專利名稱：Gs-dhfr雙基因篩選表達載體及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是一種GS-DHFR雙基因篩選表達載體及其構建方法與應用。
背景技術：
外源基因在哺乳動物細胞內的擴增是提高外源基因表達水平的重要策略之一。一般來講，表達系統中的整個載體是由兩個獨立且連在一起的表達單元組成外源基因表達單元和擴增基因表達單元，擴增基因往往亦為選擇標記。迄今為止，世界上已經建立了十余種基因擴增選擇系統，其中二氫葉酸還原酶(Dihyrofolate reductase, DHFR)基因擴增系統是最常用的基因擴增選擇系統，而谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase, GS)擴增系統是新近發展的更有效的擴增表達系統。二氫葉酸還原酶能夠被葉酸類似物氨甲喋呤(Methotrexate，MTX)所抑制，用含有目的基因及之相連的DHFR基因的重組質粒轉化CHO DHFR-細胞，利用濃度不斷提高的 MTX選擇抗MTX的細胞系，其中DHFR基因及與之相連的目的基因一起擴增，從而使目的基因高水平表達(Looney JE，Hamlin JL. Mol cell Biol. 1987 ；7 (2) :569-577)。谷氨酰胺合成酶(GQ系統是近年來新發展的一種基因擴增系統。谷氨酰胺合成酶在ATP水解提供能量時，利用細胞內的氨和谷氨酰胺，在缺乏細胞外谷氨酰胺的培養條件下，加入谷氨酰胺合成酶的抑制物(Methionine sulphoximine, MSX)，可使GS基因及與之相連的目的基因擴增，達到提高目的基因表達水平的目的(Bebbington CR, Renner G, Thomson S, et al, Biotechnology. 1992 ； 10(2) :169-175.)。有研究表明GS系統表達水平高(劉文軍，楊芙蓉，阮力，等，病毒學報，1997 ； 13 (2) 103-109)，但細胞長期連續培養時，生長狀況不佳，而DHFR系統表達水平較GS系統低，但細胞生長良好(劉文軍，楊芙蓉，阮力，等，高技術通訊，1997 ;7(幻:44-49) 0所以，建立一個既能高效表達目的基因，又能維持良好細胞形態的篩選擴增系統，對于獲得具有生產價值的基因工程細胞系很有意義，但目前沒有見到這方面的報道，有研究表明，在原核系統中外源基因整合入宿主細胞的基因組中形成整合子antegron)，基因表達水平與表達盒在插入位點的位置和順序有關，由于GS系統和DHFR系統其各自的抑制物不同，目前較多見的是兩個系統分別構建到不同的載體中然后共轉化到宿主細胞中，通過加壓選擇獲得高表達細胞系，而對于雙表達系統的載體如何構建能夠同時發揮二者的優勢及起到協同的作用，目前并未見到報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種GS-DHFR雙基因篩選表達載體及其構建方法與應用。該載體可以利用單一質粒實現外源基因的大量擴增和高效表達，簡化了操作步驟，提高了轉染效率，而且彌補了 DHFR和GS單基因篩選系統的不足。GS-DHFR雙基因篩選表達載體，GS-DHFR雙基因篩選表達載體，依次含有CMV啟動子，外源基因插入位點、CMV啟動子控制的二氫葉酸還原酶基因和SV40啟動子控制的谷氨酰胺合成酶基因，谷氨酰胺合成酶基因下游為SV40polyA信號序列。所述二氫葉酸還原酶基因序列與外源基因插入位點之間還有IRES序列。所述外源基因插入位點為多克隆位點，具有kq ID No. 1所示的核苷酸序列。上述GS-DHFR雙基因篩選表達載體的構建方法，骨架載體為pOpti VEC,所述多克隆位點的核苷酸序列插入到所述pOpti VEC的IRES序列上游，所述谷氨酰胺合成酶基因插入在pOpti VEC的Pvu II位點，所述谷氨酰胺合成酶基因上游帶有SV40啟動子，下游為 SV40polyA信號序列。序列如kq ID No. 5所示。