專利名稱：一種制備β-甘露聚糖酶的方法及專用菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種制備β -甘露聚糖酶的方法及專用菌株。
背景技術：
β -甘露聚糖酶(β -l，4-D-mannan mannohydrolase ；EC31211178)是一類降解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的主鏈3-l，4-D-甘露吡喃糖的酶，它在利用現存在于一些植物如干椰子肉的胚乳、象牙棕櫚樹的堅果、瓜爾豆、洋槐、咖啡樹以及魔芋的塊莖中的各種甘露聚糖有著潛在的重要性。國內外現主要用于造紙工業紙漿的漂白、油井的破膠、降解植物膠生產低聚糖用作雙歧桿菌促生長因子，防病抗衰老的保健食品以及飼料工業中作為抗營養因子。β -甘露聚糖酶按其最適PH值的不同有酸性、中性、堿性之分，其中堿性β -甘露聚糖酶是指在堿性條件下催化活力最高的β -甘露聚糖酶，其研究相對較晚，發現主要由嗜堿芽孢桿菌產生，某些地衣芽孢桿菌也產生堿性β -甘露聚糖酶，如楊文博等報道了一株地衣芽孢桿菌ΝΚ-27，其最適ρΗ值為9.0。一般情況下枯草芽孢桿菌，放線菌等產生中性 β-甘露聚糖酶，而霉菌產生酸性β-甘露聚糖酶。第一個堿性甘露聚糖酶由Akino等發現。馬延和等于1991報道了嗜堿芽孢桿菌Ν16-5的三個胞外堿性甘露聚糖酶的純化及酶學性質，并于2004年報道了其中一種嗜堿甘露聚糖酶的基因序列。Takeda等于2004年發現了芽孢桿菌屬的一個菌株JAMB-602產堿性甘露聚糖酶，此酶屬于GH家族5，最適ρΗ為 9。目前所發現的嗜堿甘露聚糖酶的最適PH值最高為10，由Takeda等于2004年報道。堿性β-甘露聚糖酶不僅可以生產用作雙歧桿菌促生長因子的低聚糖，而且在需堿性環境的紙漿漂白等工業方面具有廣泛的應用前景。但到目前為止，堿性甘露聚糖酶的制備仍舊是限制其工業應用的瓶頸，前人的報道中無論是使用堿性β -甘露聚糖酶的原產菌株還是使用重組菌株生產，其產量都比較低。馬延和等于1991報道了嗜堿芽孢桿菌Ν16-5的三個胞外堿性甘露聚糖酶的純化及酶學性質，并于2004年報道了其中一種嗜堿甘露聚糖酶的基因序列，其基因的編碼區序列如SEQ ID NO 1中第7-1407位所示。PTM1 溶液將 Cu SO4 ·5Η20 6g，KI 0. 08g, MnSO4 2. 68g, H3BO3 0. 02g, Na2MoO4 ·2Η20 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 20g, FeSO4 · 7H20 65g, CoCl2 · 6H20 0. 916，H2S045mL,生物素 0. 2g 混合， 用水定容至1升，得到PTM1溶液。每1升BMGY液體培養基按照如下方法制備將8克-12克或10克酵母提取物、18 克-22克或20克蛋白胨、12克-15克或13. 4克YNB、3X 10_4克-5X 10_4克或4X 10_4克生物素和8克-12克或10克甘油溶于水中，用水定容至1升，得到BMGY液體培養基。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種重組菌。本發明所提供的重組菌，是將甘露聚糖酶的編碼基因導入出發菌株，得到的重組菌；所述β -甘露聚糖酶的編碼基因序列如SEQ ID NO 1中第7-1407位核苷酸所示。上述重組菌中，所述β-甘露聚糖酶的編碼基因是通過重組載體導入出發菌株的；所述重組載體為如下(1)或( 或C3)所示(1)將 SEQ ID NO 1 所示 DNA 片段插入 pA0815alpha 的 XhoI 和 EcoRI 酶切位點間，得到的重組載體，記作ρΑΟ α-Isman ；其中，XhoI酶切位點位于SEQ ID NO :1所示DNA片段的5'端上游，EcoRI酶切位點位于SEQ ID NO 1所示DNA片段的3‘端下游；(2)用 BamHI/Bglll 雙酶切 ρΑΟ α -Isman,回收 2932bp 片段；用 BamHI 