專利名稱：連續發酵生產乳酸鏈球菌素的方法
技術領域：
本發明涉及乳酸鏈球菌素的生產方法，具體是一種連續發酵生產乳酸鏈球菌素的 方法。
背景技術：
乳酸鏈球菌素(Nisin)是從乳酸鏈球菌的一個亞種(Lactococcm hciis)發酵 產物中提制的一種多肽抗菌素類物質，是一種天然生物性食品防腐劑和抗菌劑。早在1928 年，Rogers和Whittier就發現乳酸鏈球菌的代謝產物能夠抑制部分革蘭氏陽性菌的生長。 1944年Mattick和Hirch發現血清學N群中的一些乳酸鏈球菌能產生蛋白類抑菌物質，命 名為N-Inhibitory substance, ( N群抑菌物質，簡稱為Nisin)。1951年，Hirsh等人應 用Nisin到食品保藏中，成功的抑制了由產氣梭狀芽孢桿菌引起的奶酪腐敗，極大改善了 奶酪的品質。1953年由英國的阿普林和巴雷特公司首次以商品的形式出售了這種新的防腐 劑一乳酸鏈球菌素。1969年，FA0/WH0食品添加劑聯合專家委員會(JECFA)批準Nisin作 為一種生物型防腐劑應用于食品工業。1988年美國食品和藥物管理局(FDA)也正式批準 將Nisin應用于食品中。我國在GB2760— 2007中批準Nisin可用于罐藏食品、植物蛋白食 品、乳制品、肉制品中。迄今為止，Nisin已在全世界約60多個國家和地區被用作防腐劑。乳酸鏈球菌素的產業化研究已經具有幾十年的歷史，在我國的工業化研究始于上 世紀九十年代末，至2004年之后形成比較成熟的工業化生產技術。乳酸鏈球菌素的生產菌 種是一種兼性厭氧菌，乳酸鏈球菌素是乳酸鏈球菌的一種初級代謝產物，常采用分批發酵 的方式進行工業化生產，發酵周期在20至32小時之間。發酵的前期，12小時之前主要是菌 種的增值期，在此階段生物量大量增加，但合成乳酸鏈球菌素的量很少，一般在1000IU/ml 至3000IU/ml之間，12小時之后乳酸鏈球菌素的合成速度迅速增加，到20小時時達到高峰， 一般到20小時后碳源濃度下降到臨界值以下，乳酸鏈球菌素的生物合成速度下降，應及時 終止發酵。因此，分批發酵的最大劣勢就是大量的操作時間處于非最優經濟階段，造成生產 成本上升、設備利用率降低，頻繁的滅菌、降溫過程對能源的供應提出更多的挑戰。
發明內容
正是針對上述缺陷，本發明人經過長期的研究和實驗，創造出本發明的技術方案 一種連續發酵生產乳酸鏈球菌素的方法，該方法充分利用連續發酵的優點降低非最優經濟 階段的占有時間，提高設備利用率，優化工廠能源供應條件，從而達到提高產量，降低產品 生產成本之目的。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一種連續發酵生產乳酸鏈球菌素的 方法，是將乳酸鏈球菌經一級種子、二級種子培養后轉移到無菌發酵培養基中，控制發酵過 程中的溫度、PH，當菌濃度達到一定量后乳酸鏈球菌素的生物合成被啟動，然后不斷地從發 酵罐中放出發酵液，同時不斷的往發酵罐中補充配置好的無菌補料培養基，連續生產工藝 可進行7天至15天。
本發明的連續發酵生產乳酸鏈球菌素的具體步驟如下
(1)一級種子培養
首先將培養好的乳酸鏈球菌菌種液接種到滅過菌的種子培養基中，在28至33°C培養， 培養時間為16至32小時；
(2)二級種子培養
一級種子培養結束后轉移至無菌的二級種子培養基中，在28至33°C培養，培養時間為 8至16小時；
(3)發酵培養基滅菌
一定配比的發酵培養基經120°C，30min滅菌后，pH為6. 5至7. 5，用循環水冷卻至28 至 33 0C ；
(4)發酵
將二級種子轉移至發酵罐中，控制發酵溫度28至33°C，pH 6. 5至7. 5，同時每隔2至4 小時測定菌濃度、碳源含量；
(5)補料培養基滅菌
一定配比的補料培養基經120°C，30min滅菌后，pH 6. 5至7. 5，用循環水冷卻至28至 33 0C ；
(6)放料、補料
