真菌抗性植物和它們的用途的制作方法

專利名稱：真菌抗性植物和它們的用途的制作方法
真菌抗性植物和它們的用途本申請是申請日為2004年8月3日、發明名稱為“真菌抗性植物和它們的用途”的 中國專利申請 200480022723. 6 (PCT/EP2004/008683)的分案申請。本發明涉及增加植物，尤其茄科(Solanaceae)植物，優選馬鈴薯和番茄對卵菌 (Oomycetes)門的植物病原體的抗性的新方法，所述方法包括增加本發明多肽的活性。本發 明還涉及多核苷酸和包含這些多核苷酸的載體。本發明還涉及相應的載體、細胞、轉基因植 物和來自它們的轉基因繁殖材料，涉及產生它們的方法，還涉及它們用于生產糧食、飼料、 種子、藥物或者精細化學品的用途。植物生物技術工作的目的是產生具有有益的新性質的植物，例如，用于增加農 業生產力，增加糧食質量，或者產生特定化學品或者藥物(Dimwell JM(2000)J Exp Bot 51Spec No:487-96)。植物對于病原體的天然防御機制通常是不足的。僅真菌病就導致每 年幾億美元的產量損失。導入來自植物、動物或者微生物來源的外來基因可以增加防御。實 例是通過表達處于35SCaMV啟動子控制下的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis) 內毒素保護煙草免于昆蟲的攝食損害(Vaeck等人(1987)NatUre 328 :33_37)或者通過 表達處于CaMV啟動子控制下的豆幾丁質酶保護煙草免于真菌感染(Broglie等人(1991) Science 254:1194-1197)。然而，所描述的多數方法僅僅提供了對一種病原體或者窄范圍 病原體的抗性。盡管19世紀中葉眾所周知的愛爾蘭馬鈴薯饑荒，晚疫仍然是農作物植物中所有 疾病最具破壞性的疾病之一。晚疫由卵菌真菌致病疫霉(Phytophthora infestans)導致， 致病疫霉是一種特化病原體，其主要在許多茄科物種，尤其馬鈴薯和番茄的葉子和果實上 導致疾病。首次在墨西哥觀察到該真菌，由于幾種原因，認為墨西哥是該真菌的起源中心。 在例如Toluca地區提取永久存在兩種交配型Al和A2。而且，有報導在墨西哥的偏遠地區 的當地茄屬物種上存在致病疫霉。此外，在墨西哥發現具有塊莖茄屬的許多種具有對晚疫 的高水平抗性。預防農作物死亡或者產量減小的主流措施意味著應用殺真菌劑防止或者治 療致病疫霉導致的感染。代替化學殺蟲劑的大量使用用于控制晚疫的備選方法是有益的 使用栽培種，其具有對晚疫的部分或者完全抗性。為了得到晚疫抗性，培育者在過去專注于 來自墨西哥本地一種野生馬鈴薯種Solanum demissum的顯性R基因的漸滲現象。已經鑒 定了 11種此類基因，它們的一些已經定位到馬鈴薯的遺傳學圖的特定基因座(Gebhardt和 Valkonen, 2001中綜述)并且最近已經克隆了 Rl基因。Rl和R2分別位于5號和4號染色體。 R3、R6和R7位于11號染色體上。賦予對晚疫的品種特異抗性的未知R基因也已經在馬鈴薯 andigena 亞禾中(S. tuberosum ssp. andigena)禾口 S. berthaultii 與 S. pinnatisectum 中描 述。在任何情況下，這些R基因誘導的抗性(幾乎)是完全的但是似乎不能持久。因為高水 平抗性和容易轉移，所以許多栽培種含有S. demissum衍生的抗性。不幸的是，S. demissum 衍生的品種特異抗性盡管幾乎是完全的，但是不是持久的。一旦在商業田間中以大規模生 長新近培育的馬鈴薯栽培種，就出現致病疫霉的新毒性，其使得該病原體能夠克服漸滲的 抗性。在一些墨西哥和中南美洲茄屬種中可以發現對晚疫的更持久的田間抗性，其通常可 以在本質上定量并且認為是品種非特異的。然而，通過雜交和表型選擇通常難以將該類型的抗性轉移到馬鈴薯栽培種中。來自墨西哥和危地馬拉的二倍體S. bulbocastanum是一種具有塊莖的物種，很久 以來就知道它對晚疫具有高水平抗性。不幸的是，由于倍性和胚乳平衡數(EBN)中的困難， 通常不能實施將抗性從茄屬物種轉移到培育的馬鈴薯的經典轉移。盡管有這些困難，但是 S. bulbocastanum抗性性狀的漸滲已經取得了成功。最近，發現S. bulbocastanum和馬鈴 薯的體細胞雜種和回交的種質即使在極大的疾病壓力下也對晚疫是高度抗性的(Helgeson 等人，1998)。盡管有重組抑制的報導，但是回交材料中的抗性似乎在8號染色體內RFLP標 記CP53和CT64之間的約6cM間隔上。來自番茄RFLP探針CT88的CAPS標記與抗性共分 罔。因此，近年來，對卵菌門病原體抗性植物的開發穩步前進。然而，對可用的種質的 40年的深入和持續的研究和育種工作仍然沒有導致在市場上引入抗性栽培種。近年來鑒定 的多數基因僅僅是品種特異抗性。此外，所實現的抗性不是持久的。此外，普遍認為植物保 護劑的應用造成環境負擔。從而，在一些西方國家，法律變得更嚴格并且部分禁止應用特定 殺真菌劑，使得疾病的化學控制更加困難。此外，化學控制是昂貴的。最后，另一個限制是 世界上許多國家已經報導真菌產生了對特定殺真菌劑如甲霜靈的抗性。因此，本發明的根 本問題是提供有效保護植物免于晚疫和相關疾病的新手段和方法。通過提供權利要求中表征的實施方案解決了技術問題。因此，本發明涉及產生或者增加植物對卵菌門植物病原體的抗性的方法，其包括 增加植物或植物或其部分中組織、器官或細胞中Rpi_blb2蛋白質的活性。Rpi-blb2是LZ-NBS-LRR型R基因并且顯示出與賦予對三種根結線蟲 (Meloidogyne spp.)的抗性的番茄基因Mi-I以及與馬鈴薯蚜蟲馬鈴薯長管蚜 (Macrosiphum euphorbiae) (Vos 等人，1998 ；Rossi 等人，1998 ；MiIligan 等人，1998)和與 粉虱(煙粉虱(Bemisia tabaci)) (Nombela等人，2003)的B-和Q-生物型的序列同源性。 如對于Rpi-blb所發現的，Rpi_blb2也賦予對攜帶多種毒性因子的一系列致病疫霉分離物 的完全抗性，并且還沒有表現出品種特異性。術語“Rpi_blb2”指編碼具有本文提到的Rpi_blb2蛋白質活性的多肽的多核苷酸 或者具有所述Rpi_blb2蛋白質活性的多肽。下文中術語“Rpi_blb2”涉及多肽還是多核苷 酸可以從其使用的上下文中明確。術語“產生”或“增加”或“刺激” “植物的抗性”指與參照相比，增加或產生或刺激 了植物或其部分的抗性。“賦予”、“現有”、“產生”、“刺激”或“增加”病原體抗性指在相同條件(例如，氣候 條件、生長條件、病原體種類等等)下，與沒有應用根據本發明方法的野生型植物相比，由 于應用了根據本發明的方法，特定植物種或者變種的防御機制對一種或多種病原體的抗性 增加。增加的抗性優選表現在疾病癥狀表現的減小，疾病癥狀除了包括上面提到的不利效 果外還包括例如病原體進入植物或者植物細胞的穿透效率或者病原體在植物或植物細胞 內部或者上面的繁殖效率。在該上下文中，疾病癥狀優選減小至少10%或至少20%，尤其 優選至少40 %或60 %，非常特別優選至少70 %或80 %，最優選至少90 %或95 %。術語“增加的”在此指基因產物活性比參照中的活性高。從而，術語“增加的”包 括如果在參照中沒有發現活性(例如，本文描述的Rpi_blb2活性)，那么從頭產生的該活性(例如，Rpi_blb2基因產物或者另一種基因產物的活性)。術語“增加的”還涉及基因產物 活性的刺激。可以以多種方法刺激基因的增加的表達，即它的活性，所述方法為例如對生物 應用化學品或者通過生物應激。例如，通過用寄生蟲，例如，用致病疫霉感染可以激活針對 感染性寄生蟲介導基因的抗性并且該抗性賦予對相同和/或其他病原體的增加的抗性。從而，在下文中，術語“增加”還包括術語“刺激”和“產生”。“病原體抗性”表示病原體感染后植物的疾病癥狀的減輕或者減弱。癥狀可以是多 樣的，但是優選包括對植物的質量、產量、用作飼料或糧食的適宜性直接或間接具有不利影 響，或者使得播種、種植、收獲或加工農作物困難的那些癥狀。在本發明范圍內“病原體”作為實例但不作為限制指病毒或者類病毒、細菌、真菌、 動物害蟲，如昆蟲或者線蟲。術語“Rpi_blb2”蛋白質涉及蛋白質或多肽，其在植物或植物部分中的表達與非抗 性株系相比賦予該植物或植物部分對本文描述的病原體的抗性。與具有相同遺傳背景但是沒有允許Rpi_blb2的表達必需的遺傳元件的植物或者 其部分(本文稱作“野生型”或者“參照”)相比，包含Rpi_blb2蛋白質的增加的活性的植 物或植物組織、或者細胞或者植物部分對于病原體，尤其卵菌門病原體，優選對于致病疫霉 的敏感性較低。測試植物或者其部分的抗性的測定法是本領域技術人員熟知的。對致病疫 霉的抗性可以定義為根據Flier，2001的孢子形成指數。Flier將孢子形成指數描述為每 Icm2孢子形成水平。從而，與野生型相比每Icm2孢子形成的20%減少在本文定義為抗性。 在闡明本發明的實施例中，孢子形成指數定義為每個病灶孢子形成的水平。從而，術語“抗 性”可以備選地指與野生型相比每個病灶孢子形成減少20%。優選后一定義。在優選實施方案中，在測定中孢子形成減少30 %，更優選減少50 %，甚至更優選 減少70%，更優選減少80%以上，更優選減少85%和90%。最優選減少95%或以上。因此，在本發明中，Rpi_blb2蛋白質的“活性”指蛋白質表達賦予孢子形成指數的 所述減少。此外，觀察到含有Rpi_blb2的植物對致病疫霉感染的典型應答是在生長期結束 時存在小病灶，沒有明顯的孢子形成。從而，在一個實施方案中，Rpi_blb2的活性定義為在 所描述的實驗中存在沒有任何明顯孢子形成的小病灶。Rpi_blb2抗性表現出壞死區域，其 含有低水平孢子形成。用離脫葉進行的實驗例證了 Rpi_blb2的活性。該實驗在實施例17 和

圖18中描述。Rpi_blb2和其他致病疫霉抗性基因之間的差異是Rpi-blb2允許低水平孢 子形成(圖18)。在其中Rpi-blb2基因型(ARD92-1197-16)上存在病灶的離脫葉測定顯示 了低水平孢子囊，而含有S. demissum基因R2的基因型上完全沒有孢子囊。孢子形成指數 為敏感表型(cv. Bintje)的僅1. 1%。田間實驗也表明Rpi_blb2允許低水平感染。在生長期期間(圖3，ARF87_801)或 者生長期結束時(圖2，ARF87-601 ；圖3，ARF87-507和ARF87-601)產生晚疫癥狀。從而，在一個實施方案中，Rpi_blb2的活性還定義為在植物中表達后導致壞死區 中含有如所述實驗中描述的低水平孢子形成。從而，在一個實施方案中，本發明的方法產生顯示出含有低水平孢子形成或更低 水平孢子形成的壞死區的植物。術語“參照”涉及生物或者其部分，例如，細胞，所述生物或者其部分在基因組、蛋 白質組和/或代謝組與相關生物或者其部分，例如細胞，例如，與本發明的植物基本相同。
從而，術語“參照”涉及例如生物或者其部分，例如，細胞，所述生物或者其部 分在遺傳、蛋白質組和/或代謝上與本發明的生物或者其部分基本相同，但是由于在參 照的基因組、蛋白質組或者代謝組中存在相關差異，不能觀察到它的特定基因產物(例 如，Rpi-blb2)的活性。從而，參照可以是不表達或者表達很少相關活性基因產物的植 物或者其部分，例如，它不編碼Rpi_blb2或者不轉錄Rpi-blb2編碼基因或者不翻譯活 性Rpi-blb2mRNA。從而，參照不提供產生足量活性基因產物而導致所述表型的修飾。兩 種植物是否基本上在遺傳上相同可以用本領域技術人員已知的測定法測試，例如，如用 Roldan-Ruiz, Theor. Appl. Genet.，2001，1138-1150 描述的指紋分析測試。可以如本領 域描述的測試蛋白質的表達模式，例如，用通過凝膠電泳(一維、二維、三維)、質譜分析 禾口例如，在 www. waters, com，www. proteine. org. au，www. proteomesci. com，www. sdu. dk/ Nat/CPA中描述的其他方法進行。技術人員按照本領域描述的可以分析代謝組，例如，通過 HPLC, GC、OPLC, LC-MS, GC-MS, LC-MS-MS 和例如，在 www. metabolic-explorer, com, www. ki. se/icsb2002/pdf/ICSB_209. pdf, www. genomics, rug. nl/technologies, htm, Fiehn 等 人，Nature Biotech, 18(2000)，1157，Raamsdonk 等人，Nature Biotech, 19 (2991)，45-50， Buchholz，Anal. Biochem，295 (2001) 129-137，Soga等人，Anal Chem. 74 (2002) 2233-2239 中 描述的其他方法實施所述分析。為了增加對病原體的抗性，參照生物或者其部分對于病原體，例如植物病原體，例 如，致病疫霉的感染是敏感的。優選地，參照是生物的克隆，該克隆中例如，已經導入相關多核苷酸，例如，本發明 的多核苷酸，或者激活劑，例如，介導活性的相關基因產物的激活劑，例如，增加相關多核苷 酸或者所述多核苷酸衍生物的表達的激活劑，或者相關多肽，例如本發明多肽的激活劑，和 /或相應的相關基因產物編碼載體。例如，本發明方法中的優選參照是生物或者其部分，其 是生物的克隆或者其部分，例如，細胞，所述克隆或者其部分已經用本發明的多核苷酸或者 載體轉染或者轉化。如果不能鑒定所述克隆，本領域技術水平是切除或者敲除或者關閉基本上介導相 關活性的那些元件，所述相關活性為例如介導增加的Rpi_blb2活性，例如，介導生物，例如 植物中增加的表達。本領域技術人員公知怎樣減小或者抑制相關基因產物的活性，例如通 過減小或者抑制例如Rpi_blb2的表達。然后此類克隆可以與根據本發明的方法產生的生 物，例如，與致病疫霉抗性、表達Rpi-blb2的基因型生物比較。本文所用的術語“植物”指植物界的高等和低等植物的所有屬和種。該術語包括 成熟植物、種子、芽和幼苗和它們的衍生部分、繁殖材料、植物器官、組織、原生質體、愈傷組 織和其他培養物，例如，細胞培養物，和給予功能或結構單位的任意其他類型的植物細胞分 組。“成熟植物”指幼苗之外的任意希望的發育階段的植物。幼苗指在早期發育階段的幼小 的不成熟植物。“植物”包括所有一年生和多年生單子葉植物和雙子葉植物。本發明范圍 內優選為用作糧食或者飼料的那些植物，例如，單子葉或者雙子葉屬，尤其種，像上述種，例 如，分別谷類種或者茄科的成員，最優選馬鈴薯和番茄。如本領域技術人員已知的，本發明的方法還包括選擇那些植物，在所述植物中與 參照植物相反或相比，對至少一種所述病原體的抗性已經存在或者增加。關于其中與參照植物相反或相比，對至少一種所述病原體的抗性已經存在或者增加的植物的“選擇”指適于識別針對病原體的現有或者增加的抗性的所有那些方法。這些 可以是病原體感染的癥狀，但是也可以包括本文描述的癥狀，其涉及植物的質量、產量、用 作飼料或者糧食的適宜性等等。因此，在本發明方法的一個實施方案中，Rpi_blb2蛋白質由包含核酸分子的多核 苷酸編碼，所述核酸分子選自a)編碼SEQ ID NO 2或者4中描述的多肽的至少成熟形式的核酸分子；b)核酸分子，其包含編碼所述多肽的至少成熟形式的如SEQ IDNO :1或3，或5或 6中描繪的編碼序列；c)核酸分子，其核苷酸序列由(a)或者(b)的核苷酸序列的遺傳密碼簡并產生；d)核酸分子，其編碼的多肽通過從(a)到(C)的多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序 列的一個或幾個氨基酸的替代、缺失和/或加入從(a)到(c)的多核苷酸編碼的多肽衍生；e)核酸分子，其編碼的多肽的序列與(a)或(b)的核酸分子編碼的多肽的氨基酸 序列具有70%或以上的同一性；f)核酸分子，其包含(a)到(e)任一項的核酸分子編碼的多肽的片段或者具有表 位的部分；g)核酸分子，其包含的多核苷酸具有用表3b中所列引物，尤其ARFlF和ARFlR從 核酸文庫擴增的核酸分子的序列；h)核酸分子，其編碼(a)到(g)任一項編碼的多肽的以氨基酸1、30、50、100、 200、300、500 或 1000 開始并以氨基酸 1276、1000、500、300、200、50、30、或 1 結束的片段；i)包含(a)或(d)任一項的多核苷酸的至少20個核苷酸的核酸分子；j)核酸分子，其編碼的多肽被針對(a)到(h)任一項的核酸分子編碼的多肽產生 的單克隆抗體識別；k)核酸分子，其可以通過用具有(a)到(j)任一項的核酸分子或者其至少15個， 優選30、60、100或更多核苷酸的片段的序列的探針在嚴格條件下篩選適宜文庫得到；和1)核酸分子，其互補鏈在嚴格條件下與(a)或(k)任一項的核酸分子雜交；或者(a)到(1)任一項的互補鏈；或者表達Solanum bulbocastanum的連鎖群6的區段編碼的多肽，所述區段與選 自表3A的標記共分離，并且所述多肽介導對病原體，尤其選自卵菌門病原體的抗性。在一個實施方案中，本發明方法的多核苷酸不由Seq. ID NO. :7和/或9中描述的 序列組成和/或不由編碼Seq. ID NO. :8和/或10中描述的蛋白質的核酸分子的序列組 成。在一個實施方案中，本發明方法的多核苷酸不由Mil. 1或者Mil. 2的核酸分子的 序列組成和/或不由編碼Mil. 1或者Mil. 2蛋白質的核酸分子的序列組成。從而，在一個實施方案中，本發明方法的多核苷酸不由Rossi等人1998，PNAS USA 95 :9750-9754，Milligan 等人，1998. Plant Cell 10 1307-1319 ；和 / 或 WO 9806750 中所 示的序列組成。在圖15和17中顯示了 Rpi-blb2,Mil. 1和Mil. 2的序列比較。本文所用術語“連鎖群”涉及兩種或多種性狀和/或基因座和/或基因和/或標 記，它們由于所述性狀和/或基因座和/或基因和/或標記之間的關聯而傾向于一起遺傳。 性狀和/或基因座和/或基因和/或標記越密切，在DNA修復或者復制過程，如真核生物中有絲分裂或減數分裂期間它們分離的概率越低，從而它們將一起遺傳的概率越大。連鎖群 與染色體的同源對一樣多。術語“連鎖群6”涉及與6號染色體關聯的馬鈴薯或番茄的連鎖群，通過基于 Bernatzky和Tanksley (1986)和Tanksley等人(1992)發表的工作鑒定已知染色體位置的 標記建立此類關聯。連鎖群具有與它們的各自染色體相同的編號。在番茄中，根據粗線期 測量的染色體的長度對染色體編號。此類編號已經由BartOn(1950)采用；1號染色體是最 長的，12號染色體是最短的。除了長度，諸如著絲粒的位置和異染色質的量和分布的特征 用于鑒定每個染色體。短臂通過“S”表示，長臂用“L”表示；從而如在Barton，D.W. (1950) American Journal of Botany. 37,639-643, Bernatzky, R.禾口 Tanksley, S. D. (1986) Genetics 112，887-898，Tanksley，S.D.，等人，(1992) Genetics 132，1141-1160 中，“IS” 表示1號染色體的短臂。本文所用術語“共分離”涉及兩種或多種緊密連鎖的性狀和/或基因座和/或基 因和/或標記傾向于一起遺傳。例如，6號染色體的與Rpi_blb2共分離的更具體的區域是短臂，其在番茄中具有 形態學標記Mi。因此，在一個實施方案中，本發明涉及本發明的方法，其中Rpi_blb2蛋白質由本 發明的多核苷酸編碼，例如，由Seq. ID. 1或3或5或6中所示的多核苷酸或者其片段編碼。基于BLASTX檢索，與所鑒定的Rpi_blb2序列具有最高同源性的所鑒定基因是 Mil. 1和Mil. 2基因和蛋白質；見圖15和17。兩種基因都與Seq. ID. 1或3或5或6中描述 的序列具有高同一性但是不賦予對卵菌門植物病原體的抗性。因此，Mil. 1和Mil. 2的活性 不同于本發明多肽活性。Mil. 1和Mil. 20RF的序列和編碼蛋白質在本文中以Seq. ID NO. 7到10顯示。此外，申請EP 401764. 4涉及Mi-基因。現有技術Mil. 1-和Mil. 2-基因的 序列排除在本發明多核苷酸之外，具體排除Seq. ID NO. :7和9。還包括編碼Seq. ID N0. 8或10的多肽的多核苷酸序列。從而，在一個實施方案中，還排除編碼Mil. 1和Mil. 2蛋白 質的序列。與本發明的多核苷酸編碼的多肽具有較低同源性的蛋白質是Hero抗性蛋白質 1 和 2(Genbank 檢索號gi26190252 和 gi26190254)、番茄斑萎病毒(Tospovirus)抗性蛋 白質 A、B、C、D 禾口 E[Genbank 檢索號gil5418709、gil5418710、gil5418712、gil5418713、 gi 15418714] ；Rl [Genbank 檢索號gi 17432423]和 Prf [Genbank 檢索號gi8547237]，它們 的序列或者編碼的序列也排除在本發明的序列之外。本文中所用術語“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、或者“核酸分 子”指任意長度的核苷酸的聚合形式，可以為核糖核苷酸或者脫氧核糖核苷酸。該術語僅指 分子的一級結構。從而，該術語包括雙鏈和單鏈DNA和RNA。它還包括已知類型的修飾，例如，甲基 化、一個或多個天然發生的核苷酸用類似物的“帽”替代。優選地，本發明的DNA序列包含 編碼本文定義的多肽的編碼序列。“編碼序列”是核苷酸序列，當置于適宜的調節序列的控制下時，所述核苷酸序列 轉錄成mRNA和/或翻譯成多肽。由5’末端的翻譯起始密碼子和3’-末端的翻譯終止密碼 子決定編碼序列的界限。編碼序列可以包括，但不限于mRNA、cDNA、重組核苷酸序列或者基 因組DNA，而在某些條件下也可以存在內含子。