單酶切 ρΑΟ α-Isman,回收載體大片段；將所述^32bp片段和所述載體大片段連接，得到的重組載體，記作 ρΑΟ α -2sman ；(3)用 BamHI/Bglll 雙酶切 ρΑΟ α -2sman,回收 5864bp 片段；用 BamHI 單酶切 pA0a-2sman,回收載體大片段；將所述5864bp片段和所述載體大片段連接，得到的重組載體，記作 PAO α -4sman ；所述pA0815alpha按照如下方法得到將載體pPICZ α用McI/EcoRI雙酶切，收集IOOObp片段；用McI/EcoRI雙酶切載體pA0815，回收載體大片段；將所述IOOObp片段和所述載體大片段連接，得到的重組載體即為pA0815alpha ；所述出發菌株為酵母菌，優選為畢赤酵母菌，再優選為巴斯德畢赤酵母菌株 GS115。上述重組菌中，所述重組菌為巴斯德畢赤酵母(Pichia paStoriS)GS4SMAN，其保藏編號為 CGMCC N0. 4095。本發明的另一個目的是提供一種制備甘露聚糖酶的方法。本發明所提供的制備甘露聚糖酶的方法，包括如下步驟將上述任一所述重組菌接種于發酵培養基中，發酵培養，得到甘露聚糖酶；將發酵容器內的所有物質記作發酵體系。上述方法中，所述發酵培養基為用于培養畢赤酵母菌的培養基，且其中含有甘油；所述發酵培養依次按照如下三個階段進行階段一包括如下步驟從接種開始培養至發酵體系中的甘油耗盡；階段二 包括如下步驟在發酵體系中的甘油耗盡時，開始流加甘油或甘油溶液， 培養至發酵體系的0D_值達到200-350或200或250或320或350，停止流加甘油或甘油溶液；階段三為如下1)或2)所示1)包括如下步驟在發酵體系中的甘油耗盡時，向發酵體系中加入山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液，進行誘導表達；2)包括如下步驟在發酵體系中的甘油耗盡時，將發酵體系的溫度調至^TC 四°C或沈°C或27°C或觀°C或四°C，向發酵體系中加入山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液，進行誘導表達；所述甘油溶液由甘油、PTM1溶液和水組成；所述甲醇溶液由甲醇、PTM1溶液和水組成。上述方法中，所述山梨醇與甲醇的混合水溶液中，山梨醇與甲醇的質量比為1 20 1 5 或 1 20 或 1 10 或 1 5。上述方法中，所述山梨醇與甲醇的混合水溶液中，山梨醇的濃度為36g/L_144g/L 或36g/L或72g/L或144g/L，甲醇的濃度為720g/L。上述方法中，所述階段一和所述階段二中的培養在pH值為6. 0、溫度為30°C、溶氧為30%以上的條件下進行；上述方法中，所述階段三中的1)中，誘導表達在PH值為6. 0、溫度為30°C、溶氧為 30%以上的條件下進行；上述方法中，所述階段三中的2)中，誘導表達在pH值為6.0、溫度為 或或27°C或或^°C、溶氧為30%以上的條件下進行。上述方法中，所述階段三中，誘導表達的時間為60h_160h，具體為iai_84h或 36h-84h 或 48h-84h 或 60h_84h 或 19h_i;34h 或 43h_i;34h 或 64h_i;34h 或 86h_i;Mh 或 lllh-134h ；再具體為 12h、36h、48h、60h、72h、84h 或 19h、43h、64h、86h、Illh 或 134h ；上述方法中，所述階段一中，所述接種量為5% ；上述方法中，所述階段三中，所述在發酵體系中的甘油耗盡時為從停止流加甘油時計起，0.5 Ih后；(在補加甲醇前，將溫度降至沈 四1，菌體及饑餓0.5 111，以耗盡甘油，達到AOXl啟動子去阻遏的目的)。上述方法中，所述溶氧為30%以上為溶氧為30% -100% ；上述方法中，所述發酵培養基為BMGY液體培養基；上述方法中，所述甘油溶液按照如下方法制備將600g-650g或625g甘油、 1 Oml-Hml或12mL PTM1溶液混合，用水定容至1升。