專利名稱：一株短小芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于發酵工程技術領域，具體涉及一株短小芽孢桿菌以及使用該菌株將酒 精轉化為有機酸的方法。
背景技術：
有機酸是成品醋中的重要成分，其組成非常豐富，它不僅決定了食醋的酸味質量， 還是決定成品醋緩沖性和PH的重要物質之一，同時它還影響產品的貨架期和生物安全性。 盡管食醋中酸含量很高，但并無刺激感，酸味很柔和，這其中有機酸的作用是非常重要的。目前發現用于食醋釀造過程的微生物主要有乳酸菌(Lactic acid bacteria), 乳桿菌(Lactobacillus)、醋酸菌(Acetic acid bacteria)、酵母菌(Saccharomycete)、曲 霉菌(Aspergillus)。但未見報道采用本發明所述短小芽孢桿菌用于食醋的釀造。本發明 從鎮江香醋醋醅中分離出一株產酸的短小芽孢桿菌，液態發酵顯示該株芽孢桿菌可以產生 多種有機酸，并且對醋的風味具有一定作用。
發明內容
本發明提供了一株短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，該菌株篩選自鎮江香醋醋 醅中，于2010年5月11日保藏于中國普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC 3824。獲取所述菌株16S rDNA序列，在GenBank中進行BLAST比對確定其種屬，該菌株 16SrDNA全長序列為1495bp，與其具有最高同源性的菌株為Bacillus pumilus (GenBank登 錄號 EU373381)，相似性為 99% ；16S rDNA 序列見 SEQ ID NO :1。所述菌株可利用乙醇發酵生產乙酸、琥珀酸、蘋果酸和乳酸組成的有機酸。所述發酵生產有機酸的工藝為種子培養基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L，pH7.0，115°C 下滅菌20min ；液態發酵培養基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5-lOg/L，氯化鈉5-lOg/L， pH7. 0，115°C下滅菌20min ；待培養基冷卻至室溫，加入6% (w/w)無水乙醇；種子培養方法250mL三角瓶裝液量25mL，搖床轉速120rpm，37°C培養；發酵培養方法以5-10%的接種量將種子接入發酵培養基，250mL三角瓶裝液量 25mL，搖床轉速120rpm，37°C培養。本發明還提供了一種所述菌株的應用，采用上述發酵生產有機酸的工藝，該菌株 發酵生產的乙酸、琥珀酸、蘋果酸和乳酸組成的有機酸可應用于食品領域。本發明還提供了一種所述菌株的應用，在釀醋過程中加入所述短小芽孢桿菌，可 提高原料的利用率以及改善醋的風味。本發明從醋醅中篩選得到一株具有較好有機酸生產能力的菌株，經鑒定為短小 芽孢桿菌。該菌株可產生乙酸、琥珀酸、蘋果酸和乳酸組成的有機酸，其有機酸總量達到 6. 25g/L，在釀醋過程中添加該菌株，可提高原料的利用率以及改善食醋的風味。
具體實施例方式實施例1 產酸芽孢桿菌的篩選從鎮江香醋醋醅中取10g樣品裝入混有玻璃珠和90mL無菌水的500mL三角瓶中， 在37°C搖床上以115r/m振蕩30min，然后取菌懸液lmL用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋，以 10_3和10_4梯度稀釋樣涂布GYC平板，37°C培養48 72h ；根據其在GYC平板上有無透明 圈來判斷是否是產酸菌，然后挑取透明圈明顯、菌落豐厚的菌落經分離純化后接入斜面培 養基，37 °C培養48h，4°C保藏。分離培養基(GYC)酵母粉1%，葡萄糖1%，碳酸鈣0.5%，瓊脂2%，115°C滅菌 20min后冷卻至50°C加入無水乙醇6% (v/v)。斜面培養基(肉湯)酵母粉0. 5%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，NaCl 0.3%，瓊脂 2%, pH7. 0-7. 2，115°C滅菌 20min。根據分離培養基中透明圈大小挑取菌株，并且在添加乙醇的液體培養基上驗證有 機酸產量，并結合其在平板上的菌落形態，得到4株高產有機酸的細菌，于4°C置于斜面培 養基中保藏以備進一步分析。實施例2 產酸菌的分子鑒定純化篩選得到的細菌，取指數生長期新鮮菌液，離心收集菌體，采用基因組抽提試 劑盒提取基因組DNA。采用細菌通用引物Pfh擴增其16S rDNA全長序列，具體如下P0 5' -GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’Pfi :5，-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA—3，