“雜交”指此類核酸分子在常規雜交條件下，優選在如Sambrook(Molecular Cloning ；A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor，NY(1989))描述的嚴格條件下雜交。此類嚴格雜交條件的一個實例是在 4XSSC 65°C下雜交，然后在0. IXSSC 65°C下洗滌1小時。備選地，代表性嚴格雜交條 件是在50%甲酰胺，4XSSC中，42°C下。此外，洗滌步驟期間的條件可以選自低嚴格條件 (約2XSSC 50°C下)和高嚴格條件(約0.2XSSC 50°C，優選65°C下)界定的條件范圍 (20XSSC:0. 3M檸檬酸鈉，3M NaCl，pH 7.0)。此外，洗滌步驟期間的溫度可以從室溫，約 22°C的低嚴格條件升高到約65°C的高嚴格條件。兩種參數鹽濃度和溫度可以同時改變或 者兩個參數之一可以保持恒定而僅另一個改變。在雜交期間可以使用變性劑，如甲酰胺或 者SDS。在50%甲酰胺存在下，優選在42°C實現雜交。下面顯示了雜交和洗滌步驟條件的 一些其他實例(1)例如，可以從下面的條件選擇雜交條件a) 4 X SSC 65 °C,b) 6 X SSC 45 °C,c) 6 X SSC, 100mg/ml 變性片段化魚精 DNA，68°Cd)6XSSC,0. 5% SDS, 100mg/ml 變性鮭精 DNA，68°C，e)6XSSC，0. 5% SDS, 100mg/ml 變性片段化鮭精 DNA，50% 甲酰胺，42°C，f) 50% 甲酰胺，4 X SSC 42 V,g)50% (體積/體積)甲酰胺，0. 牛血清白蛋白，0. l%Ficoll,0. 聚乙烯吡 咯烷酮，50mM磷酸鈉緩沖液pH 6. 5,750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉，42°C，h)2X 或 4XSSC，50°C (低嚴格條件)，或i)30到40%甲酰胺，2X或4XSSC，42°C (低嚴格條件)。(2)例如，可以從下面的條件選擇步驟a)0. 015M NaCl/0. 0015M 檸檬酸鈉/0. 1% SDS, 50°C,b)0. IXSSC 65°C,c)0. 1XSSC,0. 5% SDS,68°C,d)0. 1XSSC，0. 5% SDS，50% 甲酰胺，42°C，e)0. 2XSSC,0. 1% SDS,42°C,f)0. 2X SSC 65 °C (低嚴格條件)。在本發明的一個實施方案中，本發明的多核苷酸包含多核苷酸，其與包含或者由 具有Seq ID No. 1或3或5或6所示序列或者其片段的核酸分子組成的核酸分子雜交。所 述片段包含或者優選由 Seq ID No. 1 或 3 或 5 或 6 的 15、20、30、40、70、100、300、500、700、 1000或更多殘基組成。在優選實施方案中，本發明的多核苷酸包含在“嚴格”雜交條件下與包含或者由具 有Seq ID No. 1或3或5或6所示序列或者其片段的核酸分子組成的核酸分子雜交的多核 苷酸。本文所用的術語“在嚴格雜交條件下”指任一種本文提到的嚴格雜交條件。在 另一實施方案中，術語“在嚴格雜交條件下”指在實施例中提及或在Sambrook(Molecular Cloning ；A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY(1989)中所用的雜交條件。在一個優選實施方案中，本文所用的術語“在嚴格雜交條件下”指所有本文提到的 嚴格雜交條件，表示多核苷酸在所有提到的嚴格條件下雜交。來自其他生物的Rpi_blb2可以由其他DNA序列編碼，所述序列在松弛雜交條件 下與Seq ID No. 1或3或5或6中所示序列雜交并且表達時編碼具有Rpi_blb2的活性的 肽。此外，一些應用必須在低嚴格雜交條件下進行，對雜交的特異性沒有任何影響。例如，可 以用本發明的多核苷酸探測總DNA的DNA印跡分析并在低嚴格條件(55°C，2XSSPE，0. 1% SDS中)下洗滌。雜交分析可以揭示僅編碼Rpi_blb2的基因的簡單模式。此類低嚴格雜交 條件的另一實例是4X SSC 50°C下，或者用30到40%甲酰胺在42°C雜交。此類分子包含本 發明的Rpi_blb2的片段、類似物或者衍生物并且例如通過單獨或組合的氨基酸和/或核苷 酸缺失、插入、替代、加入和/或重組或本領域已知的任何其他修飾而與上述氨基酸序列或 者它們潛在的核苷酸序列不同。然而，優選使用高嚴格雜交條件。術語“同源”指各自核酸分子或者編碼的蛋白質在功能和/或結構上等價。與上述 核酸分子同源并且是所述核酸分子衍生物的核酸分子為例如，所述核酸分子代表修飾的變 異，其具有相同的生物功能，尤其編碼具有相同或基本上相同生物功能的蛋白質。它們可以 是天然發生的變異，如來自其他植物變種或品種的序列，或者突變。這些突變可以天然發生 或者可以通過誘變技術得到。等位基因變異可以是天然發生的等位基因變體以及合成產生 或者基因工程化的變體。通過例如，測試所述多肽與抗體的結合可以鑒定結構等價物。結 構等價物具有相似的免疫學特征，例如，包含相似的表位。術語“片段”、“序列的片段”或“序列的部分”指所指的最初序列的截短的序列。截 短的序列(核酸或者蛋白質序列)可以在長度上變化很大；最小尺寸是提供具有所指最初 序列的相當功能和/或活性的序列的足夠大小的序列；而最大尺寸不是關鍵的。在一些應 用中，最大尺寸通常不顯著大于提供最初序列的所希望的活性和/或功能所需的尺寸。通常，截短的氨基酸序列將長為約5到約1260個氨基酸。然而，更典型地，該序列 將最大長約1000個氨基酸，優選最大約500或100個氨基酸。通常希望選擇具有至少約 10、12或15個氨基酸，多達最大約20到約25個氨基酸的序列。術語“表位”涉及抗原內的特異免疫反應位點，也稱作抗原決定簇。這些表位可以 是聚合成分中單體的線陣-如蛋白質中的氨基酸-或者組成為或者包含更復雜的二級或者 三級結構。技術人員將認識到所有免疫原(即，能夠引起免疫應答的物質)都是抗原；然 而，一些抗原(如半抗原)不是免疫原，但是通過偶聯載體分子可以稱為免疫原性的。術語 “抗原”包括對物質的參考，可以產生針對該物質的抗體和/或該抗體對該物質是特異免疫 反應的。在一個實施方案中，本發明涉及Rpi_blb2的表位。術語“一個或幾個氨基酸”涉及至少一個氨基酸但是不多于將導致低于70%同一 性的同源性的氨基酸數。優選地，同一性多于75%或80%，更優選為85%、90%或95%，甚 至更優選為96%、97%、98%或99%同一性。術語“多核苷酸”和“核酸分子”還涉及“分離的”多核苷酸或者核酸分子。“分離 的”核酸分子是與存在于該核酸的天然來源的其他核酸分子分離的核酸分子。優選地，“分 離的”核酸沒有這樣的序列，其天然地在所述核酸所來源的生物的基因組DNA中所述核酸的 側翼(即，位于所述核酸的5’和3’末端的序列)。例如，在多種實施方案中，本發明的多核苷酸可以含有小于約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或0. Ikb或更少的核苷酸序列，其天然 位于所述核酸所來源的生物的基因組DNA中所述核酸分子的側翼。此外，本發明的多核苷 酸，尤其“分離的”核酸分子，如cDNA分子，當通過重組技術產生時可以基本上無其他細胞 材料，或者培養基，或者當化學合成時可以基本上無化學前體或者其他化學品。此外，本發明的多核苷酸包含與上述多核苷酸的核苷酸序列之一或者其部分互補 的核酸分子。與Seq ID No. 1或3或5或6中所示核苷酸序列之一互補的核酸分子是與 Seq ID No. 1或3或5或6中所示核苷酸序列之一足夠互補的序列，從而它可以與Seq ID No. 1或3或5或6中所示核苷酸序列雜交，從而形成穩定的雙鏈體。本發明的多核苷酸還包含與Seq ID No. 1或3或5或6中所示的核苷酸序列或者 其部分至少約70 %，優選至少約75 %，更優選至少約80 %、90 %或95 %，甚至更優選至少約 96%、97%、98%、99%或以上同源的核苷酸序列。本發明的多核苷酸包含與Seq ID No. 1 或3或5或6中所示的核苷酸序列或者其部分雜交，優選在本文定義的嚴格條件下雜交的 核苷酸序列。此外，本發明的多核苷酸可以包含SEQ ID No :1或3或5或6的序列之一的編碼 區的僅一部分，例如，可以用作探針或者引物的片段或者編碼Rpi_blb2蛋白質編碼基因的 生物活性部分的片段。從當前Rpi_blb2蛋白質編碼基因克隆確定的核苷酸序列允許產生 探針和引物，它們設計用于鑒定和/或克隆它在其他細胞類型和生物中的同源物。探針/引 物通常包含基本上純化的寡核苷酸。寡核苷酸通常包含核苷酸序列區，其在嚴格條件下與 例如，SEQ ID No :1或3或5或6中提出的序列之一的反義鏈的至少約12、15個，優選約20 或25個，更優選約40、50或75個連續核苷酸雜交，例如與SEQ ID No :1或3或5或6中給 出的序列之一的反義序列或者其天然發生的突變體雜交。基于本發明核苷酸的引物可以用 于PCR反應中克隆Rpi-blb2同源物，例如，使用本發明的實施例中描述的引物，如表3a或 3b中所示的引物，優選引物ARFlF和ARF1R。用引物univ24R和univl4L進行的PCR將導致 Rpi-blb2的片段，其可以如本文描述的使用。所述引物組可以互換。本領域技術人員已知 組合所述引物以得到所希望的產物，例如，得到全長克隆或者部分序列。基于Rpi_blb2核 苷酸序列的探針可以用于檢測編碼相同或者同源蛋白質的轉錄物或者基因組序列。探針可 以還包含連接該探針的標記物組，例如，標記物組可以是放射性同位素、熒光化合物、酶、或 者酶輔因子。此類探針可以用作基因組標記測試試劑盒的部分用以鑒定表達Rpi_blb2的 細胞，如通過測量細胞樣品中Rpi_blb2編碼核酸的水平，例如，通過檢測Rpi_blb2mRNA水 平或者測定基因組Rpi_blb2基因是否已經突變或者缺失進行所述鑒定。本發明的多核苷酸編碼多肽或者其部分，所述多肽或者其部分包括與SEQ ID No 2或4的氨基酸足夠同源的氨基酸序列從而蛋白質或者其部分保持參與對病原體抗性，尤 其植物中實施例中所描述的Rpi_blb2蛋白質活性的能力。如本文所用的，術語“足夠同源 的”指蛋白質或者其部分的氨基酸序列包括最小數目的與SEQ ID No :2或4的氨基酸序列 相同或等價(例如，氨基酸殘基與本發明的多肽序列之一中的氨基酸殘基具有相似側鏈) 氨基酸殘基，從而所述蛋白質或者其部分能夠參與植物對所述病原體的抗性。在本文描述 了 Rpi-blb2蛋白質活性的實例。從而，Rpi-blb2蛋白質的功能直接或者間接有助于對植 物病原體，優選對本文提到的病原體，更優選對致病疫霉的抗性。所述蛋白質至少約70 %，優選至少約75 %，更優選至少約80 %、90 %、95 %，最優選至少約96%、97%、98%、99%或以上同源于SEQ ID No :2或4的完整氨基酸序列。本發明的多核苷酸編碼的蛋白質的部分優選具有生物活性。如本文提到的，術語“生物活性部分”意在包括部分，例如，結構域/基序，所述部 分賦予對卵菌植物病原體和/或煙粉虱(Bemisia tabaci)和/或蚜蟲的抗性或者具有免 疫學活性從而它結合特異結合Rpi_blb2蛋白質的抗體或者它具有實施例中給出或者本文 描述的活性。通過分離SEQ ID No 1或3或5或6中序列之一的一部分，表達Rpi_blb2蛋白質 或者肽的編碼部分(例如，通過體外重組表達)并評估蛋白質的編碼部分的活性可以制備 編碼本發明多肽的生物活性部分的額外的核酸片段。本發明還包括由于遺傳密碼簡并性而與SEQ ID No 1或3或5或6 (和其部分) 中所示核苷酸序列之一不同從而編碼SEQ ID No :2或4中所示序列編碼的Rpi_blb2多肽 的多核苷酸。此外，本發明的多核苷酸具有編碼蛋白質的核苷酸序列，所述蛋白質具有SEQ ID No :2或4中所示氨基酸序列。在另一實施方案中，本發明的多核苷酸編碼全長蛋白質， 其與SEQ ID No :2或4中所示氨基酸序列基本上同源。此外，本領域技術人員將理解在群體(例如，S.bulbocastanum群體)內可以存在 DNA序列多態性，其導致氨基酸序列中的改變。由于自然變異，Rpi_blb2基因中此類遺傳多 態性可以存在于群體內的個體間。如本文所用的，術語“基因”和“重組基因”指包含編碼Rpi_blb2，優選 S.bulbocastanum Rpi_blb2的可讀框的核酸分子。此類天然變異通常可以導致Rpi_blb2 基因的核苷酸序列中1-5%變異。本發明范圍內意在包括由于天然變異導致并且不改變 Rpi-blb2的功能活性的Rpi_blb2中的任意和所有此類核苷酸變異和所得氨基酸多態性。使用本發明的多核苷酸或者其部分作為雜交探針，根據標準雜交技術，在嚴格雜 交條件下，可以基于與本文公開的S. bulbocastanum Rpi_blb2多核苷酸的同源性分離相應 于Rpi-blb2cDNA的天然變體和非S. bulbocastanum同源物的多核苷酸。因此，在另一實施 方案中，本發明的多核苷酸長為至少20個核苷酸。優選地，它在嚴格條件下與包含本發明 多核苷酸的核苷酸序列，例如，SEQ ID No :1或3或5或6的核酸分子雜交。在其他實施方 案中，所述核酸長為至少20、30、50、100、250或更多個核苷酸。術語“在嚴格條件下雜交” 如上定義并且意在描述雜交和洗滌條件，在該條件下相互至少65%同一的核苷酸序列通常 保持相互雜交。優選地，所述條件使得相互至少約70%，更優選至少約75%或80%，甚至更 優選至少約85%、90%或95%或以上同一的序列通常保持相互雜交。優選地，在嚴格條件 下與SEQ ID No :1或3或5或6的序列雜交的本發明的多核苷酸相應于天然發生的核酸分 子。如本文所用的，“天然發生的”核酸分子指具有天然發生的核苷酸序列的RNA或者 DNA分子(例如，編碼天然蛋白質)。優選地，所述多核苷酸編碼天然的S.bulbocastanum Rpi-blb2。除了可能存在于群體中的Rpi_blb2序列的天然發生的變體外，技術人員將還理 解通過突變可以向編碼Rpi-blb2的多核苷酸的核苷酸序列中引入改變，從而導致所編碼 的Rpi-blb2的氨基酸序列的改變，而不改變Rpi_blb2的功能能力。例如，可以在編碼 Rpi-blb2的核苷酸的序列中，例如，在SEQID No :1或3或5或6中進行導致在“非必需”氨基酸殘基處氨基酸替代的核苷酸替代。“非必需”氨基酸殘基是可以從Rpi_blb2蛋白 質的野生型序列改變而不改變所述Rpi-blb2蛋白質活性的殘基，而“必需”氨基酸殘基是 Rpi-blb2蛋白質活性所需的。然而，其他氨基酸殘基(例如，在具有Rpi_blb2活性的結構 域中不保守或者僅半保守的那些殘基)可能對活性不是必需的，從而可能順從改變而不改 變Rpi-blb2活性。因此，本領域技術人員已知生物之間的密碼子選擇可以不同。因此，他將使得本發 明的多核苷酸的密碼子選擇適于所述多核苷酸或者多肽在其中表達的生物的選擇。因此，本發明涉及編碼Rpi_blb2的多核苷酸，所述Rpi_blb2含有對Rpi_blb2活 性不是必需的氨基酸中的改變。此類Rpi_blb2的氨基酸序列與SEQ ID No :2或4中所含 序列不同，但是仍然保持本文所述的Rpi_blb2活性。所述多核苷酸可以包含編碼多肽的 核苷酸序列，其中所述多肽包含與SEQ ID No :2或4的氨基酸具有至少約70%同一性的氨 基酸序列并且能夠參與對植物病原體的抗性。優選地，所述核酸分子編碼的蛋白質與SEQ IDNo :2或4中的序列具有至少約70%同一性，更優選與SEQ ID No :2或4中序列之一具有 至少約75%同一性，甚至更優選與SEQ ID No :2或4中序列具有至少約80%、90%、95%同 源性，最優選與SEQ ID No :2或4中序列具有至少約96%、97%、98%或99%同一性。為了確定兩條氨基酸序列(例如，SEQ ID No :2或4的序列之一和其突變形式)或 者兩條核酸之間的百分數同一性，為了最優比較目的將序列進行比對(例如，在一個蛋白 質或者核酸的序列中引入缺口以與另一蛋白質或者核酸進行最優比對)。然后比較相應氨 基酸位置或者核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當一條序列(例如，SEQ ID No:2或4 的序列之一)中的位置被與另一條序列(例如，所選序列的突變形式)中相應位置相同的 氨基酸殘基或核苷酸占據時，這兩個分子在該位置同源(即，本文所用的氨基酸或者核酸 “同源性”等價于氨基酸或核酸“同一性”)。兩條序列之間百分數同源性是所述序列共有的 相同位置數的函數(即，％同源性=相同位置數/位置總數X 100)。借助于程序算法GAP (Wisconsin Package 版本 10. 0，University offfisconsin, Genetics Computer Group(GCG), Madison, USA ；Altschul 等人(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389，參照以下)通過比較可以計算同源性，設置下面的參數缺口權重50 長度權重3平均匹配10 平均錯配0例如，在核酸水平與SEQ ID NO 1的序列具有至少80%同源性的序列理解為指一 個序列，其當通過上面的程序算法使用上面的參數設置與SEQ ID NO :1的序列比較時，具有 至少80%同源性。兩條多肽之間的同源性理解為指借助于程序算法GAP(WiSCOnSin Package版本 10. 0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA), ^cBT" 面的參數缺口權重8 長度權重2平均匹配2912 平均錯配_2003，通過比較計算的每條完整序列長度上氨基酸序列的同一性。例如在蛋白質水平與序列SEQ ID NO :2具有至少80%同源性的序列理解為指一 個序列，其當通過上面的程序算法使用上面的參數設置與SEQID NO 2的序列比較時，具有至少80%同源性。在本申請中，用可以在驟w. ebi.ac.uk/tools找到的程序clustalW，選擇序列分 析并選擇選項clustalW(多序列比對)確定同源性。所有選項在標準條件下進行，如下比對完全；輸出格式aln w/numbers ；輸出順序對準的；顏色調整無; ktup (字號):def ；窗口長def ；得分類型百分數；topdiag :def ；pairgap :def ；矩陣 def ；缺口打開:def ；結束缺口 :def ；缺口延伸:def ；延伸距離:def ；cpu模式單個；樹圖/ 類型進化樹；樹圖/距離隱藏；種系發生樹/樹類型無；種系發生樹/校正距離關；種 系發生樹/忽略缺口 關。因此，優選根據clustalW的同源性計算。通過替代、插入或者缺失，從根據本發明的SEQ ID No :2或4所示的多肽之一衍生 的功能等價物與根據本發明的SEQ ID No :2或4所示的多肽之一具有至少70%，優選至少 80 %，優選至少90 %，特別優選至少95 %，非常特別優選至少98 %同一性并且通過具有與 SEQ ID No :2或4中所示多肽基本上相同的性質區別開來。通過替代、插入或者缺失從根據本發明的SEQ ID No :1或3或5或6所示的核苷酸 序列衍生的功能等價物與根據本發明的SEQ ID No :2或4所示的多肽之一具有至少70%， 優選至少80 %，優選至少90 %，特別優選至少95 %，非常特別優選至少98 %同一性并且編 碼具有與SEQ ID No :2或4中所示多肽基本上相同的性質的多肽。功能等價物的“基本上相同的性質”尤其理解為指賦予病原體抗性表型或者賦予 或者增加對至少一種病原體的抗性而增加所述功能Rpi_blb2等價物在植物或者植物組 織、部分或細胞中的蛋白質的量、活性或者功能。感染后孢子形成和病灶表型聯合功能等價 物的蛋白質量、活性或功能的所述增加理解為基本性質。編碼與SEQ ID No :2或4的蛋白質序列同源的Rpi_blb2的核酸分子可以通過在 本發明的多核苷酸的核苷酸序列，尤其SEQ ID No :1或3或5或6中引入一個或多個核苷 酸替代、加入或缺失來產生，從而向所編碼的蛋白質中引入一個或多個氨基酸替代、加入或 缺失。通過標準技術，如定點誘變和PCR介導的誘變可以向例如SEQ ID No :1或3或5或 6的序列中弓I入突變。優選地，在一個或多個預測的非必需氨基酸殘基上進行保守氨基酸替 代。“保守氨基酸替代”是其中將氨基酸殘基用具有相似側鏈的氨基酸殘基替換的替代。本 領域中已經定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側鏈的氨基 酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具 有不帶電極性側鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、 半胱氨酸)、具有非極性側鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、 苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分枝側鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨 酸)和芳香族側鏈氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。從而，Rpi_blb2中 預測的非必需氨基酸殘基優選用來自相同家族的另一氨基酸殘基替換。備選地，在另一實 施方案中，例如，通過飽和誘變可以沿著Rpi_blb2編碼序列的所有或部分隨機導入突變， 并且可以對所得突變體篩選本文描述的Rpi_blb2活性以鑒定保持Rpi-blb2活性的突變 體。SEQ ID No :1或3或5或6的序列之一誘變后，可以重組表達所編碼的蛋白質并且可 以使用例如，本文描述的測定法(見實施例)測定所述蛋白質的活性。在一個實施方案中，在本發明的方法中，Rpi_blb2蛋白質和另一抗性蛋白質的活 性增加了。