上述方法中，所述階段三中，所述向發酵體系中加入山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液的方式為先向發酵體系中加入甲醇，使甲醇在發酵體系中的體積濃度為3/1000-7/1000或5/1000，1. 5小時-2. 5小時或2小時后，再向發酵體系中流加山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液；上述方法中，所述階段一中，所述溶氧為30%以上是通過向發酵體系中通入空氣并調節通入空氣的速率和攪拌發酵體系并調節攪拌發酵體系的速率實現的；所述攪拌速率為200rpm-900rpm ；所述通入空氣的速率為0. 5L/L發酵培養基/min-1. 5L/L發酵培養基/ min ；上述方法中，所述階段二中，所述溶氧為30%以上是通過向發酵體系中通入空氣并調節通入空氣的速率、攪拌發酵體系并調節攪拌發酵體系的速率、和調節甘油或甘油溶液的流加速率實現的，所述攪拌速率為200rpm-900rpm ；所述通入空氣的速率為0. 5L/L發酵培養基/min-1. 5L/L發酵培養基/min ；所述流加甘油或甘油溶液的速率為5ml甘油或甘油溶液/L發酵培養基/h-15ml甘油或甘油溶液/L發酵培養基/h ；上述方法中，所述階段三中，所述溶氧為30%以上是通過向發酵體系中通入空氣并調節通入空氣的速率、攪拌發酵體系并調節攪拌發酵體系的速率、和調節山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液的流加速率實現的，所述攪拌速率為200rpm-900rpm ；所述通入空氣的速率為0. 5L/L發酵培養基/min-1. 5L/L發酵培養基/min ；所述流加山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液的速率為anl山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液/L發酵培養基/h-6ml山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液/L發酵培養基/h。本發明公開的重組菌含有多個拷貝的、由甲醇誘導表達的甘露聚糖酶基因。實驗證明，本發明的用該重組菌進行高密度發酵生產堿性甘露聚糖酶的工藝，可使最終堿性甘露聚糖酶在84h的誘導周期內，酶活達到6336u/ml。本發明方法成本低、操作簡單、產率高。 因此，本發明方法在甘露聚糖酶的制備領域具有廣闊的應用前景。
圖1為分泌型表達載體pA0815alpha的構建示意圖。圖2為重組表達載體ρΑΟ α -lsman, ρΑΟ α -2sman, ρΑΟ α -4sman的構建示意圖。圖3為重組菌GS4SMAN在甲醇誘導高密度發酵結果。圖4為重組菌GS4SMAN在山梨醇混合補料，30°C誘導時高密度發酵結果圖5為重組菌GS4SMAN在山梨醇混合補料，誘導時高密度發酵結果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、堿性甘露聚糖酶分泌表達載體的構建一、堿性甘露聚糖酶基因的克隆設計和合成引物引物 I(Forward) 5’ ATATCTCGAGAAAAGATCCCCATCAGAAGC 3'引物 2 (Reverse) 5’ CGGGCGAATTCTATCTTAAAGTAACATTAT 3，在α -mating因子信號肽編碼序列下游有一個BioI酶切位點(CTCGAG，對應氨基酸為Leu-Glu)，其后緊跟一個Kex2蛋白酶識別位點(AAAAGA，對應氨基酸序列Lys-Arg)，因此，引物1的設計是在甘露聚糖酶基因之前引入》ιοΙ位點和Kex2蛋白酶識別位點序列。通過該設計，即可將甘露聚糖酶基因直接連接在信號肽序列之后，這樣蛋白翻譯后，在畢赤酵母自身Kex2蛋白酶的作用下，即可切表達出氨基酸不變的目的蛋白(而不會因酶切位點的原因引入額外的氨基酸殘基)。引物2包含終止密碼子TAG，并引入一個EcoRI酶切位點。