專利名稱：一種突變型載體pEGFP-N1m的構建方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及一種商業化質粒PEGFP-Nl被改造為一種突變 型載體pEGFP-Nlm的方法及其應用。
背景技術：
參錄fe—力胃θ (Green Fluorescent Protein, GFP) ΜΨ^^ Aequorea victoria 的水母體內產生的一種能夠發出綠色熒光的蛋白質。GFP是一種由238個氨基酸(分子量約 27KDa)組成的發光蛋白質——aequorin，在藍色波長范圍的光線激發下會發出綠色熒光； GFP是典型的β桶形結構，包含β折疊和α螺旋，將熒光基團包含在其中，嚴密的桶形結 構保護著熒光基團，防止它被周圍環境淬滅，內部面向桶形的側鏈誘導Ser65-Tyr66-Gly67 三肽環化，導致熒光基團形成(詳見參考文獻Zimmer M. Chem. Soc. Rev.，2009，38， 2823-32)。由于GFP與其他蛋白形成的融合蛋白幾乎不會影響其原本的蛋白活性或流動 性，也幾乎不會產生細胞毒性，故在細胞生物學與分子生物學研究中，GFP作為一種重要的 報告基因(importer gene)被廣泛應用。在應用上，能夠使GFP與目的基因發生基因重組， 波長約490nm的紫外線激發下，用顯微鏡觀察綠色熒光的分布，因而可用于標記活體生物 樣品。盡管野生型GFP能夠發出絢麗的熒光，但它還是有不少缺點，比如有兩個激發峰、 光穩定性不好、在37°C時不能正確地折疊等等。1996年Remington小組最先在Science雜 志上發表了 GFP的S65T突變體晶體結構后，人們更好地了解到GFP發光基團的組成以及與 周圍殘基的相互作用等。研究人員通過定點或隨機突變，不斷地改造這些殘基，得到了我們 今天使用的GFP衍生物。華裔科學家錢永健(Roger Y Tsien)于1994年開始改造GFP，并在 1995年完成了 GFP單點突變(S65T)。這個突變顯著提高了 GFP的光譜性質，且熒光強度和 光穩定性也大大增強。突變后的GFP激發波長轉移至488nm，而發射峰仍保持在509nm，這和 常用的FITC濾光片匹配，提高了 GFP的應用潛力。而F64L點突變則改善了 GFP在37°C的 折疊能力，這樣產生了增強型 GFP (Enhanced Green Fluorecence Protein, EGFP)，也就是 現在科研上所常用的EGFP。EGFP是一種優化的突變型綠色熒光蛋白，其熒光比野生型的強 35倍，大大增強了其報告基因的敏感度，同時具有結構穩定、高效表達、無種系依賴性等特 點，更適用于細胞基因表達和蛋白定位檢測及細胞示蹤標記。因此，EGFP在研究中常作為一 種重要的報告基因被應用詳見參考文獻1) Zimmer M. Chem. Soc. Rev.，2009，38，2823-32 ； 2)Phillips GJ. FEMS Microbiol Lett，2001，204，9-18。pEGFP-m載體(質粒圖譜見圖1)是一種商業化的真核細胞表達載體，攜帶有 EGFP蛋白的表達基因，可融合于目的蛋白的N端，穩定、高效地在多種異源生物中表達且無 細胞毒性，在生物醫學研究中常作為一種重要的研究工具被使用。在實際應用中，通常將 PEGFP-Nl載體與目的基因進行重組連接，構建重組表達質粒、轉染細胞、表達融合蛋白，然 后觀察細胞是否表達綠色熒光蛋白、以及確定該融合蛋白的亞細胞定位。然而，在實際應用過程中，由于融合蛋白表達序列中的第二個翻譯起始位點ATG在EGFP表達序列上的存在，有可能會在融合蛋白得到表達的同時，會另外表達出一個單 獨的EGFP蛋白，這種情況在文獻報道中已經屢見不鮮(詳見參考文獻Jackson RJ, et al.NAT REV MOL CELL BIO.，2010，11，113-27)。