預計在田間條件下一種以上的抗性基因，尤其賦予對相同病原體的抗性的基因的 存在是有益的。對于存在能夠克服一種R-基因的抗性的病原體分離物(例如，致病疫霉品 種)的情況下，其他一種或多種R基因仍然是有功能的，使得所述病原體不能感染植物。兩 種未打敗的R基因的存在大大減小了病原體，尤其致病疫霉品種能夠突變成克服兩種或多 種R基因的品種的機會。在下文中“抗性多肽”或者“抗性蛋白質”涉及多肽，其(增加的)活性將賦予 對敏感基因型(“野生型”或“參照”)的抗性。因此，Rpi_blb2是抗性蛋白質以及例如， Rpi-blb (或者RB或Sbul)。“另一種抗性蛋白質”涉及不同于本發明蛋白質的另一種抗性 蛋白質，而術語“抗性蛋白質”包含本發明的多肽以及一種或多種抗性蛋白質。還理解術語 “和另一種抗性蛋白質”涉及一種或多種其他抗性蛋白質。從而，可以增加一種或多種抗性 蛋白質的活性。在下文中描述了其他抗性蛋白質。然而，通常任意其他已知的抗性蛋白質 可以與本發明的多肽共表達或者可以通過本文描述的關于Rpi_blb2的任意方法增加它的 活性。在優選實施方案中，另一種抗性蛋白質包含LRR結構域和P環。超過30種以上賦予對細菌、真菌、卵菌、病毒、線蟲或者昆蟲抗性的植物疾病抗 性(R)基因的克隆和分子表征允許不管病原體特異性而對它們在結構類別中進行分類 (Dangl和Jones，2001中綜述)。預測所表征的R基因的最豐富的類別(包含擬南芥屬基 因組中預測的基因的約0. 5% )編碼細胞外蛋白質，其攜帶在其他受體和信號轉導蛋白質 中也發現的富含亮氨酸重復單位(LRR)和核苷酸結合位點(NBS)結構域、基序。NBS-LRR R 蛋白質主要在N-末端不同，所述N-末端顯示出與果蠅Toll蛋白質和哺乳動物白介素-1 受體結構域(TIR-NBS-LRR)的序列相似性，或者編碼卷曲螺旋結構(CC-NBS-LRR)，有時為 亮氨酸拉鏈(LZ-NBS-LRR)的形式。盡管可能是膜結合的，但是預測NBS-LRR蛋白質為細胞 質的。相比，預測攜帶LRR的R蛋白質的兩個其他類別跨越細胞膜，具有胞外LRR結構域 LRR-跨膜(LRR-TM) Cf蛋白質和LRR-TM-激酶Xa21蛋白質。所表征的缺少LRR的R蛋白質 是來自番茄的Pto基因、來自甜菜的HsIpm-1基因、來自大麥的mlo基因、來自擬南芥的RpwS 基因和來自大麥的Rpgl基因。根據基因對基因(gene-for-gene)假說，疾病抗性遵循具有無毒性(Avr)功能的 病原體效應分子的植物R蛋白質的觀點，其中通過某種引發子(elicitor)識別復合體引發 信號轉導途徑，導致超敏反應(HR)。與其他受體一起，通常認為NBS-LRR R蛋白質具有調節 結構，其具有分開的識別和發信號結構域，其中LRR是候選識別結構域并且N-末端區包括 NBS——主要的發信號結構域。重組R蛋白質的功能分析表明識別特異性實際上存在于LRR 中。此外，LRR是與相關NBS-LRR蛋白質緊密相關的最多變區并且處于分叉選擇下。然而， 不斷積累的證據表明LRR也通過涉及推定的分子內相互作用的負向調節有助于信號轉導。 當前，已經從馬鈴薯克隆了 5種R基因，包括賦予對晚疫抗性的兩種R基因，并且所有基因 都屬于植物R基因的CC/LZ-NBS-LRR類。盡管S. demissum來源的Rl基因賦予對晚疫的品 種特異抗性，但是最近克隆的S. bulbocastanum來源的基因Rpi-blb (或者RB或者Sbul) 賦予對攜帶多種毒性因子的一系列致病疫霉分離物的完全抗性，并且還沒有表現品種特異 性。此外，如前描述，在墨西哥的田間實驗中，含有Rpi-blb的體細胞雜種的子代植物不受 晚疫的影響，在所述田間中發現幾乎每個品種的真菌。闡明了通過培養的馬鈴薯和番茄中敏感表型的互補，通過用單一克隆的R基因可能實現廣譜晚疫抗性從兩性不相容的宿主物 種向培養的茄科的種間轉移的可能性。US 6，127，607描述了具有LRR結構域和P環的抗 性蛋白質。本文引用US 6，127，607的內容作為參考。具體地，6到8列和11列描述了 LRR 結構域和 P 環。此外，Song，2003，PNAS 100 (16)，9128-9133 說明了圖 4 中 Rpi-blb LRR 基 序的比較并且在第9132上給出關于LRR結構域的概述。在圖14以及圖15中顯示了本發 明多肽的結構域。優選地，選自Rpi-blb (同義詞 RB 或 Sbul)、Rpi-ABPTU Rpi_blb3、Rpi-mcd、Rl、 R-ber (同義詞 R12)、Rpil、R2、R3a、R3b、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、Rll、Ph_l、Ph_2 和 Ph_3 構成的組的一種或多種抗性蛋白質的活性增加了。優選除了 Rpi_blb2之外，至少Rpi-blb 的活性也增加了。在本發明的一個實施方案中，例如，轉基因的Rpi_blb2蛋白質的表達增加了，并 且另一轉基因抗性基因的表達增加了。與Rpi_blb2(或者RB或者Sbul)共表達的抗性蛋 白質優選為本文提到的抗性蛋白質之一，尤其Rpi-blb、Rpi-ABPTU Rpi_blb3、RU Rpil、 R-ber、Rpi-mcd、R2、R3a、R3b、R6、R7、Ph_l、Ph_2或Ph_3，但是也可以是本領域技術人員已 知的賦予對植物病原體的其他抗性之一的蛋白質。如所提到的，根據本發明的術語“增加的表達”也包括多核苷酸或者多肽的從頭表達。最優選的是通過本發明多肽與Rpi-blb的共表達增加抗性。如在實施例和Song 2003，PNAS 100 (16)，9128中描述的，Rpi-blb和Rpi-blb2在離脫葉測定中提供了對致病疫 霉分離物的完全抗性。所述抗性賦予基因例如描述于RB 或者 Sbul (Rpi-blb 的同義詞):AY336128[gi =32693280], (Song 等人，2003)。 包含Rpi-blb基因的BAC克隆177013和CB3A14已經保藏在GenBank，檢索號AY303171和 AY303170 ；Rl :AF447489[gi 9117432422], (Ballvora 等人，2002)；Rpil :Kuhl, J. C. , Hanneman, R. Ε,禾口 Havey, Μ. J, (2201) Ch aracterization and mapping of Rpil,a late blight resistance locus fromdiploid(IEBN)Mexican Solanum pinnatisectum. Molecular genet. Genomics 265 :977_985 ;R-ber :Ewing, Ε. Ε. , Simko, I. , Smart, C. D. , Bonierbale, M. W, Mizubuti, E. S. G, May, G. D,禾口 Fry, W. E, (2000)Genetic mapping fromfield tests of qualitative and quantitative resistance to Phytophthorainfestans in a population derived from Solanum tuberosum and Solanumberthaultii. Molecular breeding 6 25-36 ；R2 :Li, X. ，vanEck, H. J. ，vander Voort, J. N. A. M, Huigen, D. J, Stam, P,禾口 Jacobsen,E. (1998)Autotetraploids and genetic mapping usingcommon AFLP markers the R2 allele conferring resistance toPhytophthora infestans mapped on potato chromosome 4.Theoretical andApplied Genetics 96(8) :1121_112 ;R3、R6、R7 :Elkharbotly, A, Palominosanchez, C, Salamini, F, Jacobsen, EjP Gebhardt,C. (1996)R6 and R7 alleles of potato conferringrace-specific resistance to Phytophthora infestans(Mont)de Baryidentified genetic loci clustering withthe R3 locus on chromosome XI. Theoretical and Applied. Genetics 92(7) :880_884 ;Ph-I =Bonde 禾口 Murphy(1952)Main Agric. Exp. Stn. Bull. No 497 ；Ph-2 =Moreau, P, Thoquet, P. ，Olivier, J, Laterrot, H，禾口 Grimsley，N. H. (1998) Genetic mapping of Ph-2, a single locus controlling partiairesistance to Phytophthora infestans in tomato. Molecular Plant MicrobeInteractions 11(4) 259-269 ；Ph-3 Chunwongse, J, Chunwongse, C. , Black, L.,禾口 Hanson, P. (2002)Molecular mapping of the Ph-3 gene for late blight resistance in tomato. Journal of Horticultural Science & Biotechnology 77(3) :281_286 ;Rpi-blb3、Rpi-ABPTl 禾口 Rpi—mcd :Park，T. H, Van der Vossen, E, Vleeshouwers, V. G. A. A, Tan, A, Visser, R. G. F.禾口 Van Eck, H. J. 2004. Major resistance genes for tuber and leaf resistance to Phytophthorainfestans in potato :An outline of a PhD project. Crop FunctionalGenomics 2004, July 2004, Jeju, Korea, 93 頁；R3a 禾口 R3b Huang, S.，Vleeshouwers, V. G. A. A, Weri j，J. S, Hutten, R. C. B, Van Eck, H.J, Visser, R. G. F,禾口 Jacobsen, E. (2004). The R3resistance to Phytophthora infestans in potato is conferred by two closelylinked R genes with distinct specificities. MPMI 17(4)，428-435 ；在一個實施方案中，根據本發明，Rpi_blb2的活性增加了，例如，本發明多核苷酸 的表達增加了并且編碼 Rpi-blb、Rpi-ABPTl、Rpi-blb3、Rpi-mcd Rl、R_ber、Rpil、R2、R3a、 R3b、R6、R7、Ph-l、Ph-2和/或Ph_3的至少一種核酸分子的表達增加了，其中所述核酸分子 選自a)核酸分子，其編碼至少如下的至少成熟形式Rpi-blb (或者 RB-或者 Sbul-)多肽，優選由 GenBank 檢索號 AY336128[gi 32693280]中所示的序列編碼；Rl多肽，優選由GenBank檢索號AF447489 [gi9117432422]中所示的序列編碼；Rpi-blb3、Rpi-ABPTl 和 / 或Rpi-mcd 多月太，優選由 Park，T. H，Vander Vossen,Ε.， Vleeshouwers, V. G. A. A, Tan, A, Visser, R. G. F.禾口 VanEck, H. J. 2004. Major resistance genes for tuber and leaf resistance toPhytophthora infestans in potato :An outline of a PhD project. CropFunctional Genomics 2004, July 2004, Jeju,Korea,93 頁中所示或者其中的信息可以推導的序列編碼；R3a 和 / 或 R3b 多肽，優選由 Huang，S.，Vleeshouwers, V. G. A. A, Weri j, J. S.， Hutten, R. C. B, Van Eck, H. J, Visser, R. G. F,禾口 Jacobsen, E. (2004). The R3 resistance to Phytophthora infestans in potato isconferred by two closely linked R genes with distinct specificities. MPMI17 (4)，428-435中所示或者其中的信息可以推導的序 列編碼；和/或病原體，優選致病疫霉抗性賦予蛋白質，其如所描述的作圖和表征，例如，對于 Rpil 在 Kuhl, J. C, Hanneman, R. E，禾口 Havey，Μ. J, (2001) Characterization and mapping of Rpi1, a late blight resistance locus fromdiploid(IEBN)Mexican Solanum pinnatisectum. Molecular genet. Genomics 265 :977_985 中；
R-ber ^ Ewing, Ε. Ε, Simko, I. ， Smart, C. D. ，Bonierbale, Μ. W，Mizubuti, Ε·S.G，May，G. D，禾口 Fry，W. Ε，(2000)Genetic mapping fromfield tests of qualitative and quantitative resistance to Phytophthorainfestans in a population derived from Solanum tuberosum and Solanumberthaultii. Molecular breeding 6 :25_36 中；對于 R2 在 Li，Χ.，vanEck，H. J.，vanderVoort, J. N. A. M，Huigen, D. J.，Stam，P，禾口 Jacobsen,E. (1998)Autotetraploids and genetic mapping usingcommon AFLP markers the R2 allele conferring resistance toPhytophthora infestans mapped on potato chromosome 4.Theoretical andApplied Genetics 96(8) :1121_1128 中；對于 R3、R6、R7 在 Elkharbotly，A，Palominosanchez, C，Salamini, F，Jacobsen， Ε.，禾口 Gebhardt， C. (1996)R6 and R7 alleles of potatoconferring race-specific resistance to Phytophthora infestans(Mont)deBary identified genetic loci clustering with the R3 locus on chromosomeXi. Theoretical and Applied. Genetics 92(7) 880-884 中；對于Ph-I 在 Bonde 和 Murphy (1952)Main Agric. Exp. Stn. Bull. No497 ；或對于 Ph-2 在 Moreau, P，Thoquet, P. ，Olivier, J， Laterrot, H，禾口 Grimsley， N. H. (1998)Genetic mapping of Ph_2，a single locus control1ingpartial resistance to Phytophthora infestans in tomato. Molecular PlantMicrobe Interactions 11(4) 259-269中；和/或對于 Ph-3 在 Chunwongse, J，Chunwongse, C.，Black，L.，禾口 Hanson，P. (2002) Molecular mapping of the Ph_3 gene for late blight resistance intomato. Journal of Horticultural Science & Biotechnology 77(3) :281_286 中；或者賦予病原體抗性的多肽，優選從所述出版物可以推導的賦予致病疫霉抗性的 多肽；b)核酸分子，其核苷酸序列是(a)的核苷酸序列由于遺傳密碼簡并導致的序列；c)核酸分子，其編碼的多肽通過從(a)或(b)的多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序 列的一個或幾個氨基酸的替代、缺失和/或加入從(a)或(b)的多核苷酸編碼的多肽衍生；d)核酸分子，其編碼的多肽的序列與(a)的核酸分子編碼的多肽的氨基酸序列具 有70%或以上的同一性；e)核酸分子，其包含(a)到(d)任一項的核酸分子編碼的多肽的片段或者具有表 位的部分；f)核酸分子，其編碼(a)到(e)任一項編碼的多肽的以氨基酸1、30、50、100、 200、300、500 或 1000 開始并以氨基酸 1276、1000、500、300、200、50、30、或 1 結束的片段；g)包含(a)或(b)任一項的多核苷酸的至少20個核苷酸的核酸分子；h)核酸分子，其編碼的多肽被針對(a)到(f)任一項的核酸分子編碼的多肽產生 的單克隆抗體識別；i)核酸分子，其可以通過用具有(a)到(h)任一項的核酸分子或者其至少20個， 優選30或更多核苷酸的片段的序列的探針在嚴格條件下篩選適宜文庫得到；和j)核酸分子，其互補鏈在嚴格條件下與(a)或(i)任一項的核酸分子雜交；或者(a)到(j)任一項的互補鏈。
因此，本發明的方法賦予本發明的所述植物之一、植物組織或者植物細胞對卵 菌門植物病原體的抗性，優選對腐霉目(Pythiales)或者Peronosperales，更優選對腐 霉科或者霜霉科(Peronosporaceae)，更優選對疫霉屬(Phytophthora)或者盤梗霉屬 (Bremia)或者霜霉屬(Peronospera)或者單軸霉屬(Plasmopara)病原體的抗性，最優選 iife^^^lJ^f^^J^^iSeje^iji^l^ft (Phytophthora parasitica var. nicotianae) (導致煙草黑柄等)、大豆疫霉(Phytophthora sojae)(導致大豆中疫霉根部腐爛)、辣椒 疫霉(Phytophthora capsici)(導致胡椒、葫蘆和番茄中腐爛)、紅腐疫霉(Phytophthora erythroseptica)(導致馬鈴薯中粉紅色腐爛)、葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)(導 致葡萄藤霜霉病)、萵苣盤梗霉(Bremia lactuca)(導致萵苣中霜霉病)或者Peronospora tabaci (導致煙草中藍色霉)的物種。通過本領域技術人員公知和例如，在Sambrook等人，Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY, 1989中描述的方法可以在根據本發明的植物、植物細胞、植物組織、 植物器官或植物部分中增加、產生或者刺激Rpi_blb2的活性。從而，在優選實施方案中，本發明涉及本發明的方法，其中表達是從頭表達。術語細胞、組織或者生物或者其部分中的“從頭表達”在本文理解為涉及基因產物 的表達，而以前所述基因產物或者所述基因產物的活性，尤其相應多肽或者多核苷酸在細 胞、組織、或者生物或者其部分中是不可檢測的。優選地，編碼細胞、組織、或者生物或者其 部分中的多肽或者多核苷酸并且應該從頭表達的基因不存在于細胞、組織、或者生物或者 其部分中的基因組中。如果在細胞、組織、或者生物或者其部分中不能檢測到基因產物的表 達，那么通常認為在細胞、組織、或者生物或者其部分中沒有發生表達。因此，如果不能檢測 到活性，那么通常認為沒有相應活性存在。然而，本領域技術人員已知檢測方法和手段發展 到更高靈敏性。從而，在優選實施方案中，術語“從頭表達”涉及系統中新的和額外的表達， 其中例如由于低水平表達或者表達幾乎無活性的基因產物而活性水平太低以致不能賦予 對植物病原體，尤其對致病疫霉的抗性。敲除株系和低和/和高表達株系表型的比較可以 表明是否可以觀察到針對本文提到的病原體的抗性中的差異。因此，在本發明的另一實施方案中，Rpi_blb2和/或另一種抗性蛋白質的內源活 性增加了。通過本領域技術人員已知的方法可以增加細胞中表達水平。本文描述了幾種技 術，例如，本發明的多核苷酸或者多肽的轉基因表達。多核苷酸或者多肽可以是外源來源。 優選地，導入與宿主細胞、植物細胞、植物組織或者植物相同遺傳起源的多核苷酸。通過一些方法可以增加活性，尤其內源活性，還增加轉基因表達的Rpi_blb2的活 性。因此，在優選實施方案中，通過一個或多個下面的步驟增加本文描述的抗性蛋白質的活 性a)穩定抗性蛋白質；b)穩定編碼抗性蛋白質的mRNA ；c)增加抗性蛋白質的比活；d)表達用于抗性表達的同源或者人工轉錄因子或者增加用于抗性表達的同源或 者人工轉錄因子的表達；e)通過外源誘導因子刺激抗性蛋白質活性；
f)表達轉基因抗性基因；和/或g)增加抗性編碼基因的拷貝數。通常，通過增加生物中特定蛋白質，即抗性蛋白質的量可以增加所述生物，尤其植 物細胞、植物、或者植物組織中的活性。“蛋白質的量”理解為生物、組織、細胞或者細胞隔室 中多肽，優選Rpi_blb2的量。蛋白質的量的“增加”指在相同條件下(例如，培養條件、植 物年齡等等)，與沒有應用該方法的相同屬和種的野生型相比，生物、組織、細胞或者細胞隔 室中蛋白質的量的數量增加(例如，通過下文描述的方法之一)。所述增加達到至少10%， 優選至少20 %或至少50 %，尤其優選至少70 %或90 %，非常特別優選至少100 %，最優選至 少200%或以上。活性的“增加”理解為指在相同條件下(例如，培養條件、植物年齡等等)，與沒有 應用該方法的相同屬和種的野生型相比，生物、組織、細胞或者細胞隔室中蛋白質的總活性 的增加。所述增加達到至少10%，優選至少20%或至少50%，尤其優選至少70%或90%， 非常特別優選至少100%，最優選至少200%或以上。在該上下文中，與當增加SEQ ID NO :2或4中所示Rpi_blb2蛋白質之一所得值 相比，病原體抗性的功效可以向下或者向上偏離。優選的功能等價物為其中病原體抗性功 效(例如，通過病原體的穿透功效或者如本文描述的測量)與通過減去如SEQ ID N0:2或 4中所示Rpi_blb2蛋白質所得的比較值相差不超過50%，優選不超過25%，尤其優選不超 過10%的功能等價物。特別優選的是那些序列，其中基于減去如SEQ ID NO :2或4中所示 Rpi-blb2蛋白質之一所得的比較值，所述增加將病原體抗性的功效定量增加50%以上，優 選100 %，尤其優選500 %，非常特別優選1000 %。優選在類似條件下進行比較。“類似條件”指所有條件，如培養或生長條件、測定條 件(如緩沖液、溫度、底物、病原體濃度等等)在待比較的實驗間保持相同并且設置僅在待 比較的Rpi_blb2多肽的序列、它們的生物來源，如果適宜，和病原體方面不同。當選擇病原 體時，每個比較需要所選的病原體最相似于其他等價物，考慮物種專一性。由于增加的Rpi_blb2活性，植物或者其部分的抗性增加了。在優選實施方案中， 本發明的方法導致與野生型相比，用致病疫霉感染后孢子形成指數減小至少30 %，更優選 減小50 %，甚至更優選為70 %，甚至更優選大于80 %，最優選為85 %和90 %。最優選為 95%或以上。因此，本發明還涉及如上定義的編碼Rpi_blb2蛋白質的本發明的所述多核苷酸， 其包含核酸分子，所述核酸分子選自a)編碼SEQ ID NO 2或者4中描述的多肽的至少成熟形式的核酸分子；b)核酸分子，其包含如SEQ ID NO 1或3或5或6中描繪的編碼序列編碼所述多 肽的至少成熟形式；c)核酸分子，其核苷酸序列由(a)或者(b)的核苷酸序列的遺傳密碼簡并產生；d)核酸分子，其編碼的多肽通過從(a)到(C)的多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序 列的一個或幾個氨基酸的替代、缺失和/或加入從(a)到(c)的多核苷酸編碼的多肽衍生；e)核酸分子，其編碼的多肽的序列與(a)或(b)的核酸分子編碼的多肽的氨基酸 序列具有70%或以上的同一性；f)核酸分子，其包含(a)到(e)任一項的核酸分子編碼的多肽的片段或者具有表位的部分；g)核酸分子，其包含的多核苷酸具有用表3b中所列引物，尤其ARFlF和ARFlR從 核酸文庫擴增的核酸分子的序列；h)核酸分子，其編碼(a)到(g)任一項編碼的多肽的以氨基酸1、30、50、100、 200、300、500 或 1000 開始并以氨基酸 1267、1000、500、300、200、50、30、或 1 結束的片段；i)包含(a)或(d)任一項的多核苷酸的至少20個核苷酸的核酸分子；j)核酸分子，其編碼的多肽被針對(a)到(h)任一項的核酸分子編碼的多肽產生 的單克隆抗體識別；k)核酸分子，其可以通過用具有(a)到(j)任一項的核酸分子或者其至少15個， 優選30、60、90或更多個核苷酸的片段的序列的探針在嚴格條件下篩選適宜文庫得到；和1)核酸分子，其互補鏈在嚴格條件下與(a)或(k)任一項的核酸分子雜交；或者(a)到(1)任一項的互補鏈；或者編碼Solanum bulbocastanum的6號染色體或連鎖群6的區段編碼的多肽， 所述區段與選自表3a或3b的標記共分離，并且所述多肽介導對植物病原體，尤其選自卵菌 門病原體的抗性。在一個實施方案中，本發明多核苷酸不由Seq. ID NO. :7和/或9中描述的序列組 成和/或不由編碼Seq. ID NO. :8和/或10中描述的蛋白質的核酸分子的序列組成。在一個實施方案中，本發明的多核苷酸不由Mil. 1或者Mil. 2的核酸分子的序列 組成和/或不由編碼Mil. 1或者Mil. 2蛋白質的核酸分子組成。從而，在一個實施方案中，本發明的多核苷酸不由Rossi等人1998，PNAS USA 95 9750-9754，Milligan 等人，1998. Plant Cell 10 1307-1319 ；和 / 或 WO 9806750 中所示的