以嗜堿芽孢桿菌附6_5總DNA為模板(或以人工合成的SEQ ID NO :1所示基因為模板)，加入引物1、引物2、HiFi Taq DNA聚合酶及dNTP混合物，進行降落PCR(touchdown PCR)，反應條件如下:94V 5min ；94°C 30s, 60-50°C 30s, 72°C 90s，每個循環降 1°C，共 10 個循環；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s，共 25 個循環。PCR擴增得到1400bp的片段，命名為sman，用Omega純化試劑盒純化后，連接入 PMD18-T載體(購自TaKaRa公司)，得到重組載體pMD18_sman，將pMD18_sman送北京奧科進行測序，測序結果表明PCR擴增得到的片段中含有SEQ ID NO :1所示序列。二、分泌表達載體的構建構建流程如圖1和圖2所示。pA0815alpha 的制備 JfpPICZa (購自 Invitrogen 公司)用 SacI/EcoRI 雙酶切， 收集IOOObp片段(即含有α -mating因子信號肽編碼基因的片段)；用McI/EcoRI雙酶切pA0815載體(購自hvitrogen公司)，回收載體大片段；將所述IOOObp片段和所述載體大片段連接，得到的重組載體即為pA0815alpha ；1、單拷貝堿性甘露聚糖酶分泌表達載體的構建將步驟一得到的pMD18_sman用XhoI和EcoRI雙酶切，與同樣經過XhoI和EcoRI 雙酶切的pA0815alpha質粒連接，形成單拷貝堿性甘露聚糖酶分泌表達載體ρΑΟ α -Isman02、2拷貝sman的菌株的獲得將步驟1中得到的重組表達載體ρΑΟ α -Isman用BamHI/BglII雙酶切，回收 2932bp 片段(即 BamHI-sman-Bglll 片段)；用 BamHI 單酶切 ρΑΟ α -lsman,回收載體大片段；將所述^32bp片段和所述載體大片段連接，即可得2拷貝sman的表達載體 ρΑΟα -2sman ；3、4拷貝sman的菌株的獲得用BamHI/Bglll 雙酶切 ρΑΟ α -2sman,回收 5864bp 片段(艮口 BamHI-sman-sman-Bglll片段)；用BamHI單酶切pAOa -2sman，回收載體大片段；將所述 5864bp片段和所述載體大片段連接，即可得4拷貝sman的表達載體ρΑΟ α -4sman。三、表達甘露聚糖酶的酵母菌株的獲得1、電轉化巴斯德畢赤酵母細胞的制備接種巴斯德畢赤酵母菌株GS115(Invitrogen，Ca. 18100)于500ml YPD培養基(10 克/升酵母膏、20克/升蛋白胨、20克/升葡萄糖、15克/升瓊脂糖)，30°C，200r/min培養至0D600 = 1.3-1.5。4°C，l，500g離心5min收集菌體，分別用500ml、250ml預冷的滅菌水和20ml預冷的lmol/L山梨醇各洗一次。每次洗后均在4°C，1，500g下離心5min收集菌體，最后用Iml預冷的lmol/L山梨醇懸浮，即獲得電擊感受態細胞。2、重組表達質粒電轉化酵母細胞將實驗二中構建正確的重組表達質粒ρΑΟ α -lsman、pA0 α -2sman和ρΑΟ α -4sman 各約IOug分別用MlI酶切線性化，乙醇沉淀回收線性DNA并溶解于IOul無菌水中。將上述線性化DNA與80ul GS115感受態細胞混合，轉入預冷的0. 2cm電轉杯中。采用美國 BIO-RAD公司電轉化儀，根據所使用電轉化儀預設的畢赤酵母參數進行電擊。電擊結束后立即加入Iml預冷的IM山梨醇至電擊杯中，然后將電擊杯中的溶液全部轉移至一無菌離心管中，37°C孵育l_2h，取500ul涂布MD O克/升葡萄糖、13. 4克/升YNB、4X 10_4克/升生物素、1. 5克/升瓊脂)平板，于30°C倒置培養2-4天直至菌落出現。至此，得到含1、2、4拷貝sman的重組畢赤酵母菌株。含有1拷貝sman的重組畢赤酵母菌株(即轉入ρΑΟ α -Isman的重組畢赤酵母菌株)的分子鑒定方法以GAP基因為內參基因，用熒光定量PCR法測定該菌株sman的拷貝數為1拷貝。