的快速檢測方 法，其特征在于所述重組表達為瞬時表達或穩定表達。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種流感病毒神經氨酸酶抗體的快速檢測方法。本發明檢測方法是將流感病毒神經氨酸酶基因克隆后轉染真核細胞，使真核細胞表面重組表達流感病毒神經氨酸酶蛋白，可以與待檢樣品中的流感病毒神經氨酸酶抗體結合，發生凝集反應，根據是否發生凝集反應可以判定待檢樣品中是否存在流感病毒神經氨酸酶抗體。本發明方法簡單、快速、穩定、靈敏性高，具有廣泛的應用價值。
文檔編號C12N15/55GK102023212SQ20101029716
公開日2011年4月20日 申請日期2010年9月28日 優先權日2010年9月28日
發明者吳嘉偉, 吳彬冰, 孟燕萍, 李衛中, 李康生, 李蕊, 王革非, 蔡漢杰, 黃秀梅 申請人:汕頭大學醫學院