序列組成。在另一實施方案中，本發明的多核苷酸來自或者分離自生物的基因組，所述生物 izfe 自 tfliS Systema Naturae 2000, Brands, S. J, Amsterdam 白勺胃胃禾4" (Menyanthaceae)、 爺禾斗、厚殼樹禾斗(Sclerophylacaceae)、核果爺禾斗(Duckeodendraceae)Goetzeaceae> 旋 花禾斗(Convolvulaceae)、寬絲子禾斗(Cuscutaceae)、花惹禾斗(Polemoniaceae)禾口田基麻 科(Hydrophyllaceae)構成的組或者具有其來源，更優選選自由根據Systema Naturae 2000, Brands, S. J, Amsterdam ^IjS^nM (Atropa) > Browal 1 ia> #^fiJM (Brunfelsia) > 辣椒屬(Capsicum)、夜香樹屬(Cestrum)、Cyphomandra> 曼陀羅屬(Datura)、Fabiana> Frariciscea、天仙子屬(Hyoscyamus)、枸杞屬(Lycium)、爺參屬(Mandragora)、假 酸漿屬(Nicandra)、煙草屬(Nicotiana)、碧冬茄屬(Petunia)、酸漿屬(Physalis)、 Schizanthus和茄屬(Solanum)構成的組或者具有其來源，甚至更優選地選擇茄科，優 選 S. bulbocastanum、馬鈴薯(S. tuberosum)、番爺(S. Iycopersicum)、矮牽牛、樹番爺 (S. betaceum) >pearmelon (S. muricatum)禾口爺子(S. melongena)。甚至更優選地，將番爺或 者馬鈴薯或者S. bulbocastanum作為本發明多核苷酸來源。最優選地，將S. bulbocastanum 作為來源。已經從來自ABPT的馬鈴薯材料分離Rpi_blb2。從而，從分類學觀點，所描述的 Rpi-blb2也是馬鈴薯來源的。然而，所述基因存在于可能來自S. bulbocastanum的漸滲片 段上。許多馬鈴薯變種含有相關茄屬的漸滲片段，但是仍然是馬鈴薯。因此，根據分類學系統，馬鈴薯也可以是本發明的多核苷酸的來源，尤其ABPT來源的馬鈴薯，以及以類似方式 衍生的其他茄屬變種的其他變種。因此，在另一實施方案中，本發明的多核苷酸來自馬鈴薯。使用標準分子生物學技術和本文提供的序列信息可以分離本發明的多核苷酸，例 如，具有Seq ID NO 1或3或5或6的核苷酸序列或者其部分的核酸分子。例如，使用本發 明多核苷酸的序列之一的所有或者部分作為雜交探針和標準雜交技術(例如，Sambrook等 人,Molecular Cloning :ALaboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY, 1989 中描述)可以從文 庫分離Rpi-blb2cDNA。此外，通過聚合酶鏈反應，使用基于該序列(例如，包含本發明的多 核苷酸序列之一的所有或部分的核酸分子)設計的寡核苷酸引物可以分離包含本發明的 多核苷酸序列之一的所有或部分的多核苷酸。例如，可以從例如，S.bulbocastanum或者另 一種植物分離 mRNA(例如，通過 Chirgwin 等人(1979)Biochemistry 18 :5294_5299 的硫 氰酸胍提取方法)，并且使用逆轉錄酶(例如，Moloney MLV逆轉錄酶，可以從Gibco/BRL， Bethesda, MD 得到，或者 AMV 逆轉錄酶，可以從 SeikagakuAmerica，Inc.，St. Petersburg, FL得到)可以制備cDNA。基于SEQ ID No :1或3或5或6中所示核苷酸序列之一可以設 計用于聚合酶鏈反應擴增的合成的寡核苷酸引物。使用cDNA，備選地，使用基因組DNA作為 模板和適宜的寡核苷酸引物，根據標準PCR擴增技術可以擴增本發明的多核苷酸。可以將 如此擴增的多核苷酸克隆到適宜的載體中并通過DNA序列分析鑒定。此外，通過標準合成 技術，例如，使用自動化DNA合成儀可以制備相應于Rpi_blb2核苷酸的寡核苷酸。在本發明的一個實施方案中，由Solanum bulbocastanum或者馬鈴薯的6號染色 體或者連鎖群6的區段編碼Rpi-blb2蛋白質。此外，本發明包含Solanum bulbocastanum或者馬鈴薯的6號染色體或者連鎖群 6的區段。在本發明方法的一個優選實施方案中，所表達的Rpi_blb2蛋白質由多核苷酸編 碼，其包含S. bulbocastanum的6號染色體或者連鎖群6的區段。優選地，所述區段還包含 順式作用元件，例如，啟動子、增強子、結合位點等等，或者反式作用元件，像輔因子、激活劑 或者其他抗性蛋白質，其賦予增加的抗性。在Seq. ID NO. :5和6中描繪了包含Rpi_blb2 基因和其他調節元件的基因組片段。本領域技術人員已知怎樣得到染色體區段，例如，通過將染色體片段克隆到BAC， 如Song，2003，. PNAS 100 (16)，9128或者本文和所引用的參考文獻中描述。因此，在另一實施方案中，本發明的多核苷酸或者編碼Rpi_blb2蛋白質的多核苷 酸與選自表3a的標記共分離或者包含所述標記的復制位點或雜交位點。如實施例中詳細 描述的，用表3a或者3b中描繪的標記可以對致病疫霉抗性作圖。由于標記距離基因越近， 品系，即子代克隆中所述基因與所述標記共分離的百分數越高。因此，在優選實施方案中， 本發明的多核苷酸與標記E40M58、CTl 19和/或CT216共分離。在另一實施方案中，本發明涉及制備重組載體的方法，其包括將本發明的多核苷 酸插入到載體中或者將所述多核苷酸和另一抗性蛋白質插入到載體中。因此，在另一實施方案中，本發明涉及含有本發明的多核苷酸或者所述多核苷酸 和通過本發明的方法產生的另一抗性基因的載體。如本文所用的術語“載體”指能夠運輸其所連接的多核苷酸的核酸分子。一種類型的載體是“質粒”，其指環狀雙鏈DNA環，其中可以連接額外的DNA區段。另一種類型的載 體是病毒載體，其中可用將額外的DNA或者RNA區段連接到病毒基因組中。某些載體(例 如，具有細菌復制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)能夠在它們所導入的宿主細胞 中自主復制。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)當引入宿主細胞中時整合到宿主 細胞的基因組，從而隨著宿主基因組一起復制。此外，某些載體能夠指導它們有效連接的基 因的表達。此類載體在本文中稱作“表達載體”。通常，重組DNA技術所用的表達載體通常 是質粒形式的。在本說明書中，“質粒”和“載體”可以互換使用，因為質粒是載體的最常用 的形式。然而，本發明意在包括其他形式的表達載體，如病毒載體(例如，復制缺陷逆轉錄 病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們起等價功能。本發明還涉及通常用于基因工程的粘粒、病毒、噬菌粒和其他載體，它們含有 根據本發明的核酸分子。本領域技術人員熟知的方法可以用于構建多種質粒和載體; 見，例如，Sambrook, Molecular Cloning A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N. Y.禾口 Ausube1, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates andffiley Interscience,N. Y. (1989)中描述的技術。備選地,可 以將本發明的核酸分子和載體重構到脂質體中用以遞送到靶細胞。在另一實施方案中，本發明的載體或者本發明的方法的特征在于編碼Rpi_blb2 蛋白質的多核苷酸或者另一抗性蛋白質有效連接表達控制序列和/或連接編碼轉基因表 達調節信號的核酸序列，所述調節信號允許在原核或者真核宿主細胞中表達。在優選實施方案中，本發明涉及本發明的載體或者本發明的方法，其中編碼 Rpi-blb2蛋白質和/或另一抗性蛋白質的多核苷酸有效連接與所述編碼Rpi_blb2蛋白質 和/或另一抗性蛋白質的多核苷酸具有相同物種來源的表達控制序列。對于根據本發明的核酸分子在細胞中表達的情況，原則上可能如此修飾編碼序列 使得蛋白質位于植物細胞的任意希望的隔室中。這些隔室包括細胞核、內質網、液泡、線粒 體、質體樣造粉體、葉綠體、色質體、質外體、細胞質、細胞外空間、油體、過氧化物酶體和植 物細胞的其他隔室(綜述見，Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15，4 (1996)，285-423 和其中 引用的參考文獻)。然后多核苷酸可以有效融合適宜的多核苷酸(例如，載體)，其編碼用 于轉運到所希望的隔室的信號。本發明的另一優選實施方案涉及載體，其中本發明的多核苷酸有效連接表達控制 序列，其允許在原核或真核宿主細胞中表達。此類控制序列的性質取決于宿主生物而不同。 在原核生物中，控制序列通常包括啟動子、核糖體結合位點和終止子。在真核生物中，一般 的控制序列包括啟動子、終止子和在一些情況中，包括增強子、反式作用子或者轉錄因子。術語“控制序列”意在至少包括表達必需的組分，并且可以還包括額外的有益組 分。術語“有效連接”指并列，其中所描述的組分處于允許它們以它們的所希望的方式 發揮功能的關系中。“有效連接”編碼序列的控制序列以如此方式連接使得在與控制序列相 容的條件下實現編碼序列的表達。對于控制序列是啟動子的情況，對于技術人員顯然的是 使用雙鏈核酸。有效連接將理解為指例如，啟動子與待表達的核酸序列和如果適宜，其他調節元 件，如終止子以如此方式順序排列使得當核酸序列重組表達時，每個調節元件都可以實現其功能，這取決于核酸序列關于有義或者反義RNA的排列。為此，不一定需要化學意義上的 直接鍵合。遺傳控制序列，如增強子序列在距離他DNA分子遙遠的位置上也可以對靶序列 發揮它們的功能。優選排列為其中待重組表達的核酸序列位于作為啟動子的序列之后，從 而兩個序列相互共價連接。啟動子序列和待重組表達的核酸序列之間的距離優選小于200 個堿基對，特別優選小于100個堿基對，非常特別優選小于50個堿基對。通過例如在 Maniatis T, Fritsch EF 禾口 Sambrook J(1989)MolecularCloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor(NY),Silhavy TJ, Berman ML 禾口 Enquist Lff(1984)Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor (NY), Ausubel FM等人(1987) Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience 禾口 Gelvin 等 人(1990)Plant Molecular Biology Manual中描述的常規重組和克隆技術可以產生有效 連接和表達盒。然而，作為具有限制酶的特異切割位點的接頭，或者作為信號肽的其他序列 也可以位于兩個序列之間。序列的插入也可以導致融合蛋白質的表達。優選地，由啟動子 和待表達的核酸序列連接組成的表達盒可以以載體整合的形式存在并且可以例如通過轉 化插入到植物基因組中。此類調節序列描述于例如，Goeddel :Gene Expression Technology :Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)或參見Gruber禾口Crosby, :Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology,CRC Press,Boca Raton,Florida,編者 Glick和Thomson，第7章，89-108，包括其中的參考文獻。調節序列包括指導核苷酸序列在 許多類型宿主細胞中表達的那些序列和指導核苷酸序列僅在某些宿主細胞或者在某些條 件下表達的那些序列。本領域技術人員將理解表達載體的設計可以取決于諸如待轉化的宿 主細胞的選擇、所希望的蛋白質的表達水平等因素。可以將本發明的表達載體導入宿主細 胞，從而產生本文描述的多核苷酸編碼的蛋白質或肽，包括融合蛋白質或者肽。可以設計本發明的重組表達載體用于所述抗性蛋白質，優選Rpi_blb2在原核或 真核細胞中的表達。例如，編碼本發明的多核苷酸的基因可以在細菌細胞(如大腸桿菌 (E. coli)、百合棒桿菌(C. glutamicum)、根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens))、昆 蟲細胞(使用桿狀病毒表達載體)、酵母和其他真菌細胞(見Romanos，(1992)，Yeast 8 423-488 ；van den Hondel, (1991) J. W. Bennet&L. L. Lasure，編者，396-428 頁Academic Press :San Diego ；禾口 van den Hondel, (1991) :Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy,編者，1-28 頁，Cambridge University Press :Cambridge))、藻類(Falciatore 等人，1999，Marine Biotechnology. 1,3 :239_251)和多細胞植物細胞(見 Schmidt, R. (1988), Plant Cell Rep. :583_586) ；Plant Molecular Biology andBiotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, 6/7 $， S. 71-119(1993) ；F. F. White, B. Jenes 等 人，Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, 卷 1，Engineering and Utilization,編 # :Kung 禾口 R. Wu, Academic Press (1993)，128-43 ；Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991)，205-225 (和其中引用的參考文獻)或者哺 乳動物細胞中表達。適宜的宿主細胞在Goeddel，Gene Expression Technology =Methods inEnzymology 185，Academic Press, San Diego, CA (1990)中進一步討論。備選地，可以在 體外轉錄和翻譯重組表達載體，例如，使用T7啟動子調節序列和T7聚合酶。
通常用載體實施蛋白質在原核生物中的表達，所述載體含有指導融合或者非融合 蛋白質表達的組成型或者可誘導的啟動子。融合載體向其中編碼的蛋白質加入許多氨基 酸，通常加在重組蛋白質的氨基末端，但是也加在C-末端或者與所述蛋白質的適宜區域融 合。此類融合載體通常起三種目的1)增加重組蛋白質的表達；2)增加重組蛋白質的溶解 性；和3)通過作為親和純化中的配體幫助純化重組蛋白質。此外，融合載體可以還編碼額 外的蛋白質，其表達支持Rpi_blb2活性的增加或者針對植物病原體的植物抗性的增加，例 如，所述額外的蛋白質為其他抗性蛋白質。通常，在融合表達載體中，在融合部分和重組蛋 白質的接點引入蛋白酶剪切位點以便使得可以在純化融合蛋白質后分離重組蛋白質與所 述融合部分。此類酶和它們的同族識別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達載體包括pGEX (Pharmacia Biotech Inc ；Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988)Gene 67 :31_40)、pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA)禾口 pRIT5(Pharmacia, Piscataway, NJ)。適宜的可誘導的非融合大腸桿菌表達載體的實例包括pTrc (Amann (1988) Gene 69 :301_315)禾口 pETlId (Studier 等人’ Gene ExpressionTechnology :Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, C alifornia(1990)60-89。最大化重組蛋白質表達的一種策略是在蛋白酶剪切所述重組蛋白質的能力受損 的宿主細菌中表達所述蛋白質(Gottesman, S, Gene ExpressionTechnology :Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego，California(1990) 119—128)。另一種策略是 改變待插入到表達載體中的核酸的核酸序列從而每個氨基酸的各個密碼子是選擇用于表 達的細菌(如大腸桿菌或者百合棒桿菌)中優先使用的密碼子(Wada等人(1992) Nucleic AcidsRes. 20 :2111_2118)。可以通過標準DNA合成技術實施本發明的核酸序列的此類改 變。此外，載體可以是酵母表達載體。用于在酵母釀酒酵母(S. cerivisae)中表達 的載體的實例包括 pY印Secl (Baldari，等人，(1987) Embo J. 6 :229_234)、pMFa (Kurjan 和 Herskowitz, (1982)Cell 30 :933_943)、pJRY88 (Schultz 等人，(1987)Gene 54:113-123) 禾口 pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, CA)。優選地，本發明或者本文描述的多核苷酸有效連接植物表達控制序列，例如表達 盒。植物表達盒優選含有能夠驅動植物細胞中基因表達的調節序列，并且所述調節序列有 效連接從而每個序列都可以完成其功能，如轉錄終止，如多腺苷酸化信號。優選的多腺苷酸 化信號為來自根癌農桿菌t-DNA的多腺苷酸化信號，如已知為Ti質粒pTiACH5的章魚堿合 酶的基因3 (Gielen等人，EMBO J. 3 (1984)，835ff)或者其功能等價物，在植物中具有功能 活性的所有其他終止子也是適宜的。植物基因表達通常不限于轉錄水平，因為植物表達盒優選含有其他有效連接的序 列，像翻譯增強子，如含有來自煙草花葉病毒的5’ -未翻譯的前導序列的超驅動序列，其增 強蛋白質/RNA 比率(Gallie 等人，1987，Nucl. Acids Research 15:8693-8711)。因此，本文描述的多核苷酸可以有效連接適宜的啟動子，其賦予適時、細 胞或組織特異的方式的基因表達。優選為驅動組成型表達的啟動子(Benfey等 人，EMBO J. 8(1989)2195-2202)，像來自植物病毒如 35S CAMV(Franck 等人，Cell 21 (1980) 285-294)、19S CaMV (s 也見 US5352605 和 W08402913)的啟動子，或者植物啟動子，像US 4962028中描述的來自Rubisco小亞基的啟動子。術語“植物特異啟動子”理解為指原則上能夠控制基因，尤其外來基因在植物、或 植物部分、植物細胞、植物組織或者植物培養物中表達的啟動子。在該上下文中，表達可以 為例如，組成型的、可誘導的或者依賴發育的。優選下面的啟動子a)組成型啟動子優選的載體為使得可以在植物中組成型表達的那些載體(Benfey等人(1989) EMBO J 8:2195-2202)。“組成型”啟動子理解為指在植物發育的重要時期內，優選植物 發育的所有階段，確保在許多，優選所有組織中表達的那些啟動子。具體地，優選使用植 物啟動子或者來自植物病毒的啟動子。尤其優選CaMV花椰菜花葉病毒35S轉錄物的啟 動子(Franck 等人(1980)Cell 21:285_294 ；Odell 等人(1985)Nature 313 :810_812 ； Shewmaker 等人(1985) Virology 140 :281_288 ;Gardner 等人(1986)Plant Mol Biol6 221-228)或者 19S CaMV 啟動子(US 5，352，605 ；WO 84/02913 ；Benfey 等人(1989) EMBO J 8:2195-2202)。另一適宜的組成型啟動子是“Rubisco小亞基(SSU) ”啟動子(US 4，962，028)、豆球蛋白B啟動子(GenBank檢索號X03677)、農桿菌胭脂氨酸合成酶啟動子、 TR二元啟動子、農桿菌OCS(章魚堿合成酶)啟動子、泛蛋白啟動子(Holtorf S等人(1995) Plant Mol Biol 29 :637_649)、泛蛋白 1 啟動子(Christensen等人(1992)Plant Mol Biol 18:675-689 ；Bruce等人(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86 :9692_9696)、Smas啟動子、肉 桂醇脫氫酶啟動子(US 5，683，439)、液泡ATP酶亞基的啟動子或者來自小麥的富含脯氨酸 蛋白質的啟動子(W0 91/13991)，和基因的其他啟動子，其中所述基因在植物中的組成型表 達是技術人員已知的。b)組織特異性啟動子還優選對花藥、子房、花、葉、莖干、根和種子具有特異性的啟動子。種子特異啟動子例如，菜豆蛋白啟動子(US5，504, 200 ；Bustos MM 等人(1989)PlantCell 1(9) :839-53)、2S 白蛋白基因啟動子(Joseffson LG 等人(1987) J BiolChem 262 12196-12201)、豆球蛋白啟動子(ShirsatA 等人(1989)Mol GenGenet 215(2) :326_331)、 USP(未知的種子蛋白質)啟動子(Baumlein H等人(1991)Mol Gen Genet 225(3) 459-67)、油菜籽蛋白基因啟動子(US5, 608，152 ;Stalberg K 等人(1996)L Planta 199 515-519)、蔗糖結合蛋白質啟動子(W0 00/26388)或者豆球蛋白B4啟動子(LeB4 ； Baumlein H 等人(1991)Mol Gen Genet 225 :121_128 ;Baeumlein 等人(1992)Plant Journal 2(2) 233-9 ；Fiedler U 等人(1995) Biotechnology (NY) 13 (10) :1090f)、擬南芥 油質蛋白啟動子(W0 98/45461)、蕓苔(Brassica)Bce4啟動子0^091/13980)。其他適宜的 種子特異啟動子為編碼高分子量麥谷蛋白(HMWG)、麥醇溶蛋白、分枝酶、ADP葡萄糖焦磷酸 酶(AGPase)或者淀粉合酶的基因的啟動子。還優選允許在單子葉植物如玉米、大麥、小麥、 黑麥、稻等中種子特異表達的啟動子。可以有利地使用下面的Ipt2或者Iptl基因的啟動 子(W095/15389、W0 95/23230)或者WO 99/16890中描述的啟動子(大麥醇溶蛋白基因、谷 蛋白基因、水稻素基因、醇溶蛋白基因、麥醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、 kasirin基因或者裸麥醇溶蛋白基因的啟動子)。