上述GS-DHFR雙基因篩選表達載體的應用，其特征在于在所述外源基因插入位點插入目的外源基因，然后轉入宿主細胞得到轉化細胞；在缺乏谷氨酰胺的培養基中添加葉酸類似物氨甲喋呤和谷氨酰胺合成酶的抑制物對轉化細胞進行加壓篩選以獲得高表達細胞系，對獲得的高表達細胞系進行擴大培養，最后分離提取目的外源基因的表達產物。所述宿主細胞為哺乳動物細胞。所述哺乳動物細胞為CHO DG44細胞。所述高表達細胞系為培養基中葉酸類似物氨甲喋呤和谷氨酰胺合成酶的抑制物的濃度分別為75uM和200nM的條件下加壓篩選獲得。所述目的外源基因為人神經生長因子基因，其核苷酸序列如kq ID No.2所示。本發明提供一種雙基因篩選表達載體，篩選基因為二氫葉酸還原酶基因(DHFR) 和谷氨酰胺合成酶基因(GQ，目的獲得既能高效表達目的基因，又能維持良好細胞形態的篩選擴增系統。發明人通過大量的實驗發現，當載體上的元件及其位置設計如下時“依次含有在前的二氫葉酸還原酶基因表達盒和在后的谷氨酰胺合成酶基因表達盒，外源基因插入位點處于二氫葉酸還原酶基因表達盒中，二氫葉酸還原酶基因的啟動子采用CMV，谷氨酰胺合成酶基因的表達盒使用SV40啟動子”，該載體在宿主細胞中既能得既能高效表達目的基因，又能維持良好細胞形態的篩選擴增系統，本發明的載體設計中，由于CMV啟動子較 SV40啟動子強，通過弱化選擇標記基因表達來達到增強外源基因擴增效率的目的，弱化選擇標記基因的表達，在使用與常規的表達載體相同的選擇壓力時，共擴增基因拷貝數更高， 相應的外源基因的表達水平也得到提高。即比其起將兩個基因擴增系統分別構建載體并共轉化宿主而言，在要獲得相同的外源基因表達水平的情況下，對本發明的載體所轉化的細胞施加MSX選擇壓力，能夠節約所需的試劑成本，即本發明的雙基因表達載體的構建方式使兩個基因擴增系統之間達到了協同的效果，而不是僅僅依賴外界給予的抑制劑施加擴增壓力。從對外源基因的表達效率來看也獲得了突出的效果，如實施例3所示，在培養基中的具有75uM-MSX-200nM-MTX的抑制條件下，轉化細胞的培養上清中重組人NGF的濃度達到 1. 535mg/L ；除生長速度略有降低外，鏡檢發現GS-DHFR雙基因篩選的轉基因DG 44細胞折光好，細胞晶瑩透亮形態良好，每次傳代細胞活力均在95%以上，說明本發明構建的載體實現了在單一質粒同時實現高表達水平、良好的傳代細胞形態和高的傳代存活力。此外，本發明的載體用于轉化宿主細胞時具有操作簡便的優點。本發明的載體優選在DHFR基因之前插入內部核糖體進入位點序列(IRES)，以增強表達盒中的外源基因的表達。本發明構建的表達載體的外源基因插入位點可根據外源目的基因的序列特性選擇不同的多克隆位點核苷酸序列，本發明優選如^^ ID No. 1所示的核苷酸序列為插入到 DHFR之前作為外源基因插入位點。本發明還進一步提供了本發明表達載體的應用，主要用于轉化宿主，在擴增壓力下篩選外源基因高效表達的轉基因細胞系，以通過篩選到的轉基因細胞系獲得外源基因表達產物。由于本發明構建的載體的篩選基因DHFR與GS都是哺乳動物細胞常用的篩選基因，因此，本發明的載體的應用主要指轉化到哺乳動物細胞中使細胞高效率地傳代并表達外源基因。在本發明的一個優選實施例中，構建的表達載體命名為PDG2.0，采用CHO DG44 細胞系為宿主細胞表達外源基因神經生長因子基因，如實施例3的實驗數據表明，采用 GS-DHFR雙基因篩選系統的pDG2. 0/NGF重組質粒轉染DG 44細胞后，在相近的MTX濃度抑制下，重組人NGF的表達水平明顯高于采用DHFR單基因篩選系統的pOptiVEC/NGF重組質粒轉染的DG 44細胞；DHFR單基因篩選系統即使在MTX濃度達250nM時，重組人NGF表達水平也比75uM-MSX-200nM-MTX加壓時的GS-DHFR雙基因篩選系統的表達水平低10倍左右。
