專利名稱：一種用于轉基因大豆檢測的兩基因標準質粒分子及其構建的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種分子生物學技術領域的質粒分子，具體來說，涉及一種轉基因大豆檢測用標準質粒分子及其構建方法。
背景技術：
自1996年以來，全球轉基因作物種植面積以年均10%以上的速率增長，2009年全球批準種植的轉基因作物達1.34億公頃，其中轉基因大豆種植面積達到6900萬公頃，占大豆總種植面積的77%。隨著轉基因作物的廣泛種植，其安全性問題引起了全球公眾的普遍重視。歐盟于1998年在世界上簽署第一個法案，要求對轉基因產品進行標簽說明；1999年要求出口到歐盟的非轉基因產品不得含有的轉基因產品污染；2002年，歐盟將標識的最低限量降低到0.9%。隨之，日本、澳大利亞、韓國等國家對轉基因成分的最低含量做了不同的規定，閾值從1-5%不等。我國于2001年5月23日發布了《農業轉基因生物安全管理條例》，2002年1月5日公布了農業轉基因生物安全評價、標識和進口安全管理三個配套管理辦法，確定了第一批實施標識管理的農業轉基因生物目錄，并于2002年3月20日起正式實施。標識制度的實施依賴于轉基因產品檢測技術。目前主要有兩類技術一類是基于核酸方法，如PCR、基因芯片等，另一類是基于蛋白質方法，如ELISA、試紙條等，在這些檢測方法中，PCR方法因具有高靈敏度和特異性強的優點，已成為目前最重要、應用最廣泛的轉基因作物及其產品檢測技術。在進行PCR檢測時，需要設置陽性對照以確保檢測過程的有效性和檢測結果的可靠性，特別是在定量PCR檢測中需要用含量準確的轉基因作物陽性標準品(CRMs)來制作標準曲線。然而，由于轉基因作物存在生物安全性和和現有技術的限制，轉基因作物陽性標準品很難獲得，這種現狀已成為檢測方法和應用的瓶頸。因此亟需研制能夠替代轉基因作物標準物質的新型陽性對照材料，以滿足不斷發展的轉基因檢測需求。標準分子的概念由日本科學家Kuribara等于2002年提出，它是指一種含有轉基因檢測目的外源基因和/或內標準基因的特異性片段的線性化重組質粒分子，研究表明質粒標準分子在GMO鑒定檢測中是很好的標準物質替代物。近年來，國內外眾多學者報道了一些用于轉基因產品檢測的標準質粒分子。標準質粒分子的容量也有一個大的提升，從最初的單一目標基因的質粒分子到多目標基因的質粒分子，這些質粒分子可同時涉及不同物種的轉基因作物的多個基因。
發明內容
本發明一個目的在于提供一種用于轉基因大豆檢測的標準分子對照物及其構建方法，這樣就為解決陽性標準品缺乏問題提供一條有效途徑，有效地保證檢測工作的進行。為實現上述目的，本發明提供一種轉基因大豆檢測用標準質粒分子，其特征在于， 通過特異性PCR引物，從轉基因大豆GTS40-3-2基因組DNA中擴增出大豆內源基因Lectin1特異性序列、外源基因EPSPS基因特異性序列，經過與中間載體的連接、酶切、轉化，將插入這兩個特異性片段依次插入到質粒載體PMDTM19-T Simple中，獲得了標準質粒分子 pTLE20本發明所述標準質粒分子，以替代轉基因大豆品系GTS40-3-2和轉PAT大豆，用于定性和定量PCR檢測。該標準質粒分子同時含有大豆內源基因Lectin和外源基因EPSPS 的一段序列。本發明所述的一種轉基因大豆檢測用標準質粒分子及其構建方法，包括以下步驟(1)利用GenBank數據庫進行生物信息學分析，查找并獲得大豆內源基因Lectin、 轉基因大豆品系GTS-40-3-2外源基因EPSPS的特異性序列；(2)根據Lectin基因序列、EPSPS基因序列利用Primer Premier 5. 