塊莖_、貯藏根_、或者根_特異啟動子，如I類patatin啟動子(B33)、馬鈴薯組織 蛋白酶D抑制劑啟動子。葉特異啟動子如馬鈴薯胞質溶膠FBPase啟動子(W097/05900)、馬鈴薯的Rubisco (核酮糖-1， 5_ 二磷酸羧化酶)SSU (小亞基)啟動子或者ST-LSI啟動子(Stockhaus等人(1989) EMBO J 8:2445-2451)。非常特別優選的是表皮特異啟動子，如OXLP基因(草酸氧化酶樣蛋白質) 啟動子(Wei 等人(1998)Plant Mol. Biol. 36 :101_112)。花特異啟動子例如，八氫番茄紅素合酶啟動子(W0 92/16635)或者P_rr基因的啟動子(W0 98/22593)。花藥特異啟動子如5126 啟動子(US 5，689，049,US 5，689，051)、glob_I 啟動子和 Y -玉米醇溶蛋
白啟動子。c)化學可誘導的啟動子表達盒還可以包含化學可誘導的啟動子(綜述文章Gatz等人(1997) Armu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48 :89_108)，通過所述啟動子可以控制植物中的外源基因 在特定時間點表達。同樣可以使用諸如，PRPl啟動子(Ward等人(1993)Plant Mol Biol 22 :361-366)、水楊酸可誘導的啟動子(W0 95/19443)、苯磺酰胺可誘導的啟動子(EP O 388 186)、四環素可誘導的啟動子(Gatz等人(1992) Plant J 2 :397_404)、脫落酸可誘導 的啟動子(EP O 335 528)或者乙醇或者環己酮可誘導的啟動子(W0 93/21334)的啟動于。d)脅迫_或者病原體可誘導的啟動子其他優選的啟動子為通過有生命或者無生命的脅迫可以誘導的啟動子，如PRPl 基因的病原體可誘導的啟動子(Ward等人(1993)Plant MolBiol 22 :361_366)、番茄高溫 可誘導的hsp70或者hsp80啟動子(US 5，187，267)、馬鈴薯低溫可誘導的α -淀粉酶啟動 子(W0 96/12814)、光可誘導的PPDK啟動子，或者創傷可誘導的pinll啟動子(ΕΡ375091)。病原體可誘導的啟動子包括由于病原體感染誘導的基因的啟動子，所述基因為 例如，I3R蛋白質、SAR蛋白質、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質酶等的基因(例如，Redolfi等 人(1983)Neth J Plant Pathol 89 245-254 ；Uknes,等人(1992)The Plant Cell 4 645-656 ；Van Loon(1985)Plant Mol Virol 4 :111_116 ;Marineau 等人(1987)Plant Mol Biol 9 335-342 ；Matton ^A (1987)Molecular Plant-Microbe Interactions 2 325-342 ；Somssich ^ 人(1986)ProcNatl Acad Sci USA 83 :2427_2430 ;Somssich 等 人(1988)MolGen Genetics 2 :93_98 ；Chen 等人(1996) Plant J 10 :955_966 ；Zhang 和 Sing(1994)Proc Natl Acad Sci USA91 2507-2511 ；Warner 等人(1993)Plant J 3 191-201 ；Siebertz 等人(1989) Plant Cell 1 :961_968 (1989)。還包括創傷可誘導的啟動子，如pinll基因的啟動子(Ryan (1990) AnnRev Phytopath 28 :425_449 ;Duan 等人(1996) Nat Biotech 14 :494_498)、wunl 和 wun2 基因的 啟動子(US 5，428，148)、winl 和 win2 基因的啟動子(Stanford 等人(1989)Mol Gen Genet 215 :200-208)、系統素的啟動子(McGurl 等人(1992) Science 225 1570-1573)、WIPl 基 因的啟動子(Rohmeier 等人(1993)Plant Mol Biol 22 :783_792 ;Eckelkamp 等人(1993)FEBS Letters 323 :73_76)、MPI 基因的啟動子(Corderok 等人(1994)ThePlant J 6(2) 141-150)等等。e)發育依賴性啟動子其他適宜的啟動子為例如，果實成熟特異啟動子，如番茄果實成熟特異啟動子(W0 94/21794、EP 409 625)。發育依賴性啟動子部分包括組織特異啟動子，因為個體組織本質 上以發育依賴性方式發育。本發明的多肽僅在本文提到的病原體感染或者穿透的組織中具有活性或者具有 增加的活性是有利的。特別優選組成型啟動子和葉和/或莖干_特異的、病原體可誘導和 表皮特異的啟動子，最優選病原體可誘導的和表皮特異的啟動子。還優選天然啟動子，其例 如包含在Seq. ID NO. 5和6中描繪的基因組片段中。此外，其他啟動子可以有效連接待表達的核酸序列，所述啟動子使得可能在其他 植物組織或者其他生物，例如，大腸桿菌細菌中表達。適宜的植物啟動子原則上為所有上述 啟動子。術語“遺傳控制序列”在廣義上理解并且指對根據本發明的表達盒的實體化或者 功能具有影響的所有那些序列。例如，遺傳控制序列修飾原核或者真核生物中轉錄和翻譯。 優選地，根據本發明的表達盒包含待重組表達的所述核酸序列的5’上游的對胚表皮和/或 花具有特異性的啟動子，和3’下游終止子序列作為額外的遺傳控制序列和，如果適宜，其他 常規調節元件，在每種情況中，它們都有效連接待重組表達的核酸序列。遺傳控制序列還包含其他啟動子、啟動子元件、或者最小啟動子，它們都可以修飾 表達控制性質。從而，例如，由于遺傳控制序列，組織特異表達還可以額外地依賴于某些 應激子。已經關于例如，水脅迫、脫落酸(LamE和Chua NH, J Biol Chem 1991 ；266 (26) 17131-17135)和熱脅迫(SchofflF 等人，Molecular & General Genetics 217(2-3) 246-53,1989)描述了此類元件。其他有利的控制序列為例如，革蘭氏陽性啟動子amy和SP02，酵母或者真菌啟動 子 ADCl、MFa, AC、P-60、CYCl、GAPDH、TEF、rp28、ADH。原則上，它們的調節序列像上述調節序列的所有天然啟動子都可以用于根據本發 明的方法。此外，也可以有利地使用合成啟動子。遺傳控制序列還包括基因的5’非翻譯區、內含子和非編碼3’區，如肌動蛋白-1內 含子或者Adhl-S內含子1、2和6(—般參考The MaizeHandbook，第116章，Freeling和 Walbot，編著，Springer, New York(1994))。已經闡明它們在基因表達的調節中起重要作 用。從而，已經闡明5’非翻譯序列可以增強異源基因的瞬時表達。可以提及的翻譯增強子 的實例為煙草花葉病毒5，前導序列(Gallie等人(1987)Nucl Acids Res 15:8693-8711) 等等。此外，它們可以促進組織特異性(Rouster J等人(1998)Plant J 15:435-440)。表達盒可以有利地包含一個或多個所稱作的增強子序列，其有效連接啟動子，使 得核酸序列的增強的重組表達成為可能。額外有利的序列，如其他調節序列或者終止子也 可以插入待重組表達的核酸序列的3’末端。基因構建體中可以存在待重組表達的核酸序 列的一個或多個拷貝。在一個實施方案中，使用Seq ID No. :5和/或6中描繪的基因組片段中包含的天 然終止子序列。
適宜作為控制序列的多腺苷酸化信號為植物多腺苷酸化信號，優選基本上相應于 來自根癌農桿菌的T-DNA多腺苷酸化信號的多腺苷酸化信號，尤其Ti質粒pTiACHS (Gielen 等人(1984)EMB0 J3 :835et seq.)的T-DNA(章魚堿合酶)3’的基因或者其功能等價物。 特別適宜的終止子序列的實例是OCS(章魚堿)終止子和NOS(胭脂堿合酶)終止子。控制序列還進一步被理解為使得可以同源重組或者插入到宿主生物的基因組或 者允許從基因組除去的控制序列。對于同源重組，例如，具體基因的天然啟動子可以與對胚 表皮和/或花具有特異性的啟動子交換。諸如cre/lox技術的方法允許組織特異性，如果 適宜可誘導地從宿主生物的基因組除去表達盒(Sauer B (1998)Methods. 14(4) :381_92)。 在該方法中，特定側翼序列(Iox序列)附著到靶基因，所述側翼序列以后允許通過ere重 組酶除去。表達盒和從其衍生的載體可以包含其他功能元件。術語功能元件將在廣義上理解 并且指對根據本發明的表達盒、載體或者轉基因生物的產生、擴增或功能具有影響的所有 那些元件。作為實例但不作為限制，可以提及下面的a)選擇標記，其賦予對代謝抑制劑，諸如2-脫氧葡萄糖_6_磷酸(W098/45456)、 抗生素或者殺生物劑，優選除草劑，如卡那霉素、G418、博來霉素或者潮霉素，或者膦絲菌素 等等的抗性。特別優選的選擇標記是賦予除草劑抗性的那些選擇標記。可以提及的實例 為編碼膦絲菌素乙酰基轉移酶(PAT)和失活谷氨酰胺合酶抑制劑(bar和pat基因)的 DNA序列；5-烯醇-丙酮酸基莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSN合酶基因)，其賦予對草苷膦 (N-(膦酰基甲基)甘氨酸)的抗性；gox基因，其編碼草苷膦降解酶(草苷膦氧化還原酶)； deh基因(編碼失活茅草枯的脫鹵素酶)；失活磺酰脲和咪唑啉酮的乳酸乙酰合酶；和bxn 基因，其編碼降解溴草腈的腈水解酶；aasa基因，其賦予對抗生素apectinomycin的抗性； 鏈霉素磷酸轉移酶(SPT)基因，其允許對鏈霉素的抗性；新霉素磷酸轉移酶(NPTII)基因， 其賦予對卡那霉素或者geneticidin的抗性；潮霉素磷酸轉移酶(HPT)基因，其介導對潮霉 素的抗性；乙酰乳酸合酶基因(ALS)，其賦予對磺酰脲除草劑的抗性(例如，具有S4和/或 Hra突變的突變ALS變體)。b)報道基因，其編碼容易定量的蛋白質和，通過它們的顏色或者酶活性，使得可能 評估轉化功效、表達部位或者表達時間。在該上下文中非常特別優選的是編碼報道蛋白的 基因(Schenborn E,Groskreutz D. MolBio-technol. 1999 ；13(1) 29-44)，所述報道蛋白為 例如，綠色熒光蛋白(GFP) (Sheen 等人(I995)Plant Journal 8(5) :777_784 ;Haseloff■等 A (1997)Proc Natl Acad Sci USA 94(6) :2122_2127 ；Reichel 等人(1996)Proc NatlAcad Sci USA 93(12) :5888_5893 ；Tian等人(1997)Plant Cell Rep 16 :267_271 ；WO 97/41228 ； Chui WL等人(1996) Curr Biol 6 325-330 ；Leffel SM等人(1997) Biotechniques. 23 (5) 912-8)、氯霉素轉移酶、螢光素酶(Ow等人(1986) Science 234 :856_859 ；Millar等人 (1992)Plant Mol Biol Rep 10 :324_414)，和水母發光蛋白基因(Prasher 等人(1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3) 1259-1268), β -半乳糖苷酶 R 基因座基因(其編 碼調節植物組織中產生花色素苷色素(紅色)的蛋白質從而使得可以直接分析啟動子活 性而不加入額外的輔助物質或者顯色底物；Dellaporta等人Chromosome Structure and Function Impact of NewConcepts,18th Stadler Genetics Symposium,11 :263_282, 1988)，特別優選 β -葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson 等人，EMBO J. 1987，6，3901-3907)。
c)復制起點，其確保根據本發明的表達盒或者載體在例如大腸桿菌中的擴增。所 提及的實例為 ORI (DNA 復制起點)、pBR322ori 或者 P15A ori (Sambrook 等人=Molecular Cloning. A Laboratory Manual,第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)。d)農桿菌介導的植物轉化必需的元件，如T-DNA或者vir區的右邊界或者左邊界。為了選擇成功經歷同源重組的細胞，或者選擇經轉化的細胞，通常必須還導入選 擇標記，其賦予已經成功經歷重組的細胞對殺生物劑(例如，除草劑)、代謝抑制劑(如 2_脫氧葡萄糖-6-磷酸(W0 98/45456))或者抗生素的抗性。選擇標記允許從未轉化的細 胞選擇轉化的細胞(McCormick 等人(1986)Plant Cell Reports 5:81-84)。可以有利地使用包含表達盒的載體實現根據本發明的表達盒向生物或者其細胞、 組織、器官、部分或者種子的導入(優選導入植物或植物細胞、組織、器官、部分或者種子 中)。可以通過適宜的限制性切割位點將表達盒導入載體(例如，質粒)中。首先將所形成 的質粒導入大腸桿菌中。選擇、生長正確轉化的大腸桿菌并通過技術人員熟悉的方法得到 重組質粒。限制性分析和測序可以用于驗證克隆步驟。用于在特定植物部分中表達的其他啟動子為例如，來自油菜籽的油菜籽蛋白 基因啟動子、來自蠶豆(Vicia faba)的USP啟動子(Baeumlein等人，Mol Gen Genet, 1991，225 (3) :459_67)、來自擬南芥的油質蛋白啟動子(W09845461)、來自菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白啟動子(US5504200)，來自蕓苔的Bce4_啟動子(W09113980)或者豆 球蛋白 B4 啟動子(LeB4 ；Baeumlein 等人，1992，Plant Journal, 2 (2) :233_9)以及在像玉 米、大麥、小麥、黑麥、稻等的單子葉植物中賦予種子特異表達的啟動子。所提及的適宜啟動 子為來自大麥的Ipt2或者Iptl基因啟動子(W09515389和W09523230)或者在W09916890 中描繪的那些啟動子(來自大麥醇溶蛋白基因、稻谷蛋白基因、稻水稻素基因、稻醇溶蛋白 基因、小麥醇溶蛋白基因、小麥谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麥谷蛋白基因、高 梁kasirin基因、黑麥黑麥醇溶蛋白基因的啟動子)。此外，可以將本發明的多核苷酸以反義方向克隆到表達載體中。即，DNA分子有效 連接調節序列，所述連接的方式允許表達(通過DNA分子的轉錄)本發明的多核苷酸編碼 的mRNA反義的RNA分子。可以選擇有效連接以反義方向克隆的核酸的調節序列，其指導所 述反義RNA分子在多種細胞類型中連續表達，例如，可以選擇指導反義RNA的組成型、組織 特異的或者細胞類型特異表達的病毒啟動子和/或增強子，或調節序列。反義表達載體可 以為重組質粒、噬菌粒或者減毒病毒的形式，其中所產生的反義核酸分子處于高效率調節 區的控制下，所述調節區的活性可以通過確定載體所導入的細胞類型確定。關于使用反義 基因調節基因表達的討論，見Weintraub，H.等人，Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1 (1) 1986 禾口 Mol 等人，1990, FEBS Letters268 :427_430。在一個實施方案中，本發明涉及產生重組宿主細胞的方法，其包括向宿主細胞導 入本發明的載體或者多核苷酸或者所述載體或所述多核苷酸和表達另一種抗性蛋白質的 載體。可以通過常規轉化或轉染技術向原核或真核細胞導入載體DNA。本文所用的術語 “轉化”和“轉染”、接合和轉導意在指多種本領域已知的將外源核酸(例如，DNA)導入宿主細胞的技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂轉染、天然感受態、 化學介導的轉移，或者電穿孔。轉化或者轉染宿主細胞(包括植物細胞)的適宜的方法可 以參見 Sambrook，等人(Molecular Cloning :A Laboratory Manual.第二片反，ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press， ColdSpring Harbor， NY, 1989)和其他實驗室手冊，如 Methods in MolecularBiology，1995，卷 44，Agrobacterium protocols，編者Gar land 禾口 Davey，Humana Press，Totowa, New Jersey。為了穩定轉染真核細胞，已知取決于所用的表達載體和轉染技術，僅一小部分細 胞可以將外來DNA整合到它們的基因組。為了鑒定和選擇這些整合體，通常將選擇性標記 (例如，對抗生素的抗性)隨目的基因導入宿主細胞。優選的選擇性標記包括賦予對藥物 (如G418、潮霉素和氨甲蝶呤)抗性的那些選擇性標記或者在植物中為賦予對除草劑如草 苷膦或草銨膦的抗性的選擇性標記。可以將編碼選擇性標記的核酸導入宿主細胞中與編碼 本發明多肽相同的載體上或者導入單獨的載體。用所導入的核酸穩定轉染的細胞可以通 過例如，藥物選擇鑒定(例如，具有所摻入的選擇性標記基因的細胞將存活，而其他細胞死 亡)。可以產生其他宿主細胞，其含有允許所導入的基因的受調節的表達的選擇系統。 例如，將本發明的多核苷酸包括在載體中處于Iac操縱子控制下允許僅在存在IPTC時表達 該多核苷酸。此類調節系統是本領域公知的。優選地，所導入的核酸分子是宿主細胞外來的。“外來的”指核酸分子關于宿主細胞是異源的，這意味著來自具有不同基因組背景 的細胞或者生物，或者所述核酸分子關于宿主細胞是同源的但是位于不同于所述核酸分子 的天然發生的對應物的基因組環境中。這意味著，如果核酸分子關于所述宿主細胞是同源 的，其不位于所述宿主細胞的基因組中的天然位置，尤其它被不同的基因包圍。在該情況 中，核酸分子可以處于其自身啟動子控制下或者處于異源啟動子控制下。宿主細胞中存在 的根據本發明的載體或者核酸可以整合到宿主細胞的基因組或者可以以某種形式保持在 染色體外。在該方面，還理解本發明的核酸分子可以用于通過同源重組恢復或者產生突變 基因(Paszkowski (編者)，HomologousRecombination and Gene Silencing in Plants. Kluwer Academic Publishers (1994))。因此，在另一實施方案中，本發明涉及用本發明的多核苷酸或者本發明的載體，或 者用所述載體或所述多核苷酸和用于表達另一種抗性蛋白質的載體或者多核苷酸基因工 程化的宿主細胞。術語“宿主細胞”和“重組宿主細胞”在本文中互換使用。將理解此類術語不僅指 具體受試者細胞，而且指此類細胞的后代或者潛在后代。因為由于某些突變或者環境影響， 在連續世代中可以發生某些修飾，所以此類后代可能實際上不與親代細胞相同，但是仍然 包括在本文所用的術語的范圍內。例如，可以將本發明的多核苷酸導入細菌細胞、昆蟲細胞、真菌細胞或者哺乳動物 細胞(如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或者COS細胞)、藻類、纖毛蟲、植物細胞或者真菌中。適 宜的宿主細胞是本領域技術人員已知的。優選大腸桿菌、桿狀病毒、農桿菌或者植物細胞。此外，還可以轉化宿主細胞從而(過)表達其他酶和蛋白質，所述表達支持植物對 病原體抗性的增加。優選地，還表達另一抗性基因，優選還表達一種或多種抗性基因，優選本文提及的基因。最優選地是Rpi_blb2和Rpi-blb的共表達。進一步優選的是本文提及的植物之一，尤其上面提及的茄科植物之一的細胞，最 優選馬鈴薯、番茄、矮牽牛、樹番茄、pear melon或者茄子的細胞。在另一實施方案中，本發明涉及產生本發明的多肽，尤其具有Rpi_blb2活性的蛋 白質的方法，其包括培養本發明的宿主細胞并從培養基或細胞回收所述多核苷酸編碼并且 宿主細胞表達的所述多肽。術語“表達”指在細胞中產生蛋白質或者核苷酸序列。然而，所述術語還包括在無 細胞體系中表達蛋白質。它包括從編碼產物的DNA轉錄成RNA產物，轉錄后修飾和/或翻 譯成蛋白質產物或者多肽，以及可能的翻譯后修飾。取決于所用的特定構建體和條件，可用從細胞、培養基或者兩者回收蛋白質。對于 本領域技術人員，公知不僅可以表達天然蛋白質，而且可以表達作為融合多肽的蛋白質或 者加入指導蛋白質到達宿主細胞的特定隔室，例如，確保蛋白質分泌到培養基等等的信號 肽。此外，此類蛋白質和其片段可以經化學合成和/或根據例如下文描述的標準方法修飾。本發明的宿主細胞，如培養中的原核或者真核宿主細胞可以用于產生(即表達) 本發明的多核苷酸編碼的多肽，優選具有Rpi_blb2活性的多肽。此外，通過電穿孔或者農 桿菌介導的基因轉移通過直接轉移DNA到正發育的花中也可以應用備選方法。因此，本發 明還提供了使用本發明的宿主細胞產生Rpi-blb2的方法。在一個實施方案中，所述方法包 括在適宜的培養基中培養本發明的宿主細胞從而產生本發明的多肽。此外，所述方法包括 從培養基或者宿主細胞分離和/或回收所述多肽。優選通過重組DNA技術產生本發明的多肽。例如，將編碼蛋白質的核酸分子克隆 到表達載體(如上述)中，將表達載體導入宿主細胞(如上述)并且在該宿主細胞中表達 所述多肽。然后通過適宜的純化方案，使用標準蛋白質純化技術從細胞分離所述多肽。重 組表達的備選方案是可以使用標準肽合成技術化學合成本發明的多肽或者肽。此外，例如， 使用下文描述的本發明的抗體，尤其抗Rpi_blb2抗體從細胞(例如，內皮細胞)分離天然 Rpi-blb2，通過標準技術，使用本發明的多肽或者其片段，即本發明的多肽可以產生所述抗 體。在一個實施方案中，本發明涉及Rpi_blb2蛋白質或者具有Rpi_blb2活性的蛋白質。在一個實施方案中，本發明涉及具有本發明的多核苷酸編碼的氨基酸序列或者可 以通過本發明的方法得到的多肽。