圖1. pOptiVEC-polylinker載體的酶切驗證圖譜1. DM15000DNA Marker ；2. pOptiVEC-polyl inker 載體 EcoR I 和 Pvu II 雙酶切圖2. pDG2. 0載體中GS基因的PCR驗證圖譜1. DM15000DNA Marker ；2. pDG2. 0 載體中 PCR 擴增的 GS 基因；3. GS 基因陽性對照圖3. pDG2. 0載體結構示意4. pDG/NGF雙酶切驗證圖譜1. DM15000DNA Marker ；2. pDG/NGF 載體 Xba I 和 Not I 雙酶切圖5.定量ELISA檢測重組人NGF表達水平的標準曲線圖6. Western blot鑒定重組人NGF表達圖譜1.轉染后加壓篩選的CHO DG44細胞培養上清；2.小鼠NGF樣品；3. ProteinRuler I低分子量蛋白標準(12kDa-80kDa)具體實施方法本發明更詳細的實施方法參見實施例，本實施例是用于解釋、說明而不是以任何方式限制本發明。實施例1 真核表達載體pDG2. 0的構建和鑒定步驟1.確定多克隆酶切位點序列首先將一對互補引物退火形成一個46bp的雙鏈DNA分子，然后通過東洋紡公司的的TA克隆試劑盒在3’端加上一個堿基A，序列如下5，-GAATTCAGTC GCGAGACGCG TCGTACGACC CGGGTGATCA CTCGAG-3，，自左向右分別含有7個常用的限制性內切酶位點EcoR I,Nru I,Mlu I,Bsiff I,Xma I,Bcl I和Xho I。步驟2.多克隆酶切位點序列插入pOptiVEC-TOPO載體連接取1. 5ml滅菌Eppendorf管加入上述雙鏈DNA分子6ul和pOptiVEC-TOPO質粒anvitrogen公司)，該載體上含有內部核糖體進入位點序列IRESanternal ribosome entry site, IRES)和DHFR基因序列2ul，5XT4連接緩沖液2ul，T4連接酶lul，22°C孵育2小時。轉化無菌取IOOul感受態細胞TranslO (北京全式金公司)置于冰浴中，加入鏈接產物IOul混合均勻，在冰浴中放置30分鐘，立即轉移到42°C水浴中90秒，然后轉移到冰浴中放置2分鐘，然后每管加入0. 5ml的SOC培養液，37°C搖床ISOrpm輕搖45分鐘。取 200ul轉化菌體，均勻涂布于含有100mg/ml氨芐的LB平板培養基上，在超凈工作臺吹干后放入37°C培養箱倒置培養過夜。挑菌在平板中挑取菌落5個，分別接種于含100mg/ml氨芐青霉素的LB培養基中 (5ml/管)，37°C搖床培養過夜。載體鑒定將提取的質粒，通過多克隆酶切位點上的EcoR I和pOptiVEC 載體上的Pvu II進行雙酶切驗證(如圖1)，并且對驗證得到的陽性克隆進行序列測定。序列結果證明多克隆酶切位點已正確無誤地插入POptiVEC載體，形成中間過渡的pOptiVEC-polylinker載體。加上pOptiVEC載體上的單酶切位點之后， pOptiVEC-polylinker載體多克隆位點自左向右分別含有12個常用的限制性內切酶位點 Xba I.BamH I,EcoR I,Nru I,Mlu I,Bsiff I,Xma I、BclI和 Xho I.BamH I,Not I 禾Π Hpa I。步驟3. GS基因的克隆以ρΕΕ12. 4質粒為模板，用GS基因上下游特異性引物，(上游引物其核苷酸序列如 Seq IDNo. 3所示，下游引物其核苷酸序列如kq ID No. 4所示)擴增GS基因，GS基因上游 SV40啟動子和GS基因下游SV40polyA位點，引物的5’端都加入Sma I酶切位點。PCR擴增體系為=PfuMasterMix (北京全式金公司)25ul，Primerl、Primer2 各 lul，pEE12. 4 模板 Iul，加水至50ul。PCR擴增條件:97°C 1分鐘，61°C 1分鐘，72°C 2分30秒，共30個循環。步驟4. GS基因序列插入pOptiVEC-polyl inker載體單酶切取上述PCR擴增的GS基因片段和pOptiVEC-polyl inker載體，用Pvu II 對pOptiVEC-polyl inker載體進行單酶切，用Sma I對PCR擴增的GS基因進行單酶切。酶切體系=IOX緩沖液5ul，載體10ul，限制性內切酶2ul，補水至50ul，37°C水浴5小時。酶切后產物切膠回收目的片段。(限制性內切酶Pvu II和Sma I購于NEB生物技術有限公司)。去磷酸化將酶切后的pOptiVEC-polyl inker載體進行去磷酸化處理。反應體系為酶切產物30ul，堿性磷酸酶Iul，10X緩沖液3. 5ul，37°C水浴5小時。酶切后產物切膠回收目的片段。連接，轉化及挑菌步驟如步驟2所述。步驟5.載體鑒定取Iul過夜培養菌，采用PCR法進行初步鑒定，反應體系和條件與GS基因克隆條件相同。根據瓊脂糖凝膠電泳結果選取陽性克隆，進行序列測定。測序結果證明GS基因序列已正確無誤的插入到pOptiVEC-polyl inker載體中，即本發明的 GS-DHFR雙基因篩選表達載體構建成功，命名為pDG2.0，其核苷酸序列如^^ ID No. 5所