例如，FGF-2 基因能夠表達出一種分子量 大小約為ISkDa的、特異性地定位于細胞核仁中的纖維原細胞生長因子；當FGF-2基因的開 放閱讀框(open read frame, 0RF)被重組克隆到pEGFP-Nl載體上之后，研究其亞細胞的定 位情況時，除了如預期的在細胞核中表達融合蛋白外，還可以在細胞質中觀察到額外表達 較弱的綠色熒光蛋白GFP ；這些結果通過蛋白表達檢測和共聚焦顯微鏡觀察均可以得到證 實，這明顯地影響了目的蛋白亞細胞定位實驗結果的準確性(詳見參考文獻Sheng J，et al. J. Biol. Chem.，2004，279，40153-60)。又如，SARS_CoV3a 蛋白是存在于 SARS 病毒內的 一種獨特蛋白，其大小為28kDa，主要定位于細胞質的高爾基體；當CoV3a蛋白的ORF被重 組克隆到pEGFP-Nl載體之后，同樣在細胞中其他部位也表達了額外的綠色熒光蛋白GFP， 這些都影響了實驗結果的準確性(詳見參考文獻Yuan X，et al. Virus Res.，2005，109， 191-202)。此外，本室于2007年發表的相關研究結果表明對于一種成熟肽只有23aa的鉀 通道蝎毒素Bmkk2而言，當其表達序列被克隆到pEGFP-m載體之后，很難得到融合蛋白；而 將EGFP蛋白的翻譯起始位點ATG突變后，則能夠明顯地提高融合蛋白的表達量(詳見參考 文獻Dai C, et al. CELL. M0L. BIOL. LETT.，2007，12，362-9)。這些實驗證據充分說明，當 我們將能夠表達分子量接近或小于EGFP蛋白的ORF克隆進入pEGFP-Nl質粒后，由于“滲漏 掃描”和“翻譯重起始”現象的存在詳細的分子機制參見文獻l)Poyry，ΤΑ, et al. Genes Dev.，2004，18,62-75 ；2)Jackson RJ,et al. NAT REV MOL CELL BIO.，2010，11，113-27 ；3) Kozak Μ. Gene, 2002，299，1-34],當第二個翻譯起始位點ATG與前一個翻譯起始位點的距離 越為接近，就越容易使得核糖體從第二個ATG開始翻譯；而當上游開放閱讀框較長或是上 游開放閱讀框含有穩定的RNA 二級結構時，重掃描和翻譯重起始發生的可能性會明顯地減 少。因此，為了改善pEGFP-Nl質粒在被克隆進入較短的ORF后可能表達額外的EGFP 蛋白而影響融合蛋白的亞細胞定位結果或影響融合蛋白的表達量這一缺陷，本發明通過定 點突變研究手段，將pEGFP-Nl質粒上EGFP蛋白表達序列的Kozak序列進行了突變(采 用定點突變方式，將pEGFP-Nl質粒中EGFP翻譯起始位點的Kozak序列CCACCATGG突變 為CCtCCcTGt)，得到了一種突變型載體pEGFP-Nlm。將該突變型載體與現有的商業化載體 PEGFP-Nl結合使用，可以明顯改善pEGFP-Nl載體在使用過程中的上述缺陷，提高了分子量 接近或小于EGFP的蛋白多肽在亞細胞定位實驗結果的準確性，以及提高融合蛋白的表達 效率。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種突變型載體pEGFP-Nlm的構建方法及 其應用。本發明中所涉及的突變型載體pEGFP-Nlm，結合pEGFP-Nl —起應用，能夠顯著提高 分子量接近或小于EGFP的蛋白多肽在亞細胞定位實驗結果的準確性，以及提高融合蛋白 的表達效率。本發明所提供的突變型載體pEGFP-Nlm的構建方法，包括如下步驟1)引物設計采用的上游引物序列為5’
-GGATCCACCGGTCGCCTCCCTGTTGAGCAAGG GCGAGG-3，，下游引物序列為5，-CCTCGCCCTTGCTCAACAGGGAGGCGACCGGTGGATCC-3，；2) PCR定點突變以pEGFP-Nl質粒為模板，進行PCR反應；3)回收PCR反應產物，常規方法進行酶切、連接和轉化；4)陽性克隆篩選以及測序鑒定，完成突變型載體pEGFP-Nlm的構建。本發明選取分子量大于、等于或小于EGFP的、亞細胞定位已知的蛋白多肽的表達 序列，分別將這些表達序列克隆進入pEGFP-Nl和pEGFP-Nlm，構建相應的表達載體；通過 Western blot分析和共聚焦顯微鏡觀察方法，證實突變型載體pEGFP-Nlm可以顯著提高分 子量約等于或小于EGFP的蛋白多肽的亞細胞定位結果的準確性以及提高融合蛋白的表達 效率。本發明中所得到的突變型載體pEGFP-Nlm，具有明顯改善分子量約等于或小于 EGFP蛋白的多肽分子在亞細胞定位結果的準確性，為該商業質粒的進一步開發應用提供了 重要的實驗數據。