具體測定方法參見Taicheng Zhu et al.，Efficient generation of multi-copystrains for optimizing secretory expression of porcine insulin precursor in yeast Pichiapastoris, Journal of Applied Microbiology,2009,107 954-963 ；含有2拷貝sman的重組畢赤酵母菌株(即轉入ρΑΟ α -2sman的重組畢赤酵母菌株)的分子鑒定方法以GAP基因為內參基因，用熒光定量PCR法測定該菌株sman的拷貝數為2拷貝。含有4拷貝sman的重組畢赤酵母菌株(即轉入ρΑΟ α -4sman的重組畢赤酵母菌株)的分子鑒定方法以GAP基因為內參基因，用熒光定量PCR法測定該菌株sman的拷貝數為4拷貝。四、重組菌株的搖瓶發酵1、重組菌的發酵培養將步驟三中獲得的表達堿性甘露聚糖酶的單拷貝sman的菌株、2拷貝sman的菌株和4拷貝sman的菌株分別接種于25ml BMGY液體培養基中(10克/升酵母精提物、20克/ 升蛋白胨，121°C滅菌20min后，溫度降至室溫時加入13. 4克/升YNB、4X 10_4克/升生物素、10克/升甘油)，于30°C，200r/min搖床培養48h，OD600達20，3000r/min離心5min收集菌體，棄上清，用無菌純凈水洗滌菌體1-2次。將菌體用BMMY誘導培養基(10克/升酵母精提物、20克/升蛋白胨，121°C滅菌20min后，溫度降至室溫時加入13. 4克/升YNB、4X 10_4 克/升生物素、0. 5%甲醇)，稀釋至OD6tltl = 10，用4層紗布代替棉花塞，于30°C，200r/min 搖床培養。每天補加甲醇至終濃度為0.5% (V/V)。在30°C培養3天后，取發酵液進行酶活檢測。將發酵容器中的所有物質記作發酵液。2、胞外酶活的測定吸取發酵液ImL于離心管中，以lOOOOr/min離心lOmin，吸取上清液于試管中。加 Λ 0. Olml稀釋的樣品溶液和0. 19mL反應液，72°C保溫IOmin ；加入0. 2ml DNS,煮沸5min ； 取上清液在540nm處測定吸光值。以滅過活的酶液做空白對照，空白對照的處理方法與樣品的處理一樣。酶活定義在37°C、pH值為9. O的條件下，每分鐘降解甘露聚糖釋放1 μ mol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位U。滅過活的酶液的制備方法將步驟1得到的上清液在100°C煮沸5min，得到滅過活的酶液。槐豆膠購自Sigma，產品目錄號為G0753。槐豆膠的主要成分為甘露聚糖。反應液配制方法將0. 5g槐豆膠放入250ml燒杯中，加入90ml在70°C預熱的 pH9. 0,0. 05M甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(50ml0. 2M甘氨酸+8. 8ml0. 2N氫氧化鈉，加水稀釋至200ml)磁力攪拌混勻，然后用水定容到500ml，得到反應液。DNS 稱取酒石酸鉀鈉182. 0g，溶于500mL蒸餾水中，加熱(不超過50°C )，于熱溶液中依次加入3，5- 二硝基水楊酸6. 3g，NaOH 21. 0g,苯酚5. Og,無水亞硫酸鈉5. Og,攪拌至溶解完全，冷卻后用蒸餾水定容至IOOOmL,貯存于棕色瓶中，室溫保存。酶活與OD54tl的換算公式為發酵液酶活=[(0D540+0. 187)/0. 025/18] X發酵液稀釋倍數。實驗設3次重復，結果取平均數。誘導發酵7 后，1-4拷貝菌株搖瓶發酵液酶活見表1。同時以轉入pA0815alpha 的畢赤酵母菌株GS115為對照，結果對照與空白對照結果相同，檢測不到酶活。表1.不同拷貝菌株的酶活
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權利要求
1.一種重組菌，是將甘露聚糖酶的編碼基因導入出發菌株，得到的重組菌；所述 β -甘露聚糖酶的編碼基因序列如SEQ ID NO 1中第7-1407位核苷酸所示。