在一個實施方案中，所述多肽不由Seq. ID NO. :8禾Π /或10中描繪的序列組成和 /或不由Seq. ID NO. :7和/或9中描繪的核酸分子編碼的序列組成。在一個實施方案中，本發明的多肽不由Mil. 1或者Mil. 2蛋白質的序列組成和/ 或不由編碼Mil. 1或者Mil. 2蛋白質的核酸分子編碼的蛋白質組成。從而，在一個實施方案中，本發明的多肽可以不由Rossi等人1998，PNAS USA 95 9750-9754，Milligan 等人，1998. Plant Cell 10 1307-1319 ；和 / 或 WO 9806750 中所示的 序列組成。用于本申請中的術語“蛋白質”和“多肽”是可以互換的。“多肽”指氨基酸的聚合 物(氨基酸序列)并且不涉及分子的特定長度。從而多肽的定義中包括肽和寡肽。該術語還指或者包括多肽的翻譯后修飾，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等等。所述定義包括例如， 含有氨基酸的一個或多個類似物(包括例如，非天然氨基酸等等)的多肽、具有取代的連接 的多肽，以及本領域已知的天然發生和非天然發生的其他修飾。優選地，所述多肽是分離的。“分離的”或者“純化的”蛋白質或者其生物活性部分 當通過重組DNA技術產生時基本上細胞材料，或者當化學合成時基本上無化學前體或者其 他化學品。術語“基本上無細胞材料”包括本發明多肽的制備物，其中所述蛋白質與天然或者 重組產生該蛋白質的細胞中的細胞組分分離。在一個實施方案中，術語“基本上無細胞材 料”包括具有小于約30% (按照干重)“污染性蛋白質”，更優選小于約20% “污染性蛋白 質”，更優選小于約10% “污染性蛋白質”，最優選小于約5% “污染性蛋白質”的制備物。 術語“污染性蛋白質”涉及不是本發明的多肽的多肽。當重組產生本發明的多肽或者其生 物活性部分時，還優選基本上無培養基，即，培養基為蛋白質制備物體積的約20%以下，更 優選約10%以下，最優選約5%以下。術語“基本上無化學前體或者其他化學品”包括制備 物，其中本發明的主題，例如，本發明的多肽與涉及該蛋白質合成的化學前體或者其他化學 品分離。術語“基本上無化學前體或者其他化學品”包括制備物，其具有小于約30% (按干 重計)化學前體或者非Rpi_blb2化學品，更優選小于約20%化學前體或者非Rpi-blb2化 學品，更優選小于約10%化學前體或者非Rpi-blb2化學品，最優選小于約5%化學前體或 者非Rpi-blb2化學品。在優選實施方案中，分離的蛋白質或者其生物活性部分缺少污染性 蛋白質，其中所述污染性蛋白質與本發明的多肽來自相同生物。通常，通過重組DNA技術產 生此類蛋白質。本發明的多肽或者其部分可以優選包含與SEQID No :2或4的氨基酸序列足夠同 源的氨基酸序列，從而所述蛋白質或者其部分保持賦予本發明的抗性的能力。所述蛋白質 的部分優選為本文描述的生物活性部分。優選地，本發明的多肽具有與SEQID No :2或4中 所示相同的氨基酸序列。此外，所述多肽可以具有由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述 核苷酸序列與本發明的多核苷酸的核苷酸序列雜交，優選在上文描述的嚴格雜交條件下雜 交。因此，所述多肽具有核苷酸序列編碼的氨基酸序列，其與SEQ IDNo 2或4的氨基酸序 列之一具有至少約70 %，優選至少約75 %，更優選至少約80 %、90 %、95 %，甚至更優選至 少約96%、97%、98%、99%或以上的同源性。本發明的優選的多肽優選具有本文描述的至 少一種Rpi-blb2蛋白質活性，例如，其抗性或者免疫活性。本發明的優選多肽包括核苷酸 序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與SEQID No :1或3或5或6的核苷酸序列雜交， 優選在嚴格條件下與所述核苷酸序列雜交，或者與所述核苷酸序列同源(如上定義的)。因此，如本文詳述，本發明的多肽可以由于天然變異或者誘變在氨基酸序列中與 SEQID No :2或4不同。因此，所述多肽可以包含與SEQ ID No 1或3或5或6的完整氨 基酸至少約70 %，優選至少約75 %，更優選至少約80 %、90 %、95 %，最優選至少約96 %、 97%、98%、99%或以上同源的氨基酸序列。本發明多肽的生物活性部分包括包含來源于Rpi_blb2蛋白質的氨基酸序列的氨 基酸序列，例如，SEQ ID No :2或4中所示的氨基酸序列或者與其同源的蛋白質的氨基酸序 列，其包括的氨基酸少于全長Rpi_blb2蛋白質的氨基酸或者少于如下全長蛋白質的氨基 酸，所述全長蛋白質與本文描繪的Rpi-blb2蛋白質同源并且顯示出Rpi_blb2蛋白質的至少一種活性。通常，生物(或者免疫學)活性部分，即肽，例如，長為5、10、15、20、30、35、36、 37、38、39、40、50、100或更多氨基酸的肽包含具有Rpi_blb2蛋白質的至少一種活性或表位 的結構域或者基序。此外，其中缺失多肽的其他區域的其他生物活性部分可以通過重組技 術制備并且評估本文描述的一種或多種活性。本發明的Rpi_blb2多核苷酸的操作可以導致產生具有與野生型Rpi_blb2蛋白質 功能不同的Rpi_blb2。這些蛋白質可以在效率或者活性方面得到提高，可以以比通常更大 的數目存在于細胞中，或者效率或活性減小。Rpi-blb2的誘變策略導致所述化合物的所述抗性增加或者對另一種植物病原體 種或者前述提到的植物病原體種的另一種株系的抗性增加，所述誘變策略不意在限制；這 些策略的變通方案是本領域技術人員顯而易見的。使用此類策略，并且整合本文公開的機 制，可以用本發明的多核苷酸和多肽產生植物或其部分，其表達野生型Rpi_blb2或者突變 的Rpi-blb2多核苷酸和蛋白質分子從而所希望的化合物的生產的產率、產量和/或效率提 高了。該所希望的化合物可以是植物的任意天然產物，其包括生物合成途徑的終產物和天 然發生的代謝途徑的中間物，以及在所述細胞的代謝中不天然發生的分子，但是其通過本 發明的所述細胞產生。本發明還提供了嵌合或融合蛋白質。本文所用的“嵌合蛋白質”或者“融合蛋白質”包含有效連接非Rpi_blb2多肽的 多肽。"Rpi-blb2多肽”指具有相應于具有Rpi_blb2活性的多肽的氨基酸序列的多肽， 而“非Rpi-blb2多肽”指具有相應于不基本上同源于Rpi-blb2的蛋白質的氨基酸序列的多 肽，例如，不賦予本文描述的抗性，尤其不賦予對致病疫霉抗性和來源于相同或不同生物的 蛋白質。在融合蛋白質中，術語“有效連接”意在表示Rpi_blb2多肽和非Rpi-blb2多肽相 互融合，從而兩條序列都完成所用序列的計劃的功能。非Rpi-blb2多肽可以與Rpi-blb2多 肽的N-末端或者C-末端融合。例如，在一個實施方案中，融合蛋白質是GST-LMRP融合蛋白 質，其中Rpi_blb2序列融合GST序列的C-末端。此類融合蛋白質可以方便重組Rpi_blb2 的純化。在另一實施方案中，融合蛋白質是在其N-末端含有異源信號序列的Rpi-blb2。在 某些宿主細胞(例如，哺乳動物宿主細胞)中，通過使用異源信號序列可以增加Rpi_blb2 的表達和/或分泌。優選地，通過標準重組DNA技術產生本發明的Rpi_blb2嵌合或者融合蛋白質。例 如，根據常規技術將編碼不同多肽序列的DNA片段連接在框內，例如，通過平末端或者交錯 末端用于連接，用限制酶消化以提供適宜的末端，如果適宜，填充粘性末端，堿性磷酸酶處 理以避免不希望的連接，和酶連接。通過常規技術(包括自動化DNA合成儀)可以合成融 合基因。備選地，可以用錨定引物實施基因片段的PCR擴增，所述引物在兩個連續基因片 段之間形成互補突出端，所述基因片段可以隨后退火并再擴增產生嵌合基因序列(見，例 如，Current Protocols in Molecular Biology，編者Ausubel 等人，John Wiley&Sons 1992)。此外，可以通過商業途徑得到已經編碼融合部分(例如，GST多肽)的許多表達載 體。可以將本發明的多核苷酸克隆到此類表達載體中從而融合部分在框內連接所編碼的蛋 白質。此外，使用適宜的計算機程序可以進行本發明蛋白質的結構基序的折疊模擬和計算機再設計(Olszewski，Protein 25 (1996)，286-299 ；Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995)，675-679)。蛋白質折疊的計算機建模可以用于詳細的肽和蛋白質模 型的構象和能量分析(Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012 ；Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995)，37-45)。具體地，可以用適宜的程序鑒定促有絲分裂的cyplin及其受體 的相互作用位點，并通過互補肽序列的計算機輔助搜索鑒定它的配體或者其他相互作用蛋 白質(Fassina，Immunomethods (1994)，114-120。用于設計蛋白質和肽的其他適宜的計算 機系統描述于現有技術，例如，Berry, Biochem, Soc. Trans. 22(1994), 1033-1036 ；ffodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987)，1-13 ；Pabo，Biochemistry 25 (1986)，5987-5991。從上述計 算機分析得到的結果可用于例如，制備本發明蛋白質或者其片段的肽模擬物。所述蛋白質 的天然氨基酸序列的此類假肽類似物可以非常有效地模擬母蛋白質(Benkirane，J.Biol. Chem. 271 (1996)，33218-33224)。例如，容易得到的非手性Q-氨基酸殘基向本發明蛋白質 或者其片段的摻入導致脂肪族鏈的聚亞乙基單位對酰胺鍵的取代，從而提供構建假肽的方 便的策略(Banerjee, Biopolymers 39 (1996)，769—777)。在現有技術中描述了其他系統中小肽激素的強效肽模擬類似物(Zhang，Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (1996)，327-331)。通過連續酰胺烷基化合成肽模擬物組合文庫， 并測試所得化合物的例如，結合和免疫活性，也鑒定了本發明蛋白質的適宜的肽模擬物。產 生和使用肽模擬物組合文庫的方法在現有技術，例如，在OstreshJethods in Enzymology 267 (1996)，220-234 和 Dorner，Bioorg. Med. Chem. 4 (1996)，709-715 中描述。此外，可以用本發明蛋白質的三維和/或晶體結構設計本發明蛋白質的生物活性 的肽模擬物抑制劑(Rose，Biochemistry 35 (1996)，12933-12944 ；Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4(1996)，1545-1558)。在另一實施方案中，本發明涉及特異結合本發明的多肽或者部分，即此類蛋白質 的特定片段或者表位的抗體。本發明的抗體可以用于鑒定和分離任意生物中的Rpi-blb和基因，優選以本文中 描述的植物制備的植物中的Rpi-blb和基因。這些抗體可以為單克隆抗體、多克隆抗體或 者合成抗體以及抗體片段，如Fab、Fv或者ScFv片段等等。例如，通過最初在K5hler和 Milstein, Nature 256 (1975)，495，和 Galfr6, Meth. Enzymo 1. 73(1981)，3 中描述的技術制 備單克隆抗體，所述技術包括將小鼠骨髓瘤細胞與來自經免疫的哺乳動物的脾細胞融合。此夕卜，通過使用例如，Harlow 禾口 Lane" Antibodies, A LaboratoryManual" ，CSH Press, Cold Spring Harbor，1988中描述的方法可以得到針對前述肽的抗體或者其片段。 這些抗體可以例如，用于根據本發明的蛋白質的免疫沉淀和免疫定位，以及用于監視例如， 重組生物中此類蛋白質的合成，和用于鑒定與根據本發明的蛋白質相互作用的化合物。例 如，用于BlAcore系統中的表面等離子體共振可以用于增加噬菌體抗體選擇的效率，從 結合本發明蛋白質表位的噬菌體抗體的單個文庫產生親和力的高度增加(Schier，Human Antibodies Hybridomas 7 (1996),97-105 ；Malmborg, J. Immunol. Methods 183(1995), 7-13)。在許多情況中，抗體對抗原的結合現象等價于其他配體/抗配體結合。在一個實施方案中，本發明涉及包含本發明的多肽的互補序列的反義核酸分子。修飾表達水平和/或活性的方法是本領域技術人員已知的并且包括例如過表達、 共抑制、使用核酶、有義和反義策略、基因沉默方法。“有義鏈”指雙鏈DNA分子的鏈，其與其mRNA轉錄物同源。“反義鏈”含有與“有義鏈”的序列互補的倒置序列。“反義”核酸分子包含與編碼蛋白質的“有義”核酸分子互補，例如，與雙鏈cDNA分 子的編碼鏈互補或者與mRNA序列互補的核苷酸序列。因此，反義核酸分子可以通過氫鍵結 合有義核酸分子。反義核酸分子可以與整個Rpi_blb2編碼鏈互補，或者僅與其一部分互 補。因此，反義核酸分子可以為本發明多核苷酸的核苷酸序列的編碼鏈的“編碼區”的反義 序列。術語“編碼區”指包含密碼子的核苷酸序列區，所述密碼子翻譯成氨基酸殘基。此外， 反義核酸分子是編碼Rpi_blb2的核苷酸序列的編碼鏈的“非編碼區”反義的。術語“非編碼 區”指編碼區側翼的5’和3’序列，其不翻譯成多肽，即也稱作5’和3’非翻譯區(5’ -UTR 或者 3’ -UTR)。考慮到編碼本文公開的Rpi_blb2的編碼鏈序列，可以根據Watson和Crick堿基 配對法則設計本發明的反義核酸分子。反義核酸分子可以與Rpi_blb2mRNA的完整編碼區 互補，但是也可以是與Rpi_blb2mRNA的編碼或者非編碼區的僅一部分反義的寡核苷酸。例 如，反義寡核苷酸可以與Rpi_blb2mRNA的翻譯起始位點周圍的區域互補。反義寡核苷酸可 以長為例如，約5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50個核苷酸。使用化學合成和酶促連接 反應，用本領域公知的方法可以構建本發明的反義核酸分子。例如，使用天然發生的核苷 酸或者設計用于增加分子的生物學穩定性或者增加反義和有義核酸之間形成的雙鏈體的 物理穩定性的多種經修飾的核苷酸可以化學合成反義核酸分子(例如，反義寡核苷酸)，例 如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。經修飾的核苷酸的實例可以用于產 生反義核酸，包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、
4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基-氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧 基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、日-0-半乳糖基(11^0&1^、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、 1-甲基鳥嘌呤、1-甲基-肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲 基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基 氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基que0Sine、5’ -甲氧基羧基甲基-尿嘧啶、5-甲氧 基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(ν)、wybutoxosine、假 尿嘧啶、q ue0Sine、2-巰基胞嘧啶、5-甲基_2_硫尿嘧啶、2_硫代-尿嘧啶、4_硫尿嘧啶、
5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基-乙酸(ν)、5_甲基-2-硫尿嘧 啶、3-(3_氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)W、和2，6_ 二氨基嘌呤。備選地，可以使 用表達載體通過生物學方法產生反義核酸，其中已經以反義方向將多核苷酸亞克隆到所述 表達載體(即，從所插入的多核苷酸轉錄的RNA將為與目的靶多核苷酸反義方向，在下面的 小節中進一步描述)。通常將本發明的反義核酸分子施用于細胞或者原位產生從而它們與編碼 Rpi-blb2的細胞mRNA和/或基因組DNA雜交或者結合，從而例如，通過抑制轉錄和/或翻 譯抑制蛋白質的表達。雜交可以通過常規核苷酸互補形成穩定的雙鏈體，或者例如，對于結 合DNA雙鏈體的反義核酸分子，通過雙螺旋的大溝中的特異相互作用。可以修飾反義分子 從而其特異結合表達于所選細胞表面上的受體或者抗原，例如，通過將反義核酸分子連接 到結合細胞表面受體或者抗原的肽或者抗體實現所述特異結合。使用本文描述的載體也可 以遞送反義核酸分子。為了實現反義分子的足夠細胞內濃度，優選其中反義核酸分子置于 強原核生物、病毒或者真核生物(包括植物)啟動子的控制下的載體構建體。
在另一實施方案中，本發明的反義核酸分子可以是異頭核酸分子。α-異頭核酸分 子與互補RNA形成特異雙鏈雜合分子，其中與常規單位相反，所述鏈相互平行(Gaultier等 人(1987) Nucleic Acids. Res. 15 :6625_6641)。反義核酸分子還可以包含2’_0_甲基-核 糖核苷酸(Inoue 等人(1987) NucleicAcids Res. 15 :6131_6148)或者嵌合的 RNA-DNA 類似 物(Inoue 等人(1987)FEBS Lett. 215 :327_330)。此外，本發明的反義核酸分子可以是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化 性DNA分子，其能夠切割與其有互補區的單鏈核酸，如mRNA。從而，核酶(例如，錘頭核酶 (在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334:585-591)中描述)可以用于催化性切割 Rpi-blb2mRNA轉錄物從而抑制mRNA的翻譯。可以基于本文公開的Rpi_blb2cDNA的核苷酸 序列或者基于將根據本發明中教導的方法分離的異源序列設計對編碼Rpi_blb2的核酸分 子具有特異性的核酶。例如，可以構建四膜蟲L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位點的核苷 酸序列與編碼mRNA中待切割的核苷酸序列互補。見，例如，Cech等人美國專利號4，987,071 和Cech等人美國專利號5，116，742。備選地，可以用Rpi_blb2mRNA從RNA分子庫選擇具有 特異核糖核酸酶活性的催化性RNA。見，例如，Bartel，D.和Szostak，J. W. (1993) Science 261 :1411-1418。本發明的反義分子還包含多核苷酸，其包含與Rpi_blb2核苷酸序列的調 節區(例如，其啟動子和/或增強子)互補的核苷酸序列，例如，以形成三螺旋結構，其防 止靶細胞中基因的轉錄。一般見，Helene, C. (1991)Anticancer Drug Des. 6(6) :569_84 ； Helene, C.等人(1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660 :27_36 ；和 Maher, L. J. (1992) Bioassays 14(12) :807-15。此外，在一個實施方案中，本發明涉及產生轉基因植物、植物細胞或者植物組織 的方法，其包括將本發明的多核苷酸或者載體導入所述植物、植物組織或者植物細胞的基 因組。在優選實施方案中，所述載體或者所述多核苷酸在用于表達另一抗性基因，尤其 Rpi-blb的載體或多核苷酸之前、之后或一起導入所述植物、植物組織或者植物細胞的基因組。為了在植物細胞中以有義或者反義方向表達根據本發明的核酸分子，將分子置于 確保在植物細胞中表達的調節元件的控制下。這些調節元件可以關于待表達的核酸分子以 及關于待轉化的植物種類是異源或同源的并且在上文中詳細描述。通常，此類調節元件包含在植物細胞中有活性的啟動子。為了得到轉基因植物 的所有組織中的表達，例如，使用組成型啟動子，如CaMV的35S啟動子(Odell，Nature 313 (1985)，810-812)或者玉米的聚泛蛋白(polyubiquitin)基因的啟動子(Christensen, Plant Mol. Biol. 18 (1982)，675-689)。為了實現轉基因植物中特定組織的表達，可能使用 組織特異啟動子(見，例如，Stockhaus, EMBO J. 8 (1989)，2245-2251)。還已知在馬鈴薯的 塊莖或者不同植物種，如玉米、蠶豆、小麥、大麥等的種子中具有特異活性的啟動子。可以用 誘導型啟動子以便能夠精確控制表達。誘導型啟動子也包含通過植物的感染誘導的啟動 子。其他實施方案在上文描述。在一個實施方案中，本發明涉及產生抗卵菌門病原體的植物或其部分的方法，其 包括步驟在植物或其部分中表達本發明的多肽和另一抗性蛋白質。因此，在另一實施方案中，本發明涉及本發明的或者根據本發明方法產生的轉基 因植物或植物組織，其當存在所述多核苷酸或載體時抗所述病原體。
經轉化的生物(或者轉化的細胞或組織)的產生需要向相關宿主細胞導入所述 DNA、RNA或者蛋白質。許多方法可用于該步驟，其稱作轉化(或者轉導或轉染)(Keown等 人(1990)Methods in Enzymology 185:527-537)。例如，通過微注射或者用DNA包被的微 粒轟擊可以直接導入DNA或RNA。而且，例如，使用聚乙二醇可以化學透化細胞，從而DNA可 以通過擴散進入細胞。還可以通過原生質體與其他含有DNA的單位，如小細胞(minicell)、 細胞、溶菌酶或者脂質體融合導入DNA。導入DNA的另一種適宜的方法是電穿孔，其中通 過電脈沖可逆地透化細胞。已經描述了適宜的方法(例如，Bilang等人(1991)Gene 100 247-250 ；Scheid 等人(1991)Mol Gen Genet 228 :104_112 ；Guerche 等人(1987)Plant Science 52 :111_116 ;Neuhause 等人(1987)Theor Appl Genet 75 :30_36 ;Klein 等人
(1987)Nature327 :70_73 ；Howell 等人(1980)Science 208 1265 ；Horsch 等人(1985) Science 227 :1229_1231 ;DeBlock 等人(1989)Plant Physiology 91 694-701 ；Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach 禾口 Weissbach,編著)Academic Press Inc.