圖1 pEGFP-Nl載體的模式圖(引自Clontech公司技術手冊)。圖2本發明中pEGFP-Nl載體上EGFP蛋白表達序列中Kozak序列的突變策略，即 將原Kozak序列CCACCATGG(圖1中的674-682位核苷酸序列)突變為CCtCCcTGt。圖3利用pEGFP-Nl和pEGFP-Nlm構建的多種表達質粒的酶切鑒定圖譜。泳道1和 5 =DNA marker ；泳道 2 :KRAB-EGFP_N1 ；泳道 3 和 4 =KRAB-EGFP-Nlm ；泳道 6 =Tat-EGFP-Nl ； 泳道 7 :Tat-EGFP-mm。圖4 PK-EGFP融合蛋白的Western blot檢測圖譜。
圖5 PK-EGFP融合蛋白的共聚焦顯微鏡觀測。圖6融合蛋白KRAB-EGFP的Western blot檢測圖譜。圖7融合蛋白KRAB-EGFP的共聚焦顯微鏡觀察。圖8融合蛋白EGFP-Tat的共聚焦顯微鏡觀察。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明具體應用方法。下列實施例中未注明具 體實驗條件的實驗方法，按照常規實驗條件，如Sambrook等編，《分子克隆實驗室手冊》 (New York Co Id Spring Harbor laboratory Press, 2002)中所述的實驗條件，或按照制 造廠商所建議的實驗條件。實施例1 突變型載體pEGFP-Nlm的構建將pEGFP-Nl載體中EGFP核苷酸表達序列的翻譯起始位點ATG及其附近的Kozak 序列采用PCR定點突變技術進行突變(如圖2)，使其不能得到表達；只有當插入帶有翻譯 起始位點ATG及Kozak序列的外源基因片段之后才會高效地表達出“靶基因-EGFP融合蛋白”。一、構建突變型載體pEGFP-Nlm的引物設計與合成采用引物設計軟件Primer Premier 5. O進行突變引物設計，上游引物序列為
55’ -GGATCCACCGGTCGCCTCCCTGTTGAGCAAGGGCGAGG-3’,下游引物序列為5，-CCTCGCCCTTGCTC AACAGGGAGGCGACCGGTGGATCC-3’ (下劃線所標注的序列即為定點突變的序列)。本發明中所用到的引物核苷酸序列均由深圳華大基因公司合成。二、PCR定點突變以本室保存的pEGFP-Nl質粒(由本室購自Clontech公司)為模板，采用PCR定 點突變方法(采用上述引物)進行突變。構建如下PCR反應體系pEGFP-Nl 質粒(0. 2 μ g/μ 1) 1 μ 1 ；MgSO4 (25mmol/L) 1 μ 1 ；dNTP(dGTP、dATP、 dTTP、dCTP 各 5mmol/L) 1 μ 1 ；國產 K0D+DNA 聚合酶0. 5 μ 1 ； IOX K0D+DNA 聚合酶緩沖 液2. 5μ 1 ；上游引物(10ymol/L) 0. 25 μ 1 ；下游引物(10ymol/L) 0. 25 μ 1 ；無菌雙蒸 水18. 5 μ 1，反應體積為25 μ 1。PCR 反應循環為95°C IOmin ;(95°C 30s，58°C 30s，68°C 30s ；35 cycles) ；68°C 5min ； 16 °C 24h。用北京博大泰克生物基因技術有限責任公司的DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行 回收PCR產物，詳細的操作方法參照試劑盒說明。