7J\ ο實施例二 獲得表達重組人NGF的哺乳動物細胞株(以CHO DG44細胞為例)1.NGF基因的獲得查詢UniPro (B 數據庫中人 NGF 蛋白質(UniProtKB/Swiss-Prot ID :P01138)和基因的序列(Genbank ID :NM_002506. 2)，獲得人NGF蛋白質氨基酸全序列和野生型核苷酸序列。然后在不改變成熟人NGF蛋白質氨基酸序列的前提下，利用Vector NTI軟件對進行優化設計，修飾個別密碼子的編碼序列，解決密碼偏性和野生型基因內部酶切位點過多影響載體構建的問題。優化修飾后的人NGF基因編碼核苷酸序列如％(1 ID No. 2所示。該優化后的序列，一方面在起始密碼子ATG前保留了 6個核苷酸序列AGCGTA，使其符合Kozak序列要求而有利于mRNA翻譯和蛋白表達；另一方面，在3’端終止密碼子TGA之前刪除了 6個核苷酸序列AGAGCC，由此導致表達的成熟人NGF蛋白質氨基酸序列比野生型人NGF蛋白質氨基酸序列在羧基端少2個氨基酸。NGF基因進行優化設計后，在5’端插入)(ba I位點，3’ 端插入Not I位點，委托金唯智生物技術有限公司進行全基因合成并連接到pcDNA3. 1載體 (Invitrogen公司)上，構建成功pcDNA3. 1/NGF重組質粒。
2. pDG/NGF重組質粒的獲得將pcDNA3. 1/NGF重組質粒和pDG2. O載體分別用Xba I和Not I雙酶切，然后使酶切后的NGF基因片段和線性化的pDG2. O載體連接。作為對照，將酶切后的NGF基因片段同時插入pOptiVEC-polylinker載體的相同酶切位點之間，連接產物分別轉化大腸桿菌 Trans 10之后，用雙酶切法和測序法進行鑒定，獲得pDG/NGF重組質粒和pOptiVEC/NGF重組質粒。具體操作均同實施例一所述。3.重組質粒pDG2. 0/NGF和pOptiVEC/NGF重組質粒轉染CHO DG44細胞CHO DG44細胞是DHFR缺陷型的中國倉鼠卵巢細胞系，購自于hvitrogen公司。CH0DG44細胞轉染前按說明書常規傳代，以3X IO5細胞/ml密度接種于含有30ml CD DGMmedium(Invitrogen公司)的125ml無菌三角瓶中，使次日細胞密度能達到5 X IO5活細胞/ml，轉染步驟按hvitrogen公司的FreeMyle MAX Reagent說明書進行。將15ul FreeStyle MAX Reagent 和 9ug 重組質粒 DNA 加入到 1. 2ml OptiCHO SFM(Invitrogen 公司)中，輕柔混勻，室溫孵育lOmin。將1.2ml質粒-轉染試劑混合液緩慢且均勻的滴入到細胞培養瓶中，置(X)2培養箱振蕩培養。轉染4 后，以pDG2. 0/NGF重組質粒轉染的DG 44細胞傳代進入不含谷氨酰胺和HT (次磺嘌呤和胸腺嘧啶核苷)的⑶OptiCHO Medium 中進行初步篩選，待細胞活力和密度恢復后，分別逐步提高MTX和MSX濃度進行加壓擴增， 擴大培養進行后續實驗；以pOptiVEC/NGF重組質粒轉染的DG 44細胞傳代進入含有谷氨酰胺、不含HT的CD 0ptiCH0 Medium中進行初步篩選，待細胞活力和密度恢復后，逐步提高 MTX濃度進行加壓擴增，擴大培養進行后續實驗。實施例三重組CHO DG44細胞培養上清中人NGF的檢測1.細胞培養上清的獲得以pDG2. 