0軟件設計 PCR特異性定性引物，分別擴增這兩個基因；(3)分別回收Lectin基因和EPSPS基因的定性PCR產物，將這兩個基因PCR回收產物構建到質粒載體PMDTM19-T Simple上獲得中間質粒分子pMDLEC和pMDEPS ；(4)將中間質粒分子pMDLEC和載體pET30a分別用限制性內切酶Not I和Ml I 進行雙酶切，回收目的基因片段及載體片段，用T4 DNA連接酶連接獲得質粒分子pETLEC ；(5)將中間質粒分子pMDEPS和pETLEC分別用限制性內切酶EcoR I和)(ba I進行雙酶切，回收這兩種酶切產物，用jM DNA連接酶連接獲得質粒分子PETLE2 ；(6)以質粒分子pETLE2為模板，用Lec-Pl和Eps_P2引物擴增獲得Lec-Eps區擴增子序列；(7)將Lec-Eps區擴增產物回收連接到載體pMDTM19_T Simple上獲得質粒分子 pTLE20(8)標準質粒分子PTLE2的定量PCR檢測方法驗證。所述的定量PCR驗證，是指標準質粒分子PTLE2在進行定量PCR分析大豆內源基因Lectin 1和轉基因大豆品系GTS_40_3_2外源基因EPSPS特異性序列的檢測極限、定量極限等特性，以鑒定該標準質粒分子代替陽性標準物質的能力，進而驗證標準質粒分子在轉基因大豆品系GTS-40-3-2樣品實際檢測中的有效性。本發明的有益結果利用酶切、連接、轉化等分子克隆技術構建了含有大豆內源基因Lectin 1以及轉基因大豆大豆品系GTS_40_3_2外源基因EPSPS特異性序列的標準質粒分子PTLE2。此標準質粒分子可以代替陽性標準物質用于轉基因大豆的定量PCR檢測，很好的解決了檢測過程中陽性標注物質缺乏的問題，此標準質粒分子PTLE2在實際檢測中具有特異性好、靈敏度高等優點，應用該標準質粒分子進行實際樣品定量分析時，樣品檢測結果的偏差在國際上廣泛認可的允許范圍內。因此，本發明中構建的標準質粒分子PTLE2完全適用于對轉基因大豆及其加工產品中的轉基因成分含量的定量分析。
圖1為標準質粒分子pTLE2的構建示意圖及測序結果斜體加粗的為PCR引物所在位置，方框內為定量引物和探針所在位置，在兩基因之間引入了四個限制性內切酶Not I, Sal IjEcoR I和Xba I。
具體實施例方式為了更充分的解釋本發明的實施，提供轉基因大豆標準分子對照物的制備實施實例。這些實施實例僅僅是解釋而不是限制分發明的范圍。下列實施例中未標明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件操作。實施例1 標準質粒分子的構建一、實驗材料轉基因大豆品系GTS40-3-2 ；非轉基因大豆品種。二、實驗試劑pMDTM19-T Simple Vector購自大連寶生物工程公司；dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA marker I、II和marker III購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶Not I ,Sal I、EcoR I , Xba I購自NEB北京有限公司；質粒基因組DNA提取及純化采用北京天根生化科技有限公司研制的質粒小量提取試劑盒；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。三、實驗儀器TC-512型PCR擴增儀(英國TECHNE公司)；Geliance 200 DNA電泳凝膠成像儀 (美國PerkinElmer公司)；Nano-Drop ND-1000核酸蛋白儀(美國Nano Drop公司)；離心機；恒溫水浴鍋；培養箱；天平等。四、試驗方法和過程 1、植物基因組DNA提取-SDS法a、稱取0. Ig經粉碎機粉碎的大豆樣品，加入Iml 65°C預熱的2% SDS抽提液， 10 μ 1 RNase-A混勻，于65°C溫育30min，置于室溫后13000r離心lOmin。b、取上清加0. 6倍體積的KAc，冰浴20min后，13000r離心lOmin，取上清加2倍體積預冷無水乙醇，混勻。c、于-20°C靜置30min，13000r離心lOmin，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌，短時間離心后棄上清，重復一次。自然干燥后加200μ1 TE溶沉淀，-20°c保存。d、取2 μ 1提取的DNA樣品，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量。利用核酸儀測定所提取的DNA濃度和純度。2、引物設計在GenBank中搜索大豆內源基因Lectin 1、轉基因大豆品系GTS-40_3_2外源基因EPSPS特異性序列，利用軟件I^rimer 5. 0設計兩對定性PCR引物，分別用于擴增大豆內參基因特異性序列Lectin 1、轉基因大豆品系GTS-40-3-2外源基因EPSPS特異性序列。具體的引物序列見表1。表1構建標準質粒分子的PCR引物序列