三、PCR產物和pEGFP-Nl質粒酶切、片段連接和轉化按照常規分子克隆的方法，利用相應的限制性內切酶對于上述PCR產物和 PEGFP-Nl質粒進行酶切、產物回收和連接反應，轉化感受態大腸桿菌。四、陽性克隆篩選及測序驗證挑取陽性克隆，進行后續的質粒提取、酶切反應和PCR反應鑒定，最后送交測序公 司進行測序驗證。將已鑒定好的質粒送交華大基因生物公司測序，經過序列比對，證明突變 位點的質粒是正確的，即突變型載體pEGFP-Nlm構建成功。實施例2 不同分子量大小的融合蛋白表達載體的構建為了比較分析pEGFP-Nl和pEGFP_Nlm載體克隆進入不同大小的蛋白多肽表達序 列后，對于融合蛋白的表達效率和定位結果的影響，首先根據文獻報道，挑選不同大小的、 且其亞細胞定位已知的多肽表達核苷酸序列，分別克隆連接到質粒pEGFP-Nl和pEGFP-Nlm 的EGFP表達序列的上游，構建成不同的表達質粒。由于實驗需要，需選取大小不同的蛋白，同時需要這些蛋白符合亞細胞結構定位 已知，且定位精確，能滿足處于且僅處于細胞核內、細胞質內、特定細胞器內或細胞內生物 膜上的條件。在NCBI蛋白數據庫中，注解部分有包括蛋白亞細胞結構定位及蛋白已知功能 在內的信息。運用生物信息學的方法，在Linux系統下用Perl高級程序語言可以編寫相應 的搜索程序，實現全面、有效且快速蛋白數據庫搜索，發現符合特定條件的基因。一、丙酮酸激酶基因丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)，其生物化學縮寫式為三磷酸腺苷丙酮 酸-2-0-磷酸轉移酶，其基因長度為12142bp，能夠編碼包含574aa (分子量約62KDa，其大 于約26KDa的EGFP的分子量)長度的蛋白。在無氧條件下，葡萄糖進行分解，形成2分子 丙酮酸并提供能量，這一過程稱為糖酵解作用；在此過程中，PK是催化形成第二個ATP反應 的酶(Liapounova，N. A. et al. , Eukaryot Cell, 2006，5，2138—46)。利用常規的分子生物學方法，將PK蛋白的表達序列分別克隆進入pEGFP-m和 pEGFP-Nlm的EGFP表達序列的上游，然后轉染HeLa細胞，檢測其表達情況。
二、ZNF268鋅指蛋白的KRAB結構功能域KRAB/C2H2型鋅指蛋白均含有一個保守的KRAB功能結構域。ZNF268是一種典 型的KRAB/C2H2型鋅指蛋白，含有一個74aa的KRAB結構域(參見文獻Gou，D. Μ.，et al. Biochimica et Biophysica Acta. 2001，1518，306-10)。我們的前期實驗結果表明單 獨表達的ZNF268鋅指蛋白的KRAB結構域是定位于細胞核中的。為了比較分析pEGFP-Nl和pEGFP_Nlm載體對于融合蛋白的表達量和亞細胞定位 結果準確性的影響，我們將KRAB多肽的表達序列分別克隆進入pEGFP-Nl和pEGFP-Nlm的 EGFP表達序列的上游，然后轉染HeLa細胞，檢測其表達情況。利用常規的分子生物學方法，將KRAB多肽的表達序列分別克隆進入pEGFP-Nl和 pEGFP-Nlm的EGFP表達序列的上游，然后轉染HeLa細胞，檢測其表達情況。構建成功的表達質粒載體如圖3所示。經測序驗證，表達序列正確無誤，可以用于 下游實驗。三、反式激活轉錄子基因反式激活轉錄子基因來自于I型人類免疫缺陷病毒(HIV-I)，其含義為反式激活 轉錄子(Trans-Activator of Transcription，Tat)。人工培養的感染細胞能夠釋放Tat蛋 白，而HIV-I感染的患者血液中也有發現。由于不同亞種之間的區別，TAT蛋白的大小介于 86-101aa之間。在本實驗中所用的為分子量大小14KDa(其小于約26KDa的EGFP的分子 量)的蛋白。在人類免疫缺陷病毒中，Tat蛋白能夠大幅度增加HIV的單鏈RNA的轉錄。同 時，Tat能夠直接參與到HIV的致病過程之中發揮作用(Ammosova,T. , et al. J Biol Chem, 2005，280，36364-71)。