發酵罐經16至20小時發酵后，測定菌濃度、碳源含量、乳酸鏈球菌素含量，當乳酸鏈球 菌素含量達到控制標準后，從發酵罐中放出發酵液，同時往發酵罐中補充經過滅菌的補料 培養基，并檢測菌濃度、糖含量、乳酸鏈球菌素含量、PH，以便控制放料速度和補料速度。在本發明中，使用的菌種是乳酸鏈球菌的一個亞種，一級種子罐接種量0. 1%至 2%，菌種濃度為2X IO8至IOltlCFU/毫升。從一級種子到二級種子的接種量為2%至10%，二 級種子到發酵罐的接種量為5%至15%。所述的發酵培養基的碳源種類為葡萄糖和蔗糖的組合物，兩種碳源比例為1 :0. 5 至1 :3 ；總碳源濃度為10克/升至30克/升。所述發酵培養基中氮源種類為酵母提取物、 牛肉提取物、魚粉蛋白水解物、玉米提取蛋白質的水解物的一種或其兩種以上的組合物，總 氮源濃度為5克/升至25克/升，所用磷酸鹽為磷酸氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀的一種 或其組合物，總用量5克/升至40克/升，經120°C，30min滅菌后，pH為6. 5至7. 5，冷卻 至 28 至 33°C。所述的補料培養基中含有鎂、鈣、鉀等無機元素的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽，使用量 分別為0. 01克/升至20克/升，碳源種類為葡萄糖、蔗糖，總碳源濃度為10克/升至30 克/升；補料培養基中氮源種類為酵母提取物、牛肉提取物、魚粉蛋白水解物、玉米提取蛋 白質的水解物的一種或其兩種以上的組合物，總氮源濃度為1%至2%，補料培養基中添加B 組水溶性維生素的復合物，包括B2、B6, B12,使用量0. 05克/升至0. 5克/升；此培養基經 120°C，30min滅菌后，pH 6. 5至7. 5，用循環水冷卻至28至33°C。所述的放料時乳酸鏈球菌素濃度標準為7000IU/ml至12000IU/ml，生物含量達到 0. 5至10克/升，生物含量的測定采用吸光度法間接測定。用5%至15%氫氧化鈉或氫氧化 鉀水溶液和1%至2%磷酸鹽溶液的一種或兩種組合物調節發酵pH為6. 5至7. 5，所述放料 和補料方式是連續同時進行或者間歇進行。
本發明的牛產過稈具體描沭如下
所用菌種為乳酸鏈球菌的一個亞種(Lactococcus lactis subsp. Iactis ATCC 11454)，菌種經冷凍管、斜面、搖瓶三個步驟獲得菌種濃度為2X IO8至IOltlCFU/毫升的搖 瓶種液，采用壓差接種法接種到事先經滅菌的的一級種子培養基中，總接種量占種液體積 的0. 1%至2%，搖瓶種液菌種濃度和接種量是關鍵方面，較低的菌種濃度反映菌種的活性較 低，較低的接種量會延長一級種子罐培養時間會降低發酵罐乳酸鏈球菌的產量。一級種子 罐在特定的培養條件下(培養溫度28至33°C，pH=6. 5至7. 5)厭氧培養16至32小時，轉移 至無菌的二級種子培養基中，接種量2%至10%，在特定的培養條件下(培養溫度28至33°C， pH=6. 5至7. 5)厭氧培養8至16小時，然后轉移至無菌的發酵培養基中，接種量5%至15%。 發酵培養基的碳源種類為葡萄糖和蔗糖的組合物，兩種碳源比例為1 :0.5至1 :3。總碳源濃 度為10克/升至30克/升。氮源種類為酵母提取物、牛肉提取物、魚粉蛋白水解物、玉米 提取蛋白質的水解物的一種或其兩種以上的組合物，總氮源濃度為5克/升至25克/升， 采用氫氧化鈉、氫氧化鉀或磷酸鹽調PH6. 5至7. 5。發酵培養基滅菌條件為120°C、30分鐘。 種子轉移至發酵培養基后，控制溫度28至33°C，發酵的前8至16小時主要是菌種的生長 階段，在此階段的碳源(蔗糖、葡萄糖)依靠微生物復雜的生物代謝機制被氧化為乳酸，造成 PH的降低，需采用氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、磷酸鹽等堿性溶液調整pH維持在6. 5至 7. 5，可采用在線pH測定和PID控制方法保持pH在較小的范圍內波動。在此階段每隔四小 時測定碳源含量、微生物量和乳酸鏈球菌素含量。