0/NGF重組質粒轉染DG 44細胞后，將MTX和MSX擴增后的CHO DG44細胞按2X 105/ml密度接種于有30ml CD OptiCHO Medium的125ml無菌三角培養瓶中培養，4天后，將細胞培養液離心，棄去細胞沉淀，收獲細胞培養上清待用。以pOptiVEC/NGF重組質粒轉染的DG 44細胞后，將MTX擴增后的CHO DG44細胞按2X105/ml密度接種于有30ml CD OptiCHO Medium的125ml無菌三角培養瓶中培養， 4天后，將細胞培養液離心，棄去細胞沉淀，收獲細胞培養上清待用。2.定量ELISA檢測細胞培養上清中重組人NGF表達按照R&D公司的《人神經生長因子(NGF) ELISA試劑盒說明書》方法對pDG2. 0/NGF
7轉染的DG 44細胞在75uM-MSX-200nM-MTX加壓濃度下的細胞培養上清(樣品1)中人NGF 表達量的測定。采取相同的試劑盒和操作方法，檢測250nM的MTX加壓濃度下的pOptiVEC/ NGF重組質粒轉染的DG 44細胞的培養上清(樣品幻中重組人NGF的表達，具體操作步驟如下1). NGF標準品溶液配制使用前加入Iml蒸餾水混勻，配成20ng/ml的溶液。設標準管8管，第一管加標品稀釋液(含BSA的PBS pH 7. 2) 900 μ 1，第二至八管加入樣品稀釋液500ul。在第一管中加入20ng/ml的NGF標準品溶液100 μ 1，混勻后用加樣器吸出 500μ 1，移至第二管。如此反復作倍數稀釋，從第七管中吸棄500μ 1，第八管為空白對照，見表1和表2。表1 定量ELISA檢測重組人NGF表達的結果(樣品1)
權利要求
1.GS-DHFR雙基因篩選表達載體，依次含有CMV啟動子，外源基因插入位點、CMV啟動子控制的二氫葉酸還原酶基因和SV40啟動子控制的谷氨酰胺合成酶基因，谷氨酰胺合成酶基因下游為SV40polyA信號序列。
2.根據權利要求1所述的GS-DHFR雙基因篩選表達載體，所述二氫葉酸還原酶基因序列與外源基因插入位點之間還有IRES序列。
3.根據權利要求2所述的GS-DHFR雙基因篩選表達載體，所述外源基因插入位點為多克隆位點，具有ID No. 1所示的核苷酸序列。
4.權利要求1 3任一所述的GS-DHFR雙基因篩選表達載的構建方法，骨架載體為 pOpti VEC，所述外源基因插入位點的核苷酸序列插入到所述pOpti VEC的IRES序列上游， 所述谷氨酰胺合成酶基因插入在POpti VEC的Pvu II位點，所述谷氨酰胺合成酶基因上游帶有SV40啟動子，下游為SV40polyA信號序列。
5.權利要求1 3任一所述GS-DHFR雙基因篩選表達載體的應用，其步驟為在所述外源基因插入位點插入目的外源基因，然后轉入宿主細胞得到轉化細胞；在缺乏谷氨酰胺的培養基中添加葉酸類似物氨甲喋呤和谷氨酰胺合成酶的抑制物對轉化細胞進行加壓篩選以獲得高表達細胞系，對獲得的高表達細胞系進行擴大培養，最后分離提取目的外源基因的表達產物。
6.根據權利要求5所述的應用，所述宿主細胞為哺乳動物細胞。
7.根據權利要求6所述的應用，所述哺乳動物細胞為CHODG44細胞。
8.根據權利要求5所述的應用，所述高表達細胞系為培養基中葉酸類似物氨甲喋呤和谷氨酰胺合成酶的抑制物的濃度分別為75uM和200nM的條件下加壓篩選獲得。
9.根據權利要求5所述的應用，所述目的外源基因為人神經生長因子基因，其核苷酸序列如kqlD No. 2所示。
全文摘要
本發明“GS-DHFR雙基因篩選表達載體及其構建方法與應用”，屬于生物技術領域。所述的表達載體主要依次含有多克隆位點、DHFR序列、GS序列。本發明還公開上述表達載體的構建方法和應用，通過該載體可以利用分子克隆技術快速構建攜帶目的基因的GS-DHFR雙基因篩選表達載體，轉染哺乳動物細胞后利用GS-DHFR雙基因篩選和擴增系統，實現目的基因在哺乳動物細胞中的高水平表達。
文檔編號C12N15/63GK102409060SQ20101029217
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月26日 優先權日2010年9月26日
發明者樂偉, 劉荷中, 史權威, 彭璐佳, 葛艷華 申請人:北京華安科創生物技術有限公司