將Tat蛋白的表達序列分別克隆進入pEGFP-Nl和pEGFP-Nlm的EGFP表達序列的 上游，然后轉染HeLa細胞，檢測其表達情況。利用常規的分子生物學方法，將Tat蛋白的表達序列分別克隆進入pEGFP-Nl和 pEGFP-Nlm的EGFP表達序列的上游，然后轉染HeLa細胞，檢測其表達情況。構建成功的表達質粒載體如圖3所示。經測序驗證，表達序列正確無誤，可以用于 下游細胞轉染實驗分析。實施例3 比較分析pEGFP-Nl和pEGFP-Nlm載體以下細胞轉染實驗均在HeLa細胞中進行。HeLa細胞購自中國典型培養物保藏中 心(CCTCC，中國武漢)，由本室按照常規操作方法進行保存。一、二者均可用于分子量大于EGFP的多肽的亞細胞定位丙酮酸激酶蛋白(PK)基因能夠編碼一種分子量約62KDa的蛋白多肽，其分子量 遠遠大于EGFP，定位于細胞質中。當我們利用pEGFP-Nl和pEGFP-Nlm載體對PK-EGFP 融合蛋白在HeLa細胞中進行亞細胞定位實驗驗證時，將PK_EGFP_N1 (unmatation)和 PK-EGFP-Nl (matation)質粒轉染HeLa細胞，通過Western blot分析，由圖4可見， PEGFP-Nl質粒在HeLa細胞中正常定位表達于細胞質中；此外，由于PK蛋白本身的分子量 很大，因此與EGFP形成融合蛋白后，無論是采用pEGFP-Nl載體還是pEGFP-Nlm載體，均不 會在細胞的其它部位表達額外的EGFP蛋白。通過共聚焦分析，由圖5可見，PK蛋白的表達 序列無論是與pEGFP-Nl還是pEGFP-Nlm載體融合，由于PK分子量很大，均不會表達額外的 EGFP蛋白。EGFP 表示對于綠色熒光蛋白EGFP的表達定位；DAPI染核實驗顯示了細胞核所在的位置；Merge 二者的重疊圖譜，顯示PK蛋白完全定位在細胞質中。說明對于分子量較大的蛋白多肽進行定位實驗分析時，pEGFP-m載體是一種非常 好的蛋白多肽亞細胞定位分析的實驗工具。二、pEGFP-Nlm載體比pEGFP_Nl更適合于分子量小于EGFP的蛋白多肽的亞細胞 定位分析文獻報道及本室研究結果表明，當利用pEGFP-Nl載體對于分子量接近或小于 EGFP的蛋白多肽進行亞細胞定位分析時，除了在應有的亞細胞結構中表達出綠色熒光蛋白 外，在其他的地方也有一些模糊的熒光，這影響了定位實驗結果的準確性，這些結果可以用 Western blot得到驗證。因此，我們認為，除了表達目的蛋白-EGFP融合蛋白外，應該還表 達了額外的EGFP蛋白，影響了亞細胞定位結果的準確性。因此改善pEGFP-Nl載體勢在必 行。利用鋅指蛋白ZNF268的KRAB結構域和HIV病毒蛋白Tat作為研究例子，我們比 較分析了 PEGFP-Nl和pEGFP-Nlm載體用于目的蛋白的分子量小于EGFP的蛋白多肽的亞細 胞定位分析。圖6為融合蛋白KRAB-EGFP分別在載體pEGFP_Nl和pEGFP-Nlm中的表達情況檢 測。A圖中泳道1 :EGFP表達對照；泳道2 :KRAB-EGFP在載體pEGFP-Nlm中的表達情況，由 于EGFP蛋白表達序列中的Kozak序列發生了突變，因此不會表達額外的EGFP蛋白。B圖中 泳道3 =EGFP對照；泳道4 :KRAB-EGFP在載體pEGFP-Nl中的表達情況，由于EGFP蛋白表達 序列中的Kozak序列未發生突變，因此該表達質粒除了表達KRAB-EGFP融合蛋白外，還額外 表達了大量的EGFP蛋白，影響了融合蛋白的表達量及其亞細胞定位結果的準確性。圖7利用共聚焦顯微鏡觀察方法，驗證了圖6的結論。上半部分圖顯示分子量小于 EGFP的、且特異定位于細胞核中的多肽序列KRAB的表達序列克隆進入載體pEGFP-附后，除 了表達了大部分融合蛋白外，在細胞質中也表達了許多EGFP蛋白，影響了該蛋白的亞細胞 定位結果的準確性；下圖表示KRAB表達序列克隆進入載體pEGFP-Nlm后，只在細胞核中表 達了大量的融合蛋白，亞細胞定位結果非常好，且融合蛋白的表達效率明顯提高。EGFP 表 示綠色熒光蛋白EGFP表達檢測；DAPI 顯示細胞核所在的位置；merge 表示前面二者的重 疊圖譜。