當發酵進行到8至16小時時碳源含將降 低到5%至10%，此時發酵液中微生物的濃度達到最大值，生長速率趨于平穩，乳酸鏈球菌素 含量達到最大值。然后采用壓力的方法或泵的方法從發酵罐中放出發酵液，放出發酵液的 量可采取連續的不斷的放料方法或間歇少量多次的方法，同時向發酵罐中補充同樣量的補 料培養基，在此階段不斷地測定發酵液中碳源的含量、微生物濃度和乳酸鏈球菌素的含量。 如此，發酵時間可進行7天至15天的時間。所用的補料培養基的配方是特定的，碳源種類 為葡萄糖和蔗糖的組合物或其中的一種，總碳源濃度為10升/克至30升/克，氮源種類為 酵母提取物、牛肉提取物、魚粉蛋白水解物、玉米提取蛋白質的水解物的一種或其兩種以上 的組合物，總氮源濃度為10克/升至20克/升。中含有鎂、鈣、鉀等無機元素的鹽酸鹽、硫 酸鹽、磷酸鹽，使用量0. 01克/升至20克/升，添加B組水溶性維生素的復合物，包括B2、 B6、B12使用量0.5克/升至5克/升。培養基滅菌條件為120°C、30分鐘。發酵過程中發 現菌含量和乳酸鏈球菌素的產率具有良好的相關性，當由于條件的波動造成乳酸鏈球菌素 的比生產速率降低時應及時降低放料速度和補料速度，以延長維持時間。當發酵進行到15 天以上時會發現菌種衰退，表現為菌體的形態變化，應及時終止補料，停止發酵。本發明相比現有技術最突出的優點在于可維持發酵周期7天至15天的時間，有 效減少發酵過程中的非最優經濟階段，進而達到提高發酵產量，提高設備利用率，降低產品 生產成本之目的。
圖1為本發明的生產工藝流程圖。
6
圖2為各成分含量隨發酵時間的代謝曲線圖。
具體實施例方式本發明以下結合實施例(附圖)做進一步描述 實施例1
一、 一級種子制備
一級種子罐200升，裝料量150升，按照如下配比制備種子培養基
葡萄糖10克/升，
蔗糖10克/升，
酵母抽提物7克/升，
磷酸氫二鉀12克/升，
玉米漿5克/升，
硫酸鎂0. 2克/升
5%氫氧化鈉溶液調pH7. 2，
滅菌120°C、30分鐘，降溫至32°C，壓差接種種液2升，無菌空氣保持壓力0. 2MPa,培 養16小時。二、 二級種子制備
二級種子罐2000升，裝料量1500升，按照如下配比制備種子培養基
葡萄糖10克/升， 蔗糖10克/升， 酵母抽提物7克/升， 玉米漿5克/升， 磷酸氫二鉀12克/升， 硫酸鎂0. 2克/升
5%氫氧化鈉溶液調pH7. 2，滅菌120°C、30分鐘，降溫至32°C，將一級種子無菌移入， 無菌空氣保持壓力0. 2MPa,培養10小時。三、 發酵培養基制備及發酵
發酵罐30000升，裝料量22000升，按照如下配比制備培養基
葡萄糖10克/升
蔗糖20克/升，
酵母抽提物8克/升，
玉米漿5克/升，
磷酸氫二鉀18克/升，
10%氫氧化鈉溶液調pH7. 2，滅菌120°C、30分鐘，降溫至32°C，將二級種子無菌移入， 無菌空氣保持壓力0. 2MPa,開始發酵，每隔4小時取樣測定pH、碳源含量、微生物含量(吸光 度法)、乳酸鏈球菌素含量(HPLC法)。四、 補料培養基制備 按照如下配比制備培養基葡萄糖10克/升，
蔗糖15克/升，
酵母抽提物8克/升，
磷酸氫二鉀12克/升，
玉米漿5克/升，
硫酸鎂，0.2克/升，
復合維生素B (B6、B12、B2) 1. 5克/升，
10%氫氧化鈉溶液調pH7. 2，滅菌120°C、30分鐘，降溫至32°C備用。五、 放料和補料
發酵進行到20小時開始提高發酵罐壓力，同時打開出料閥門控制800升/小時至1200 升/小時速度放料，同時提高補料罐壓力，保持發酵罐的進出料平衡，同時啟動發酵罐攪拌 電機，保證混合均勻，過程中每隔4小時取樣測定pH、碳源含量、微生物含量(吸光度法)、乳 酸鏈球菌素含量(HPLC法)。共進行168小時，獲得發酵液135000升，乳酸鏈球菌素平均產 量為8020IU/毫升。總產量比分批發酵提高提高產量53%。當然，還可以選擇其他補料、放料方式進行，比如每次放料30%左右，然后補料 30%,由于工藝方法基本相同，故不重述。 實施例2