①反應體系(50u 1) 10 X buffer (Mg2+) dNTPs(2. 5mM) P0(12. 5uM)
P6(12. 5uM)
ExTaq DNA 聚合酶(OT/ul)
Template DNA
ddH20
②反應程序 預變性
5. Oul 4. Oul
2. Oul 2. Oul
1. Oul 2. OuL 34ul
95 °C
變性 退火 延伸
95 °C 56°C 72V
45 S 45 S 90S
終延伸
72 °C
4min
(30個循環)
8min
PCR產物用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離檢驗，電壓約llV/cm，電泳時間20分鐘。 PCR擴增產物的純化按上海生工生物技術公司的小量膠回收PCR產物純化試劑盒 說明進行，測序由上海生工生物技術公司完成。 獲得其中一株細菌16S rDNA序列，在GenBank中進行BLAST比對確定其種
4屬，該菌株16S rDNA全長序列為1495bp，與其具有最高同源性的菌株為Bacillus pumilus(GenBank 登錄號 EU373381)，相似性為 99% ；16S rDNA 序列見 SEQ ID N0:1。該菌株于2010年5月11日保藏于中國普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為 CGMCC3824。實施例3 :HPLC測定有機酸組成將CGMCC 3824接種于發酵培養基中，37°C液態發酵144h，通過HPLC測定其發酵液 中的有機酸組成。種子及液態發酵培養基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L， pH7. 0，115°C下滅菌20min ；待培養基冷卻至室溫，加入6% (w/w)無水乙醇。采用高效液相色譜法測定鎮江香醋中有機酸的含量。具體方法如下①有機酸提取準確吸取5ml發酵液，12000rpm離心lOmin，取上清，分別加入亞鐵氰化鉀(106g/ L)和30%硫酸鋅溶液去蛋白，濾紙過濾。濾液用0. 22iim膜過濾，再用S印-Pak C18過濾處 理后進HPLC。與此同時，以草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、a-酮戊二酸、乳酸、乙酸、檸檬 酸、富馬酸和琥珀酸為標準品，其濃度如表1所示。表 權利要求
一株短小芽孢桿菌，利用乙醇發酵生成有機酸。
2.如權利要求1所述短小芽孢桿菌，其特征在于，所述有機酸為乙酸、琥珀酸、蘋果酸 和乳酸組成的混合酸。
3.如權利要求2所述短小芽孢桿菌，其特征在于，保藏編號為CGMCC3824。
4.如權利要求3所述短小芽孢桿菌，其特征在于，其16SrDNA序列具有SEQ ID NO=I 所示的序列。
5.如權利要求4所述短小芽孢桿菌，其特征在于，該菌株培養基為葡萄糖20g/L，蛋白 胨 10g/L，酵母粉 5g/L，氯化鈉 5g/L，ρΗ7· 0。
6.如權利要求4所述短小芽孢桿菌，其特征在于，所述生成有機酸的方法為培養基滅 菌后，加入乙醇，接入所述菌株，通氣條件下，37°C培養。
7.如權利要求6所述短小芽孢桿菌，其特征在于，所述方法中乙醇濃度為6%(w/w) 0
8.如權利要求6所述短小芽孢桿菌，其特征在于，所述方法中菌株接種量為5%-10% (w/w) O
9.一種權利要求1所述短小芽孢桿菌的應用，其特征在于，發酵生產乙酸、琥珀酸、蘋 果酸和乳酸組成的有機酸。
10.一種權利要求1所述短小芽孢桿菌的應用，其特征在于，在釀醋過程中加入所述短 小芽孢桿菌，提高原料的利用率以及改善食醋的風味。
全文摘要
本發明公開了一株短小芽孢桿菌以及該菌株的應用，屬于發酵工程技術領域。該菌株于2010年5月11日保藏于中國普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.3824。經發酵培養，該菌株可產生乙酸、琥珀酸、蘋果酸和乳酸組成的有機酸，其有機酸總量達到6.25g/L，在釀醋過程中添加該菌株，可提高原料的利用率以及改善食醋的風味。
文檔編號C12J1/00GK101974457SQ20101029711
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月30日 優先權日2010年9月30日
發明者史勁松, 李國權, 王明法, 竇文芳, 許偉, 許正宏, 陸震鳴 申請人:江南大學