圖8利用共聚焦顯微鏡觀察方法，顯示分子量小于EGFP的、且特異定位于細胞核 中的Tat蛋白與之融合表達時的情況。上圖表示EGFP-Tat融合表達蛋白的序列克隆進入 pEGFP-Nl載體時的表達情況；下圖顯示EGFP-Tat融合表達蛋白的序列克隆進入pEGFP-Nlm 載體時的表達情況。結果表明在突變型載體pEGFP-Nlm中，細胞質中額外的EGFP的相對量 大為減少，可以顯著提高融合蛋白的亞細胞定位結果的準確性以及融合蛋白的表達效率。 EGFP 表示綠色熒光蛋白EGFP表達檢測；DAPI 顯示細胞核所在的位置；merge 表示前面 二者的重疊圖譜。總之，未突變的載體pEGFP-Nl用于KRAB和Tat的定位分析時，除了在細胞核表達 了融合蛋白外(圖7、8)，在其他的部位也表達了額外的EGFP蛋白(圖6、7、8)；而當利用突 變型載體pEGFP-Nlm進行對比實驗時，我們發現額外表達的EGFP蛋白大大減少(圖6)，在 融合蛋白不應該表達的細胞結構中也未發現綠色熒光蛋白(圖7、8)，且融合蛋白的表達效 率也得到較大的提高(圖7、8)。上述結果顯示，當我們利用pEGFP-Nl載體對Tat和鋅指蛋白ZNF268的KRAB結構域進行亞細胞定位分析時，由于它們的分子量小于EGFP，可能由于 “重掃描”和“翻譯重起始”現象的存在，明顯地在細胞中額外表達了 EGFP蛋白，這嚴重地影 響了亞細胞定位結果的準確性；當改用本發明中構建的突變型載體PEGFP-Nlm進行平行實 驗時，可以看到，不僅可以消除額外的EGFP蛋白的表達，而且融合蛋白的表達效率也得到 了極大地提高，這將極大地提高亞細胞定位實驗結果的準確性和可信度。因此，本發明中的 突變型載體pEGFP-Nlm將可以作為商業化載體系統pEGFP的重要補充，在用于分子量接近 或小于EGFP的蛋白多肽的亞細胞定位分析中，可以極大地提高實驗結果的準確性和可信 度。
權利要求
一種突變型載體pEGFP N1m的構建方法 ，其特征在于將pEGFP N1載體中EGFP核苷酸表達序列的翻譯起始位點ATG及其附近的Kozak序列采用PCR定點突變技術進行突變，使其不能得到表達。
2.如權利要求1所述的突變型載體pEGFP-Nlm的構建方法，其特征在于包括如下步驟1)引物設計采用的上游引物序列為5，-GGATCCACCGGTCGCCTCCCTGTTGAGCAAGG GCGAGG-3，，下游引物序列為5，-CCTCGCCCTTGCTCAACAGGGAGGCGACCGGTGGATCC-3，；2)PCR定點突變以pEGFP-Nl質粒為模板，進行PCR反應；3)回收PCR反應產物，常規方法進行酶切、連接和轉化；4)陽性克隆篩選以及測序鑒定，完成突變型載體pEGFP-Nlm的構建。
3.如權利要求2所述的突變型載體pEGFP-Nlm的構建方法，其特征在于步驟2中PCR 反應循環為95°C IOmin ； (95°C 30s, 58°C 30s, 68°C 30s ；35 cycles) ；68°C 5min ； 16 °C 24h。
4.突變型載體pEGFP-Nlm用于分子量接近或小于EGFP的蛋白多肽的亞細胞定位分析。
全文摘要
本發明屬于分子生物學領域，公開了一種突變型載體pEGFP-N1m的構建方法及其應用，本發明方法是利用PCR定點突變技術將商業化載體pEGFP-N1進行改造得到一種突變型載體pEGFP-N1m。比較分析實驗結果表明，利用本發明中構建的突變型載體pEGFP-N1m對分子量接近于或小于EGFP的蛋白多肽進行亞細胞定位分析時，可以消除額外的EGFP蛋白表達對定位實驗結果的干擾，明顯地提高亞細胞定位實驗結果的準確性和可信度，同時還可以提高融合蛋白的表達效率。
文檔編號C12N15/79GK101974554SQ201010291680
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月26日 優先權日2010年9月26日
發明者吳淼, 李文鑫, 汪維, 郭明雄 申請人:武漢大學