一、一級種子制備
一級種子罐200升，裝料量150升，按照如下配比制備種子培養基
蔗糖10克/升，
葡萄糖5克/升
酵母抽提物5克/升，
玉米漿5克/升，
硫酸鎂0. 2克/升
磷酸氫二鉀15克/升
5%氫氧化鉀溶液調pH7. 0，
滅菌120°C、30分鐘，降溫至32°C，壓差接種種液2升，無菌空氣保持壓力0. 2MPa,培 養24小時。二、 二級種子制備
二級種子罐2000升，裝料量1500升，按照如下配比制備種子培養基
蔗糖10克/升， 葡萄糖5克/升 酵母提取物5.0克/升， 玉米漿5.0克/升， 磷酸氫二鉀15克/升 硫酸鎂0. 2克/升
5%氫氧化鉀溶液調pH7. 0,滅菌120°C、30分鐘，降溫至32°C，將一級種子無菌移入， 無菌空氣保持壓力0. 2MPa,培養12小時。
三、 發酵培養基制備及發酵
發酵罐30000升，裝料量22000升，按照如下配比制備培養基
蔗糖25克/升，
牛肉提取物5克/升，
魚粉蛋白水解物1克/升
玉米漿4.0克/升，
磷酸二氫鉀20克/升，
2%磷酸鹽溶液調pH7. 0,滅菌120°C、30分鐘，降溫至32°C，將二級種子無菌移入，無 菌空氣保持壓力0. 2MPa,開始發酵，每隔4小時取樣測定pH、碳源含量、微生物含量(吸光度 法)、乳酸鏈球菌素含量(HPLC法)。四、 補料培養基制備 按照如下配比制備培養基 蔗糖20. 0克/升，
牛肉提取物3.0克/升
魚粉蛋白水解物1克/升，
玉米漿3.0克/升，
磷酸鎂，0.2克/升，
磷酸二氫鉀15克/升，
復合維生素B (B1、B6、B12、B2) 1.0克/升，
2%磷酸鹽溶液調pH7. 0，滅菌120°C、30分鐘，降溫至32°C備用。五、 放料和補料過程同實施例1.。共進行240小時，獲得發酵液198000升，乳酸鏈球菌素平均產量為7500IU/毫升。 總產量比分批發酵提高提高產量54. 6%。
權利要求
一種連續發酵生產乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于乳酸鏈球菌經一級種子、二級種子培養后轉移到無菌發酵培養基中，控制發酵過程中的溫度、pH，當菌濃度達到一定量后乳酸鏈球菌素的生物合成被啟動，然后不斷地從發酵罐中放出發酵液，同時不斷的往發酵罐中補充配置好的無菌補料培養基，連續生產工藝可進行7天至15天的時間。
2.根據權利要求1所述的連續發酵生產乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于連續發酵 生產乳酸鏈球菌素的具體步驟如下(1)一級種子培養首先將培養好的乳酸鏈球菌菌種液接種到滅過菌的種子培養基中，在28至33°C培養， 培養時間為16至32小時；(2)二級種子培養一級種子培養結束后轉移至無菌的二級種子培養基中，在28至33°C培養，培養時間為 8至16小時；(3)發酵培養基滅菌一定配比的發酵培養基經120°C，30min滅菌后，pH為6. 5至7. 5，冷卻至28至33°C ；(4)發酵將二級種子轉移至發酵罐中，控制發酵溫度28至33°C，pH 6. 5至7. 5，同時每隔2至4 小時測定菌濃度、碳源、PH含量；(5)補料培養基滅菌一定配比的補料培養基經120°C，30min滅菌后，pH 6. 5至7. 5，冷卻至28至33°C ；(6)放料、補料發酵罐經16至20小時發酵后，測定菌濃度、碳源含量、乳酸鏈球菌素含量，當乳酸鏈球 菌素含量達到控制標準后，從發酵罐中放出發酵液，同時往發酵罐中補充經過滅菌的補料 培養基，并檢測菌濃度、碳源含量、乳酸鏈球菌素含量、PH，以便控制放料速度和補料速度。
3.根據權利要求1所述的連續發酵生產乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于使用的菌 種是乳酸鏈球菌的一個亞種，一級種子罐接種量0. 1%至2%，菌種濃度為2 X IO8至IOltlCFU/ 毫升。