(1988)；禾口Methods in Plant MolecularBiology (Schuler 禾口 Zielinski，編著)Academic Press Inc. (1989))。在植物中，上述從植物組織或植物細胞轉化和再生植物的方法用于瞬時和穩定轉 化。適宜的方法特別為通過聚乙二醇誘導的DNA攝入的原生質體轉化、使用基因槍的生物 射彈方法(其也稱作微粒轟擊方法)、電穿孔、將干燥胚胎在含有DNA的溶液中孵育，和微注 射。除了這些“直接”轉化技術，通過根癌農桿菌或者毛根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的細菌感染也可以實現轉化。農桿菌介導的轉化最適于雙子葉植物細胞。所 述方法由例如，Horsch RB 等人(1985) Science225 :1229f 描述。當使用農桿菌時，表達盒必需整合到特定質粒中，可以整合到穿梭載體或者中間 載體，或者整合到雙元載體中。如果用Ti或者Ri質粒進行轉化，Ti或者Ri質粒T-DNA的 至少右邊界，但是在多數情況中，右邊界和左邊界以側翼區的形式連接待導入的表達盒。優選使用雙元載體。雙元載體能夠在大腸桿菌和農桿菌中復制。通常，它們包含 選擇標記基因和接頭或多接頭，其側翼是右和左T-DNA邊界序列。可以將它們直接轉移到 農桿菌中(Holsters等人(1978)Mol Gen Genetl63 181-187)。選擇標記基因允許選擇所 轉化的農桿菌并且為，例如，nptll基因，其賦予對卡那霉素的抗性。作為宿主生物的農桿 菌在該情況中應該已經含有具有vir區的質粒。vir區是將T-DNA轉移到植物細胞所需的。 以這種方法轉化的農桿菌可以用于轉化植物細胞。T-DNA用于轉化植物細胞的用途已經詳 細研究禾口描述(EP 120516 ；Hoekema, The Binary PlantVector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V.，Alblasserdam, V 章；An 等人(1985) EMBO J 4 :277_287)。多種雙元載 體是已知的，它們的一些可以通過商業途徑得到，如ρΒΙΙΟΙ. 2或者pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA)。已經描述了適宜在植物中表達的其他啟動子(Rogers等人(1987) Methin Enzymol 153 :253_277 ；Schardl 等人(1987) Gene 61 :1_11 ；Berger 等人(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86 :8402_8406)。直接轉化技術適于任意生物和細胞類型。對于DNA或者RNA注射或者電穿孔到植物細胞的情況，所用的質粒不必滿足任何具體要求。可以使用簡單質粒，如PUC系列的質粒。如果將從所轉化的細胞再生完整植物， 必需額外的選擇標記基因位于質粒上。選擇標記是所導入的DNA的部分時，可以從未轉化的細胞選擇穩定轉化的細胞， 即含有整合到宿主細胞的DNA的所導入DNA的那些細胞。可以作為標記的基因的實例為能 夠賦予抗生素或者除草劑(如卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素或者膦絲菌素)抗性的基 因(見上文)。表達此類標記基因的轉化細胞能夠在相應抗生素或除草劑的一定濃度存在 下存活，而所述抗生素或除草劑殺死未轉化的野生型。實例在上文描述并且優選包含bar 基因，其賦予對除草劑膦絲菌素的抗性(Rathore KS等人(1993)PlantMol Biol 21(5) 871-884)，還包括nptll基因，其賦予卡那霉素抗性；hpt基因，其賦予潮霉素抗性，或者 EPSP基因，其賦予除草劑草甘膦抗性。選擇標記允許從未轉化的細胞選擇經轉化的細胞 (McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5 :81_84)。可以以常規方式培育和雜交所得 植物。為了確保基因組整合是穩定和可遺傳的，應該生長兩代或更多代。上述方法描述于例如，SD Kung和R Wu編著的Jenes B等人(1993) Techniques for Gene Transfer Transgenie Plants,卷 1, Engineering andUtilization, Academic Press,128-143 頁禾口 Potrykus(1991)Annu Rev PlantPhysiol PlantMolec Biol 42: 205-225)。優選將待表達的構建體克隆到適于農桿菌轉化的載體，例如，pBinl9中(Bevan 等人(1984)Nucl Acids Resl2 :8711f)。一旦已經產生了經轉化的植物細胞，就可以使用技術人員已知的方法得到完整植 物。例如，愈傷組織培養物用作起始材料。可以用該還未分化的細胞生物量以已知方式誘 導芽和根的發育。所得的芽可以移植到戶外并繁殖。技術人員熟悉從植物細胞和植物部分再生完整植物的方法。再生方法描述于例 如，Fennell 等人(1992)Plant Cell Rep. 11 :567_570 ；Stoeger 等人(1995)Plant Cell Rep. 14 273-278 Jahne 等人(1994)Theor Appl Genet 89 :525_533。根據本發明的方法可以有利地與產生病原體抗性(例如，對昆蟲、真菌、細菌、線 蟲等的抗性)、脅迫抗性和植物性質的另一種改善的其他方法聯合使用。實例由Dimwell JM,Transgenic approaches to crop improvement,JExp Bot. 2000 ；51Spec No ;487_96頁 提及。農桿菌的適宜株系和載體以及農桿菌的轉化和適宜的生長和選擇培養基 是技術人員公知的并且描述于現有技術中(GV31 01 (pMK90RK)，Koncz, Mol. Gen. Genet. 204(1986)，383-396 ；C58C1(pGV 3850kan)，Deblaere, Nucl. Acid Res. 13(1985)， 4777 ；Bevan, Nucleic. Acid Res. 12(1984) , 8711 ；Koncz, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86(1989),8467-8471 ；Koncz, Plant Mol. Biol. 20(1992),963-976 ；Koncz, Specialized vectors for gene tagging andexpression studies. In :Plant Molecular Biology Manual 卷 2, Gelvin 禾口 Schilperoort(Eds. ), Dordrecht,荷蘭Kluwer AcademicPubl. (1994),1-22 ；EP-A-120 516 ；Hoekema :The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V. , Alblasserdam(1985), Chapter V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci.，4，1-46 ；An, EMBO J. 4 (1985)，277-287)。盡管在本發明方法中優選使用根癌農桿菌，但是如果希望所述株系賦予的表型， 也可以使用其他農桿菌株系，如毛根農桿菌。
使用上述方法可能轉化多數雙子葉植物。但是對于單子葉植物的轉化，也已經開 發了一些成功的轉化技術。這些技術包括使用例如，上述生物射彈方法轉化以及原生質體 轉化、部分透化細胞的電穿孔、使用玻璃纖維導入DNA，等等。本文所用的術語“轉化”指將外源多核苷酸轉移到宿主細胞，而不管用于轉移的方 法。可以將多核苷酸瞬時或者穩定導入宿主細胞并且可以例如作為質粒或者作為嵌合連接 保持不整合，或者備選地，可以整合到宿主基因組。然后所得轉化的植物細胞可以用于以技 術人員已知的方式再生經轉化的植物。因此，在一個實施方案中，本發明涉及植物細胞，其包含本發明的或者通過本發明 方法可以得到的多核苷酸或載體。優選地，細胞包含賦予另一抗性的多核苷酸或者載體，更 優選地，為編碼Rpi-blb的載體或者多核苷酸。從而，本發明還涉及轉基因植物細胞，其含有(優選穩定整合到基因組)根據本發 明的多核苷酸，其連接到允許在植物細胞中表達所述多核苷酸的調節元件，并且其中所述 多核苷酸是轉基因植物細胞外來的。對于外來的含義，見上文。從而，本發明還涉及包含根據本發明的轉基因植物細胞的轉基因植物和轉基因植 物組織。由于本發明多肽的(過)表達，所述植物或植物組織抗植物病原體，尤其抗卵菌。 優選地，所述植物還抗其他病原體，例如，抗吮吸性植物病原體。本文描述了其他病原體。優 選所述植物或者植物組織抗疫霉種，最優選地抗致病疫霉。例如，為了得到表達Rpi_blb2基因的轉基因植物，可以將其編碼區克隆到例如， pBinAR 載體(HSfgen和 Willmitzer，Plant-Science，66，1990，221-230)中。例如，根據 聚合酶鏈反應(PCR)技術，可以用實施例和附圖，例如，表3b中所示引物，尤其用ARFl F和 ARFl R擴增Rpi_blb2的編碼區。可以純化所得PCR片段并隨后將該片段克隆到載體中。 可以將所得載體轉移到根癌農桿菌中。該株系可以用于轉化并且可以選擇轉基因植物。在 另一實施方案中，本發明涉及包含本發明的植物細胞的轉基因植物或者植物組織。例如，關于核酸序列、包含所述核酸序列的表達盒或者載體或者用所述核酸序列、 表達盒或者載體轉化的生物，“轉基因的”指通過重組方法產生的所有那些構建體，在所述 構建體中，a) Rpi-blb2核酸序列，或者b)有效連接Rpi_blb2核酸序列的遺傳控制序列，例如，啟動子，或c) (a)和(b)不位于它們的天然遺傳環境中或者已經通過重組方法修飾，修飾的一個實例是替 代、加入、缺失、倒置或者插入一個或多個核苷酸殘基。天然遺傳環境指最初生物中天然染 色體基因座，或者指存在于基因組文庫中。對于基因組文庫，優選保持，至少部分保持核酸 序列的天然遺傳環境。所述環境在核酸序列側翼的至少一邊并且具有長為至少50bp，優 選至少500bp，特別優選至少lOOObp，非常特別優選至少5000bp的序列。天然發生的表達 盒_例如，Rpi_blb2啟動子與相應Rpi_blb2基因的天然發生的組合-當用非天然的、合成 的“人工“方法如誘變修飾時，變成轉基因表達盒。已經描述了此類方法(US 5，565，350 ；WO 00/15815 ；也見上文)。此外，還可以轉化植物細胞、植物組織或者植物，從而(過)表達其他酶和蛋白 質，所述表達支持植物或者植物組織抗性的增加，例如，Rpi-blb (同義詞Rpi-blbl、RB或Sbul)、Rl、Rpi-mcd、R-ber (同義詞 R12)、Rpil、Rpi_blb3、Rpi-ABPTU R2, R3a 或 R3b、R4、 R5、R6、R7、R8、R9、RIO、Rll、Ph_l、Ph_2 和 / 或 Ph_3_ 蛋白質。優選 Rpi-blb 和 Rpi_blb2
共表達。本發明還涉及包含如上述的轉基因植物細胞的培養的植物組織，所述植物細胞顯 示出根據本發明的蛋白質的表達。根據上面的定義，優選作為轉基因生物的宿主和起始生 物主要是植物。本發明的范圍內包括植物界高等和低等植物的所有屬和種。還包括具有增 加的Rpi-blb2活性的成熟植物、種子、芽和幼苗，和部分、繁殖材料和從中得到的培養物， 例如，細胞培養物。成熟植物指幼苗之外的任意發育階段的植物。術語幼苗指早期發育階 段的年幼的不成熟的植物。根據本發明得到的任意轉化的植物可以用于常規育種方案中或者用于體外植物 繁殖以產生更多具有相同特征的經轉化的植物和/或可以用于在相同或相關種的其他品 種中引入相同特征。此類植物也是本發明的部分。從經轉化植物得到的種子在遺傳上也含 有相同的特征并且是本發明的部分。如前面提到的，本發明原則上可以應用于可以用本領 域技術人員已知的任意轉化方法轉化的任意植物和農作物。通常，可以根據本發明修飾并且顯示出根據本發明的蛋白質的過表達或者此類蛋 白質合成減少的植物可以來自任意希望的植物種。它們可以是單子葉植物或者雙子葉植 物，優選它們屬于在農業、林業或者園藝上重要的植物種，如農作物植物(例如，玉米、稻、 大麥、小麥、黑麥、燕麥等等)、馬鈴薯、產油植物(例如，油菜籽、向日葵、花生、大豆等等)、 棉花、甜菜、甘蔗、豆科植物(例如，豆類、豌豆等等)、產木材植物，優選樹等等。然而，優選 可以受疫霉種感染的植物。因此，在一個實施方案中，本發明的或者根據本發明方法產生的植物、植物細胞或 者植物組織選自根據Systema Naturae 2000, Brands, S. J, Amsterdam的荇菜科、茄科、厚 殼樹科、核果茄科、Goetzeaceae、旋花科、菟絲子科、花惹科和田基麻科(Hydrophyllaceae) 構成的組或者具有其來源。優選地，本發明的或者根據本發明方法產生的所述植物、植物 細胞或者植物組織為茄科，優選選自根據Systema Naturae 2000，Brands, S. J, Amsterdam 的由顛茄屬、Browallia、番茉莉屬、辣椒屬(Capsicum)、夜香樹屬、Cyphomandra、曼陀羅 屬(Datura)、Fabiana> Franciscea、天仙子屬(Hyoscyamus)、枸杞屬(Lycium)、爺參屬 (Mandragora)、假酸漿屬(Nicandra)、煙草屬(Nicotiana)、碧冬茄屬(Petunia)、酸漿屬 (Physalis)、Schizanthus和茄屬(Solanum)構成的組或者具有其來源。更優選地，本發明的或者根據本發明方法產生的植物、植物細胞或者植物組織 為 S. bulbocastanum、馬鈴薯(S. tuberosum)、番爺(S. Iycopersicum)、矮牽牛、樹番爺 (S. betaceum)、pear melon(S. muricatum)和茄子(S. melongena)。甚至更優選地，所述植 物、植物組織或植物細胞是馬鈴薯或番茄。最優選地為馬鈴薯。在其他系統中，分類將是 類似的。本領域技術人員已知所述差異，例如，更通常，番茄被系統命名為Lycopersicon lycopesicum(L.)Karsten ex Farwell0在再一方面，本發明還涉及根據本發明的轉基因植物的可收獲部分和繁殖材料， 其含有表達根據本發明的核酸分子和/或多肽的轉基因植物細胞或者含有顯示出本發明 多肽的增加的水平的細胞。可收獲部分原則上可以為植物的任意有用的部分，例如，花、花粉、幼苗、塊莖、葉子、莖干、果實、種子、根等等。繁殖材料包括例如，種子、果實、插條、幼苗、塊莖、根莖等等。 優選馬鈴薯、番茄、eggfruits或者pear melons作為可收獲的或者繁殖材料。對于本發明 的植物為矮牽牛的情況，本發明在一個實施方案中涉及矮牽牛的花作為可收獲的部分。本發明還涉及根據本發明的轉基因生物和(對于轉基因植物生物)從它們來源的 細胞、細胞培養物、部分，例如，根、葉等等，和轉基因繁殖材料(如種子或果實)的用途，用 于生產食品或飼料、藥物或者精細化學品。具體地，馬鈴薯可以用于產生精細化學品。因此，在另一實施方案中，本發明涉及本發明的多核苷酸、植物、植物細胞或者植 物組織、載體或者多肽的用途，用于制備脂肪酸、類胡蘿卜素、類異戊二烯、維生素、脂類、蠟 酯、(多)糖和/或聚羥基鏈烷酸酯，和/或其代謝產物，尤其類固醇激素、膽固醇、前列腺 素、甘油三酯、膽汁酸和/或酮體產生細胞、組織、和/或植物。有許多機制，通過這些機制 可以實現脂肪酸、類胡蘿卜素、類異戊二烯、維生素、蠟酯、脂類、(多)糖和/或聚羥基鏈烷 酸酯，和/或其代謝產物，尤其類固醇激素、膽固醇、甘油三酯、前列腺素、膽汁酸和/或酮體 或者摻入此類經改變的蛋白質的上面定義的精細化學品的產生、生產和/或生產效率。對 于植物，例如，通過增加乙酰輔酶A的表達，可能增加所產生的所述化合物的量，從而允許 更容易收獲和純化，或者對于植物，更有效分配，乙酰輔酶A是細胞中許多產物的基礎，所 述產物為例如，脂肪酸、類胡蘿卜素、類異戊二烯、維生素、脂類、(多)糖、蠟酯、和/或聚羥 基鏈烷酸酯，和/或其代謝產物，尤其前列腺素、類固醇激素、膽固醇、甘油三酯、膽汁酸和/ 或酮體。此外，可能需要一種或多種所述代謝產物、增量輔因子、前體分子，和適宜的生物 合成途徑的中間化合物。因此，通過增加參與營養(如碳源(即糖)、氮源(即，氨基酸、銨 鹽)、磷酸和硫)輸入的轉運蛋白的數目和/或活性，由于除去了對生物合成過程的營養供 給限制，可以提高如上所述的乙酰輔酶A和其代謝產物的產生。具體地，可以提高植物中所 述化合物的產生、生產和/或生產效率，所述化合物為例如，脂肪酸、類胡蘿卜素、類異戊二 烯、維生素、脂類、(多)糖、和/或聚羥基鏈烷酸酯，和/或其代謝產物，尤其類固醇激素、 膽固醇、前列腺素、甘油三酯、膽汁酸和/或酮體分子。進一步優選的是在宿主生物中重組產生藥物或者精細化學品的方法，其中用上述 表達盒之一轉化宿主生物，并且該表達盒包含一種或多種結構基因，其編碼所希望的精細 化學品或者催化所希望的精細化學品的生物合成，培養所轉化的宿主生物，并從培養基分 離所希望的精細化學品。該方法可以廣泛應用于精細化學品如酶、維生素、氨基酸、糖、脂肪 酸，和天然和合成調味劑、香料物質和著色劑。特別優選的是產生生育酚和生育三烯酸和類 胡蘿卜素類。培養所轉化的生物并通過技術人員公知的方法從宿主生物或者培養基分離產 物。藥物，如抗體或者疫苗的產生由 Hood EE,Jilka JM. Curr Opin Biotechnol. 1999Aug ； 10(4) 382-6 ；Ma JK, Vine ND. Curr Top Microbiol Immunol. 1999 ；236 :275_92 描述。在一個實施方案中，本發明還涉及本發明的多核苷酸、載體或者多肽的用途，用于 產生具有所述抗性的植物或植物或其部分的組織、器官或者細胞。此外，在一個實施方案中，本發明涉及鑒定刺激對所述植物病原體的抗性的化合 物的方法，其包括a)在細胞培養條件下將表達本發明多肽或者其mRNA的細胞與候選化合物接觸；b)測定所述多肽或者所述mRNA的表達的增加；c)比較不存在所述候選化合物時，做出的對標準應答的表達水平；其中相對于標準增加的表達表明所述化合物刺激抗性。所述化合物可以化學合成或者經微生物產生和/或包含于例如來自例如，植物、 動物或者微生物，例如，病原體的的樣品中，例如，細胞提取物中。此外，所述化合物可以是 本領域已知的但是迄今為止還不知道能夠抑制或者激活Rpi_blb2。反應混合物可以是無 細胞提取物或者可以包含細胞或者組織培養物。本發明方法的適宜的構成是本領域技術人 員已知的并且例如，通常描述于Alberts等人，Molecular Biology of the Cell，第三版 (1994)，尤其第17章。化合物可以例如，加到反應混合物、培養基、注射到細胞或者噴霧到 植物上。如果以本發明的方法鑒定了含有化合物的樣品，那么可能從鑒定為含有能夠激活 或者增加對所述病原體抗性的化合物的原始樣品分離所述化合物，或者可以進一步細分原 始樣品(例如，如果它由許多不同化合物組成)以便減小每個樣品不同物質數并用原始樣 品的細分樣品重復所述方法。取決于所述樣品的復雜性，上述步驟可以進行數次，優選直到 根據本發明鑒定的樣品僅包含有限數目的或者僅一種物質。優選地，所述樣品包含具有相 似化學和/或物理性質的物質，最優選地，所述物質是相同的。優選地，根據上述方法鑒定 化合物或者其衍生物進一步以適于應用于植物育種或者植物細胞或組織培養的形式配制。可以根據本發明的方法測試和鑒定的化合物可以是表達文庫，例如，cDNA表達 文庫、肽、蛋白質、核酸、抗體、小有機化合物、激素、肽模擬物、PNA等等(Milner，Nature Medicine 1 (1995),879-880 ；Hupp, Cell 83(1995), 237-245 ；Gibbs, Cell 79(1994)， 193-198和如上引用的參考文獻)。