2.根據權利要求1所述的重組菌，其特征在于所述甘露聚糖酶的編碼基因是通過重組載體導入出發菌株的；所述重組載體為如下(1)或( 或C3)所示(1)將SEQID NO 1所示DNA片段插入pA0815alpha的XhoI和EcoRI酶切位點間，得到的重組載體，記作ρΑΟ α -Isman ；其中，XhoI酶切位點位于SEQ ID NO=I所示DNA片段的 5'端上游，EcoRI酶切位點位于SEQ ID NO :1所示DNA片段的3'端下游；(2)用BamHI/Bglll 雙酶切 ρΑΟ α -Isman,回收 2932bp 片段；用 BamHI 單酶切 ρΑΟ α-Isman,回收載體大片段；將所述^32bp片段和所述載體大片段連接，得到的重組載體，記作 ρΑΟ α -2sman ；(3)用BamHI/Bglll 雙酶切 pAOa -2sman，回收 5864bp 片段；用 BamHI 單酶切 pA0a-2sman,回收載體大片段；將所述5864bp片段和所述載體大片段連接，得到的重組載體，記作 PAO α -4sman ；所述pA0815alpha按照如下方法得到將載體pPICZa用McI/EcoRI雙酶切，收集 IOOObp片段；用McI/EcoRI雙酶切載體pA0815，回收載體大片段；將所述IOOObp片段和所述載體大片段連接，得到的重組載體即為pA0815alpha ；所述出發菌株為酵母菌，優選為畢赤酵母菌，再優選為巴斯德畢赤酵母菌株GS115。
3.根據權利要求1或2所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)GS4SMAN，其保藏編號為 CGMCC N0. 4095。
4.一種制備β-甘露聚糖酶的方法，包括如下步驟將權利要求1-3中任一所述重組菌接種于發酵培養基中，發酵培養，得到甘露聚糖酶；將發酵容器內的所有物質記作發酵體系。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述發酵培養基為用于培養畢赤酵母菌的培養基，且其中含有甘油；所述發酵培養依次按照如下三個階段進行階段一包括如下步驟從接種開始培養至發酵體系中的甘油耗盡；階段二 包括如下步驟在發酵體系中的甘油耗盡時，開始流加甘油或甘油溶液，培養至發酵體系的0D_值達到200-350或200或250或320或350，停止流加甘油或甘油溶液；階段三為如下1)或2)所示1)包括如下步驟在發酵體系中的甘油耗盡時，向發酵體系中加入山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液，進行誘導表達；2)包括如下步驟在發酵體系中的甘油耗盡時，將發酵體系的溫度調至^rc ^rc或沈°C或27 °C或觀°C或四°C，向發酵體系中加入山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液，進行誘導表達；所述甘油溶液由甘油、PTM1溶液和水組成；所述甲醇溶液由甲醇、PTM1溶液和水組成。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于所述山梨醇與甲醇的混合水溶液中， 山梨醇與甲醇的質量比為1 20 1 5或1 20或1 10或1 5。
7.根據權利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述山梨醇與甲醇的混合水溶液中，山梨醇的濃度為36g/L-144g/L或36g/L或72g/L或144g/L，甲醇的濃度為720g/L。
8.根據權利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述階段一和所述階段二中的培養在PH值為6. 0、溫度為30°C、溶氧為30%以上的條件下進行；所述階段三中的1)中，誘導表達在PH值為6. 0、溫度為30°C、溶氧為30%以上的條件下進行；所述階段三中的2)中，誘導表達在pH值為6. 0、溫度為 或或27°C或觀！或四！、溶氧為30%以上的條件下進行。