4.根據權利要求1所述的連續發酵生產乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于從一級種 子到二級種子的接種量為2%至10%，二級種子到發酵罐的接種量為5%至15%。
5.根據權利要求1所述的連續發酵生產乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于所述的發 酵培養基的碳源種類為葡萄糖和蔗糖的組合物，兩種碳源比例為1 :0. 5至1 :3 ；總碳源濃 度為10克/升至30克/升；所述發酵培養基中氮源種類為酵母提取物、牛肉提取物、魚粉 蛋白水解物、玉米提取蛋白質的水解物的一種或其兩種以上的組合物，總氮源濃度為5克/ 升至25克/升，所用磷酸鹽為磷酸氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀的一種或其組合物，總用 量5克/升至40克/升，經120°C，30min滅菌后，pH為6. 5至7. 5，冷卻至28至33°C。
6.根據權利要求1所述的連續發酵生產乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于所述的補 料培養基中含有鎂、鈣、鉀等無機元素的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽，使用量分別為0.01克/升 至20克/升，碳源種類為葡萄糖和蔗糖的組合物或其中的一種，總碳源濃度為10克/升至 30克/升；補料培養基中氮源種類為酵母提取物、牛肉提取物、魚粉蛋白水解物、玉米提取 蛋白質的水解物的一種或其兩種以上的組合物，總氮源濃度為10克/升至20克/升，補料培養基中添加B組水溶性維生素的復合物，包括B2、B6, B12,使用量0. 5克/升至5克/升； 此培養基經120°C，30min滅菌后，pH 6. 5至7. 5，冷卻至28至33"C。
7.根據權利要求1所述的連續發酵生產乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于所述的放 料時乳酸鏈球菌素濃度標準為7000IU/ml— 12000IU/ml，生物含量達到5克/升至10克/ 升，用5%至15%氫氧化鈉水溶液和1%至2%磷酸鹽溶液的一種或兩種組合物調節發酵pH 為6. 5至7. 5，所述放料和補料方式是連續同時進行或者間歇進行。
8.根據權利要求1、5、6所述的連續發酵生產乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于所述 的冷卻方式為用循環水冷卻。
9.根據權利要求7所述的連續發酵生產乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于生物含量 的測定采用吸光度法間接測定。
全文摘要
一種連續發酵生產乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于乳酸鏈球菌經一級種子、二級種子培養后轉移到無菌發酵培養基中，控制發酵過程中的溫度、pH，當菌濃度達到一定量后乳酸鏈球菌素的生物合成被啟動，然后不斷地從發酵罐中放出發酵液，同時不斷的往發酵罐中補充配置好的無菌補料培養基，連續生產工藝可進行7天至15天時間。本發明采用乳酸鏈球菌的一個亞種(Lactococcuslactis)經兩級種子培養，以特定的發酵培養基配方，通過控制向生物反應器中的補料速度、pH、菌濃度并連續或間歇的放出含有乳酸鏈球菌素的的發酵液生產乳酸鏈球菌素。該方法可有效減少發酵過程中的非最優經濟階段，達到了提高發酵產量，提高設備利用率，降低產品生產成本的目的。
文檔編號C12P21/02GK101948893SQ201010292078
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月27日 優先權日2010年9月27日
發明者周樹青, 孫遠功, 林永剛, 高巧玲, 魯來政 申請人:鄭州奇泓生物科技有限公司