所述化合物還可以是已知抑制劑或者激活劑的功能衍 生物或者類似物。制備化學衍生物和類似物的方法是本領域技術人員公知的并且描述于 例如，Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New Yorklnc., 175Fifth Avenue, New York, N. Y. 10010U. S. A.禾口 OrganicSynthesis，Wiley, New York, USA。此外，可以根據本領域已知的方法測試所述衍生物和類似物的效果。此外，例如，根據 上述方法，可以使用肽模擬物和/或計算機輔助設計適宜的衍生物和類似物。可以用于本 發明方法中的細胞或者組織優選為上文實施方案中描述的本發明的宿主細胞、植物細胞或 者植物組織。可以如實施例中描述的，尤其通過孢子形成指數測定可以確定化合物是否能夠抑 制或者激活所述物質。通過上述方法鑒定的激活劑可以證明用作殺真菌劑或者植物保護 劑。從而，在另一實施方案中，本發明涉及根據本發明方法得到或鑒定的化合物，所述化合 物為Rpi_blb2的激動劑。因此，在一個實施方案中，本發明還涉及通過本發明方法鑒定的化合物。所述化合物為例如，Rpi_blb2的同源物。通過誘變，例如Rpi_blb2的離散點突變 或者截短可以產生本發明多肽的同源物。如本文所用的，術語“同源物”指作為Rpi_blb2的 活性激動劑的蛋白質的變體形式。所述蛋白質的激動劑可以基本上保持Rpi_blb2的相同 生物活性或者其一部分。在一個實施方案中，本發明涉及特異識別本發明化合物的抗體。本發明還涉及診斷組合物，其包含至少一種前述多核苷酸、核酸分子、載體、蛋白 質、本發明的抗體或者化合物和任選適宜的檢測方法。本發明的診斷組合物適于從細胞分離mRNA并在雜交條件下將所得到的mRNA與包含如上述的核酸探針的探針接觸，檢測與所述探針雜交的mRNA的存在，從而檢測細胞中所 述蛋白質的表達。檢測根據本發明的蛋白質的存在的其他方法包括本領域公知的免疫技 術，例如，酶聯免疫吸附測定。此外，可能使用根據本發明的核酸分子，尤其實施例，例如表 3a或3b中描述的標記作為植物育種中的分子標記或者引物。適宜檢測方法是本領域技術人員公知的，例如，用于雜交測定的緩沖液和溶液，例 如，前述融合和緩沖液，和例如Sambrook等人中描述的DNA印跡、蛋白質印跡、RNA印跡等 是已知的。在另一實施方案中，本發明涉及試劑盒，其包含本發明的多核苷酸、載體、宿主細 胞、多肽、反義核酸、抗體、植物細胞、植物或植物組織、可收獲部分、繁殖材料或者化合物。本發明的試劑盒的化合物可以包裝在諸如瓶子的容器中，任選使用緩沖液和/或 溶液。如果適宜，可以將一種或多種所述組分包裝在一個和相同容器中。額外或備選地，可 以將一種或多種所述組分吸附到固相支持體，如硝酸纖維素濾膜、玻璃板、芯片或者尼龍膜 或者微量滴定板的孔。所述試劑盒可以用于任一種本文描述的方法和實施方案中，例如，用 以產生宿主細胞、轉基因植物、藥物組合物、檢測同源序列、鑒定拮抗劑或激動劑等等。此外，試劑盒可以還包含關于試劑盒用于任意所述實施方案，尤其用于增加植物 細胞、植物組織或植物對一種或多種所述病原體的抗性的使用說明。在優選實施方案中，所述試劑盒還包含多核苷酸，其編碼一種或多種前述抗性蛋 白質，優選Rpi-blb，和/或與所述抗性蛋白質，優選與Rpi-blb相關的抗體、載體、宿主細 胞、反義核酸、植物細胞或植物組織和/或植物。在另一實施方案中，本發明涉及產生植物保護劑的方法，所述植物保護劑提供本 發明的多核苷酸、載體或者多肽，所述方法包括本發明方法的步驟；和以可以用作植物農業 組合物的形式配制本發明的多核苷酸、載體或者多肽或者所述方法的步驟(C)中鑒定的化 合物。在另一實施方案中，本發明涉及產生植物保護劑組合物的方法，其包括本發明方 法的步驟；和(a)以可以作為農業組合物接受的形式配制步驟(C)中鑒定的化合物。“可以作為農業組合物接受”理解為此類組合物符合規定殺真菌劑、植物營養、除 草劑等的含量的法律。優選地，此類組合物對所保護的植物和用該植物飼養的動物(包括 人)沒有任何害處。本發明還涉及與此類用途和方法有關的一些實施方案。可以以一種或多種下面的 方法使用本文描述的多核苷酸、多肽、蛋白質同源物、融合蛋白質、引物、載體、宿主細胞鑒 定抗所提及的植物病原體和相關生物的的植物；基因組作圖；鑒定和定位目的序列；進化 研究；確定功能所需區域；活性的調節。因此，本發明的多核苷酸具有許多用途。首先，它們可以用于鑒定生物為 S. bulbocastanum或者其親戚。而且它們可以用于鑒定混合植物群體中S. bulbocastanum 或者其親戚的存在。通過在嚴格條件下用跨該S. bulbocastanum獨特的本發明基因的區域 的探針探測從植物的單一或者混合群體培養物所提取的基因組DNA，可以確定本發明是否 使用了 S. bulbocastanum或者其親戚，例如近親，或者是否存在S. bulbocastanum或者其親 戚，例如，近親。
此外，本發明的多核苷酸可以與相關物種的序列足夠同源從而這些核酸分子可以 作為構建相關生物中基因組圖譜的標記。本發明的多核苷酸還可以用于進化和蛋白質結構研究。通過比較本發明的 Rpi-blb2的序列與編碼來自其他生物的相似酶的序列，可以評估生物的進化相關性。類似 地，此類比較允許評估所述序列的哪些區是保守的，哪些不是保守的，這可以有助于確定蛋 白質的對于所述酶功能必要的那些區。這種確定對于蛋白質工程化研究是有價值的并且可 以指示在誘變而不喪失功能方面，所述蛋白質可以耐受什么。本發明的描述和實施例公開并包括這些和其他實施方案。關于按照本發明使用 的方法、用途和化合物任一種的其他文獻可以使用例如電子裝置從公共圖書館檢索。例 如，可以利用公共數據庫"Medline”，其可以在因特網上以http //www. ncbi. nlm. nih. gov/PubMed/medline. html 提供。其他數據庫禾口網址，如 http://www.ncbi.nim.nih. gov/, http://www. infobiogen. fr/, http://www. fmi. ch/biology/research-tools. html, http://www. tigr. org/是本領域技術人員已知的并且可以使用例如，http//www. lycos, com得到。在Berks，TIBTECH 12 (1994)，352-364中給出了生物技術專利信息綜述和可用 于回溯檢索和最新文獻通報的專利信息的相關來源的調查。表表1 序列表2. 2000年在荷蘭的Marknesse進行的田間試驗中BC4作圖群ARG95-3和ARP 96-11的2851個子代克隆中抗性的分離。用括號中的百分數表示分類為具有抗性、敏感或 者未知表型的克隆數。
權利要求
1.產生或者增加植物對卵菌門植物病原體的抗性的方法，其包括增加植物或植物組 織、器官或細胞或植物部分中Rpi_blb2蛋白質的活性。
2.權利要求1的方法，其中所述Rpi_blb2蛋白質由包含核酸分子的多核苷酸編碼，所 述核酸分子選自(a)編碼SEQID NO 2或者4中描述的多肽的至少成熟形式的核酸分子；(b)核酸分子，其包含編碼所述多肽的至少成熟形式的如SEQIDNO :1或3或5或6中 描繪的編碼序列；(c)核酸分子，其核苷酸序列由(a)或者(b)的核苷酸序列的遺傳密碼簡并產生；(d)核酸分子，其編碼的多肽通過從(a)到(c)的多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列的 一個或幾個氨基酸的替代、缺失和/或加入從(a)到(c)的多核苷酸編碼的多肽衍生；(e)核酸分子，其編碼的多肽的序列與(a)或(b)的核酸分子編碼的多肽的氨基酸序列 具有70%或以上的同一性；(f)核酸分子，其包含(a)到(e)任一項的核酸分子編碼的多肽的片段或者具有表位的 部分；(g)核酸分子，其包含的多核苷酸具有用表3b中所列引物從核酸文庫擴增的核酸分子 的序列；(h)核酸分子，其編碼(a)到(g)任一項編碼的多肽的以氨基酸1、30、50、100、200、 300,500或1000開始并以氨基酸1267、1000、500、300、200、50、30、或1結束的片段；(i)包含(a)或(d)任一項的多核苷酸的至少20個核苷酸的核酸分子；(j)核酸分子，其編碼的多肽被針對(a)到(h)任一項的核酸分子編碼的多肽產生的單 克隆抗體識別；(k)核酸分子，其可以通過用具有(a)到(j)任一項的核酸分子序列或者其至少20個 核苷酸的片段的探針在嚴格條件下篩選適宜文庫得到；和(1)核酸分子，其互補鏈在嚴格條件下與(a)或(k)任一項的核酸分子雜交；或者(a)到⑴任一項的互補鏈；或者表達Solanum bulbocastanum或者馬鈴薯的染色體或連鎖群6的區段編碼的多 肽，所述區段與選自表3a或3b的標記共分離，并且所述多肽介導對卵菌門病原體的抗性；其中所述多核苷酸不由Seq. ID NO. :7或9中描述的序列組成。
3.權利要求1或2的方法，其中至少一種其他抗性蛋白質的活性增加。
4.權利要求1到3任一項的方法，其中活性由于從頭表達而增加。
5.權利要求1到4任一項的方法，其中Rpi-blb2和/或至少一種其他抗性蛋白質的內 源活性增加。
6.權利要求1到5任一項的方法，其包括一個或多個下面的步驟a)穩定抗性蛋白質；b)穩定編碼抗性蛋白質的mRNA；c)增加抗性蛋白質的比活；d)表達用于抗性蛋白質表達的同源或者人工轉錄因子或者增加用于抗性蛋白質表達 的同源或者人工轉錄因子的表達；e)通過外源誘導因子刺激抗性蛋白質活性；f)表達轉基因抗性蛋白質編碼基因；和/或g)增加抗性蛋白質編碼基因的拷貝數。
7.權利要求1到6任一項的方法，其導致與野生型相比用致病疫霉感染后孢子形成指 數減小至少30%。
8.編碼Rpi_blb2蛋白質的多核苷酸，其包含核酸分子，所述核酸分子選自(a)編碼SEQID NO 2或者4中描述的多肽的至少成熟形式的核酸分子；(b)核酸分子，其包含編碼所述多肽的至少成熟形式的如SEQIDNO :1或3或5或6中 描繪的編碼序列；(c)核酸分子，其核苷酸序列由(a)或者(b)的核苷酸序列的遺傳密碼簡并產生；(d)核酸分子，其編碼的多肽通過從(a)到(c)的多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列的 一個或幾個氨基酸的替代、缺失和/或加入從(a)到(c)的多核苷酸編碼的多肽衍生；(e)核酸分子，其編碼的多肽的序列與(a)或(b)的核酸分子編碼的多肽的氨基酸序列 具有70%或以上的同一性；(f)核酸分子，其包含(a)到(e)任一項的核酸分子編碼的多肽的片段或者具有表位的 部分；(g)核酸分子，其包含的多核苷酸具有用表3b中所列引物從核酸文庫擴增的核酸分子 的序列；(h)核酸分子，其編碼(a)到(g)任一項編碼的多肽的以氨基酸1、30、50、100、200、 300,500或1000開始并以氨基酸1267、1000、500、300、200、50、30、或1結束的片段；(i)包含(a)或(d)任一項的多核苷酸的至少20個核苷酸的核酸分子；(j)核酸分子，其編碼的多肽被針對(a)到(h)任一項的核酸分子編碼的多肽產生的單 克隆抗體識別；(k)核酸分子，其可以通過用具有(a)到(j)任一項的核酸分子序列或者其至少20個 核苷酸的片段的探針在嚴格條件下篩選適宜文庫得到；和(1)核酸分子，其互補鏈在嚴格條件下與(a)或(k)任一項的核酸分子雜交；或者(a)到⑴任一個的互補鏈；或者所述核酸分子編碼Solanum bulbocastanum或者馬鈴薯的染色體或者連鎖群6的 區段編碼的多肽，所述區段與選自表3a或3b的標記共分離或者包含所述標記的復制位點 或者雜交位點，并且介導對卵菌門病原體的抗性；其中所述多核苷酸不由Seq. ID NO. 7或9中描述的序列組成。
9 權利要求8的多核苷酸或者權利要求2到7任一項的方法，其中所述標記為E40M58、 CT119 或 CT216。
10.權利要求8到9的多核苷酸，其是DNA或RNA。
11.產生重組載體的方法，其包括將權利要求8到10任一項的多核苷酸插入到載體中 或者插入所述多核苷酸和另一抗性蛋白質。
12.載體，其含有權利要求8到10任一項的多核苷酸或者包含所述多核苷酸和另一抗 性基因或者所述載體通過權利要求11的方法產生。
13.權利要求12的載體或者權利要求1到7任一項的方法，其中編碼Rpi_blb2蛋白質 或者編碼另一抗性蛋白質的多核苷酸有效連接表達控制序列和/或有效連接編碼轉基因表達調節信號的核酸序列，所述調節信號允許在原核或者真核宿主細胞中表達。
14.權利要求12或13的載體或者權利要求1到7任一項的方法，其中編碼Rpi_blb2 蛋白質或者編碼另一抗性蛋白質的多核苷酸有效連接與所述編碼Rpi_blb2蛋白質或者編 碼另一抗性蛋白質的多核苷酸相同物種來源的表達控制序列。
15.產生重組宿主細胞的方法，其包括向宿主細胞導入權利要求12到14任一項的載體 或者導入所述載體和表達另一抗性蛋白質的載體。
16.宿主細胞，其通過權利要求15的方法產生或者用權利要求8到10任一項的多核苷 酸或者權利要求12到14任一項的載體基因工程化或者用所述載體或多核苷酸和表達另一 抗性蛋白質的載體或多核苷酸基因工程化。
17.權利要求16的宿主細胞，其是大腸桿菌、桿狀病毒、農桿菌或者植物細胞。
18.產生Rpi-blb2多肽的方法，其包括培養權利要求16或17的宿主細胞并從培養基 或者宿主細胞回收所述多核苷酸編碼并通過所述宿主細胞表達的多肽。
19.多肽，具有權利要求8到10任一項的多核苷酸編碼的氨基酸序列或者可以通過權 利要求18的方法得到，其中所述多肽不由Seq. ID. No. 8和10中所示氨基酸序列組成。
20.多肽，其具有Rpi_blb2活性。
21.抗體，其特異結合權利要求19或20的多肽。
22.反義核酸分子，其包含權利要求8到10任一項的多核苷酸的互補序列。
23.產生轉基因植物、其植物細胞或者植物組織或部分的方法，該方法包括向所述植 物、其植物組織或者植物細胞或部分的基因組導入權利要求8到10任一項的多核苷酸或者 所述多核苷酸和編碼另一抗性蛋白質的多核苷酸，或者權利要求12到14任一項的載體。
24.植物細胞，其包含權利要求8到10任一項的多核苷酸、權利要求12到14任一項的 載體或者可以通過權利要求23的方法得到。
25.轉基因植物或其植物組織或部分，其包含權利要求24的植物細胞。
26.產生抗卵菌門植物病原體的植物或其部分的方法，其包括步驟在所述植物或其 部分中表達權利要求19或20的多肽和另一抗性蛋白質。
27.產生具有對疫霉具有持久抗性的植物或其部分的方法，該方法包括在植物或者其 部分中共表達Rpi_blb2和Rpi-blb2蛋白質或者權利要求19或20的多肽。
28.權利要求25的或者根據權利要求26或27產生的轉基因植物或者植物組織，當存 在所述多核苷酸或者載體時所述轉基因植物或植物組織抗卵菌門的植物病原體。
29.權利要求25的轉基因植物或植物組織的可收獲部分，其包含權利要求24的植物細胞。
30.權利要求25的轉基因植物或植物組織的繁殖材料，其包含權利要求24的植物細 胞，所述細胞具有增加的Rpi_blb2活性。
31.權利要求8到10任一項的多核苷酸、權利要求12到14任一項的載體，或者權利要 求19或20的多肽的用途，用于產生抗卵菌門植物病原體的植物或植物組織、植物器官或植 物細胞或植物部分。
32.鑒定刺激針對卵菌門植物病原體的抗性的化合物的方法，其包括a)在細胞培養條件下將表達權利要求19或20的多肽或者其mRNA的細胞與候選化合 物接觸；b)測定所述多肽或者所述mRNA的表達的增加；c)比較不存在所述候選化合物時，做出的對標準應答的表達水平；從而相對于標準增 加的表達表明所述化合物刺激抗性。
33.權利要求8到10任一項的多核苷酸、權利要求12到14任一項的載體、權利要求 19或20的多肽或者權利要求21的抗體的用途，用于鑒定和/或產生激活或者刺激針對卵 菌門植物病原體的植物抗性的化合物。
34.診斷組合物，其包含權利要求8到10任一項的多核苷酸、權利要求12到14任一項 的載體、權利要求21的抗體或者權利要求22的反義核酸和任選適宜的檢測方法。
35.試劑盒，其包含權利要求8到12任一項的多核苷酸、權利要求12到14任一項的 載體、權利要求16或17的宿主細胞、權利要求19或20的多肽、權利要求22的反義核酸、 權利要求21的抗體、權利要求24的植物細胞、權利要求25的植物或植物組織、權利要求29 的可收獲部分、或權利要求30的繁殖材料和任選編碼Rpi-blb的多核苷酸、Rpi-blb蛋白 質或者針對Rpi-blb的抗體。
36.產生提供權利要求8到10任一項的多核苷酸、權利要求12到14任一項的載體或 權利要求19或20的多肽的植物作物保護劑的方法，其包括權利要求32的方法的步驟；和 以農業組合物可以應用的形式配制權利要求8到10任一項的多核苷酸、權利要求12或14 的載體或權利要求19或20的多肽或權利要求32的步驟(c)中鑒定的化合物。
37.權利要求1到36任一項的載體、宿主細胞、植物細胞、植物組織、植物、用途、試劑盒 或方法，其中所述植物病原體是腐霉目(Pythiales)或者Peronosperales。
38.權利要求1到37任一項的載體、宿主細胞、植物細胞、植物組織、植物、用途、試劑盒 或方法，其中所述植物病原體是致病疫霉、紅腐疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉、寄生疫霉煙草致 病變種、萵苣盤梗霉、Peronospora tabaci或者葡萄生單軸霉。
39.權利要求1到38任一項的載體、宿主細胞、植物細胞、植物組織、植物、用途、試劑盒 或方法，其中所述抗性蛋白質的特征是P-環和NBS結構域。
40.權利要求2到39任一項的載體、宿主細胞、植物細胞、植物組織、植物、用途、試 劑盒或方法，其中另一抗性基因是編碼Rpi-blb、RU R-ber、RpiU Rpi_blb3、Rpi-ABPTU Rpi-mcd、R2、R3a 和 R3b、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、Rll、Ph_l、Ph_2 和 / 或 Ph_3 的基因。
41.權利要求2到40任一項的載體、宿主細胞、植物細胞、植物組織、植物、用途、試劑盒 或方法，其中另一抗性蛋白質是Rpi-blb蛋白質。
42.權利要求1到41任一項的載體、宿主細胞、植物細胞、植物組織、植物、用途、試劑 盒或方法，其中所述植物、植物細胞或植物組織選自根據Systema Naturae 2000，Brands, S. J，AmSterdam的荇菜科、茄科、厚殼樹科、核果茄科、Goetzeaceae、旋花科、菟絲子科、花惹 科和田基麻科構成的組或者具有其來源。
43.權利要求1到42任一項的載體、宿主細胞、植物細胞、植物組織、植物、用途、 試劑盒或方法，其中所述多核苷酸、多肽、植物細胞、宿主細胞、植物組織或植物來自 前禾斗，優選來自 S. bulbocastanum、馬鈴薯(S. tuberosum)、番前(S. Iycopersicum 或 Lycopersiconlycopersicum (L.) Karsten ex Farwel 1))、矮牽牛、樹番前(S. betaceum)、 pear melon (S. muricatum)或前子(S. melongena) 0
全文摘要
本發明涉及增加植物，尤其茄科(Solanaceae)植物，優選馬鈴薯和番茄對卵菌門(Oomycetes)的植物病原體的抗性的新方法，所述方法包括增加本發明多肽的活性。本發明還涉及多核苷酸和包含這些多核苷酸的載體。本發明還涉及相應的載體、細胞、轉基因植物和來自它們的轉基因繁殖材料，涉及產生它們的方法，還涉及它們用于產生糧食、飼料、種子、藥物或者精細化學品的用途。
文檔編號C12N15/82GK102002503SQ20101029365
公開日2011年4月6日 申請日期2004年8月3日 優先權日2003年8月11日
發明者E·A·G·范德福森, J·J·H·M·阿萊弗斯, M·W·M·穆斯肯斯 申請人:植物育種農業研究所有限公司