9.根據權利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述階段三中，誘導表達的時間為 60h-160h，具體為 12h-84h 或 36h_84h 或 48h_84h 或 60h_84h 或 19h_i;34h 或 43h_i;34h 或 64h-134h 或 86h_134h 或 lllh_134h ；再具體為 12h、36h、48h、60h、72h、84h 或 19h、43h、 64h、86h、lllh 或 134h ；所述階段一中，所述接種量為5% ；所述階段三中，所述在發酵體系中的甘油耗盡時為從停止流加甘油時計起，0. 5 Ih后；所述溶氧為30%以上為溶氧為30% -100% ；所述發酵培養基為BMGY液體培養基；所述甘油溶液按照如下方法制備將600g-650g或625g甘油、IOml-Hml或UmLPTM1 溶液混合，用水定容至1升。
10.根據權利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述階段三中，所述向發酵體系中加入山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液的方式為先向發酵體系中加入甲醇，使甲醇在發酵體系中的體積濃度為3/1000-7/1000 或5/1000，1. 5小時-2. 5小時或2小時后，再向發酵體系中流加山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液；所述階段一中，所述溶氧為30%以上是通過向發酵體系中通入空氣并調節通入空氣的速率和攪拌發酵體系并調節攪拌發酵體系的速率實現的；所述攪拌速率為 200rpm-900rpm ；所述通入空氣的速率為0. 5L/L發酵培養基/min-1. 5L/L發酵培養基/ min ；所述階段二中，所述溶氧為30%以上是通過向發酵體系中通入空氣并調節通入空氣的速率、攪拌發酵體系并調節攪拌發酵體系的速率、和調節甘油或甘油溶液的流加速率實現的，所述攪拌速率為200rpm-900rpm ；所述通入空氣的速率為0. 5L/L發酵培養基/ min-1. 5L/L發酵培養基/min ；所述流加甘油或甘油溶液的速率為5ml甘油或甘油溶液/L 發酵培養基/h_15ml甘油或甘油溶液/L發酵培養基/h ；所述階段三中，所述溶氧為30%以上是通過向發酵體系中通入空氣并調節通入空氣的速率、攪拌發酵體系并調節攪拌發酵體系的速率、和調節山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液的流加速率實現的，所述攪拌速率為200rpm-900rpm ；所述通入空氣的速率為0. 5L/L發酵培養基/min-1. 5L/L發酵培養基/min ；所述流加山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇的速率為2ml/L發酵培養基/h-6ml/L發酵培養基/h。
全文摘要
本發明公開了一種制備β-甘露聚糖酶的方法及專用菌株。該菌株為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS4SMAN CGMCC NO.4095。本發明公開的重組菌含有多個拷貝的、由甲醇誘導表達的甘露聚糖酶基因。實驗證明，本發明的用該重組菌進行高密度發酵生產堿性甘露聚糖酶的工藝，可使最終堿性甘露聚糖酶在84h的誘導周期內，酶活達到6336u/ml。本發明方法成本低、操作簡單、產率高。因此，本發明方法在甘露聚糖酶的制備領域具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N1/19GK102433267SQ20101029713
公開日2012年5月2日 申請日期2010年9月29日 優先權日2010年9月29日
發明者朱泰承, 李寅, 游麗金, 薛燕芬, 馬延和 申請人:中國科學院微生物研究所