權利要求
1.一種用于轉基因大豆檢測的兩基因標準質粒分子及其構建，其特征在于，含有大豆內源基因特異性序列Lectin 1和轉基因大豆品系GTS40-3-2外源基因EPSPS特異性序列。
2.根據權利要求1所述的轉基因大豆檢測用標準質粒分子，其特征是，所述的大豆內源基因Lectin指的是大豆凝集素基因，其在大豆基因組中高度保守，具有種間特異性、種內非特異性和單拷貝數的特點；所述的EPSPS基因是指5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSPS)。
3.根據權利要求1所述的轉基因大豆檢測用標準質粒分子，其中Lectin1和EPSPS標準分子的引物序列如下目標基因引物名稱引物序列(5'-3')產物大小(bp)Lectin 1Lec-PlATAAGAATGCGGCCGCGGCTTGCCTTCTTTCTCLec-P2GCGTCGAC CCCTTCGATCTGTCACATTT530EPSPSEps-PlGGAATTCTTCATGTTCGGCGGTCTCEps-P2GCTCTAGAATCATCGTGGCATCGTCC1199
4. 一種如權利要求1所述的轉基因大豆檢測用標準質粒分子的構建方法，其特征在于，包括以下步驟(1)利用GenBank數據庫進行生物信息學分析，查找并獲得大豆內源基因Lectin1、轉基因大豆品系GTS-40-3-2外源基因EPSPS的特異性序列；(2)根據Lectin1基因序列、EPSPS基因序列利用Primer Premier 5. 0軟件設計PCR 特異性定性引物，分別擴增這兩個基因；(3)分別回收Lectin1基因和EPSPS基因，將這兩個基因PCR回收產物構建到質粒載體pMDTM19-T Simple上獲得中間質粒分子pMDLEC和pMDEPS ；(4)將中間質粒分子pMDLEC和載體pET30a分別用限制性內切酶NotI和Ml I進行雙酶切，回收目的基因片段及載體片段，用T4 DNA連接酶連接獲得質粒分子pETLEC ；(5)將中間質粒分子pMDEPS和pETLEC分別用限制性內切酶EcoRI和)(ba I進行雙酶切，回收這兩種酶切產物，用T4DNA連接酶連接獲得質粒分子PETLE2 ；(6)以質粒分子PETLE2為模板，用Lec-Pl和Eps_P2引物擴增獲得Lec-Eps區擴增子序列；(7)將Lec-Eps區擴增產物回收連接到載體pMDTM19-TSimple上獲得質粒分子pTLE2。
全文摘要
本發明公開了一種轉基因作物檢測中必要的標準質粒分子及其構建方法。一種轉基因大豆檢測用標準質粒分子及其構建方法，所述標準質粒分子包含大豆內源基因Lectin特異性片段、轉基因大豆GTS40-3-2品系中外源基因EPSPS特異性片段。通過分析序列，設計引物擴增獲得兩個目的基因片段。通過融合PCR、連接、轉化等分子克隆技術獲得人工重組質粒標準分子pTLE2。本發明中構建的標準質粒分子完全可以代替陽性標準品，適用于對轉基因大豆品系GTS40-3-2結構基因特異性的定性和定量PCR分析和檢測。如有新的轉基因材料出現，可在原標準分子的基礎上加入新的外源基因片段，滿足日益增多的轉基因作物材料的檢測需要。
文檔編號C12N15/63GK102409080SQ20101028687
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月20日 優先權日2010年9月20日
發明者楊雅麟, 滕達, 王建華, 王秀敏 申請人:中國農業科學院飼料研究所