一種從微量樣品中提取dna的試劑盒及其方法

專利名稱：一種從微量樣品中提取dna的試劑盒及其方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種從微量樣品中提取DNA的試劑盒，還 涉及從微量樣品中提取DNA的方法。
背景技術：
DNA，中文譯名為脫氧核糖核酸，是染色體的主要組成成分。DNA是最重要的生物信 息分子，可組成遺傳指令，以引導生物發育與生命機能運作，主要功能是貯存決定物種性狀 的幾乎所有蛋白質和RNA分子的全部遺傳信息；編碼和設計生物有機體在一定的時空中有 序地轉錄基因和表達蛋白完成定向發育的所有程序；初步確定了生物獨有的性狀和個性以 及和環境相互作用時所有的應激反應。由于DNA在生物生長發育中扮演如此重要的角色， 使得它成為分子生物學研究人員的重要研究對象，因此基因組DNA的分離純化就成為分子 生物學實驗技術中最重要、最基本的技術之一。不同來源的材料因材料起始量、細胞結構及其成分的不同，所提取的基因組DNA 有很大差異。因此，充足的材料起始量對提取足夠用于下游實驗的基因組DNA非常關鍵。但 是，并非所有情況下起始材料都充足，例如法醫材料、考古材料等獲取量非常少，另外醫學 領域中越來越傾向于通過獲取微量樣本來進行疾病診斷，例如通過口腔拭子、漱口水、唾液 等采集口腔脫落細胞，或者采集極少量血液來進行疾病診斷。采集微量樣本不僅減少了患 者的憂慮和痛苦，而且采集方式快速、柔和。因此，微量樣品的基因組DNA的有效提取成為 實現上述領域的目標的關鍵性步驟。目前常用的基因組DNA分離純化方法有SDS/苯酚/氯仿抽提法、高鹽沉淀法、離 子交換法和硅介質選擇性吸附法等，這些方法在提取各種材料的基因組DNA時具有一些本 身的優點，但這些方法在提取微量樣品時面臨無法有效提取DNA、操作步驟繁瑣等缺點。針對以上分離純化技術的問題，現在分離純化DNA大都采用離心柱法，即通過內 嵌玻璃纖維素膜吸附從樣品中裂解出的DNA，漂洗雜質后再將DNA洗脫下來。離心柱法雖然 能夠提取DNA并保證其純度，但是其提取DNA的量普遍不高，無法滿足法醫檢測、考古分析 和醫學檢測等領域的要求。此外，離心柱法使用到一些有毒試劑，如苯酚、氯仿等，不利于實 驗人員的身體健康；同時，離心柱法在整個提取DNA的過程中耗時較多，影響了下一步分析 檢測的速度。

發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種從微量樣品中提取DNA的試劑盒，采用本 試劑盒提取DNA的含量較高。本發明的另一個目的在于提供一種從微量樣品中提取DNA的方法，該方法耗時 短，不使用有毒試劑，所提DNA含量和純度較高。本發明所述從微量樣品中提取DNA的試劑盒包括結合液、調節結合液和去蛋白液，所述結合液包含3-8M的異硫氰酸胍、pH3. 5-5. 55-50mM 的 Tris-HCl、5-25 % 的 Ttiton-X 100、5_20mM 的 Urea、5_20mM 的 EDTA 禾Π 5 % 的 Tween20，所述調節結合液為異丙醇，所述去蛋白液包含2-8M的鹽酸胍、pH6. 5-8. O 5_50mM 的Tris-HCl和5-50%的無水乙醇。本發明所述結合液主要用來進一步裂解細胞，并且提供磁珠與基因組DNA結合的 環境；調節結合液用于促進磁珠與基因組DNA的結合，使基因組DNA和磁珠形成磁珠-DNA 復合物，而蛋白、RNA以及其他代謝產物不能結合在磁珠上；去蛋白液能有效去除磁珠上殘 余的蛋白質，并且保證基因組DNA不會損失。優選地，所述結合液包含4. 5M的異硫氰酸胍、pH4. 410mM的Tris_HCl、20 %的 Ttiton-X IOOUOmM 的 Urea、IOmM 的 EDTA 禾Π 5%的 Tween20。優選地，所述去蛋白液包含6M的鹽酸胍、pH7. 5 25mM的Tris-HCl和37%的無水乙醇。本發明所述從微量樣品中提取DNA的試劑盒還包括預處理緩沖液、裂解液、磁珠、漂洗液和洗脫液，所述預處理緩沖液pH值為7. 2， 包含 135mM 的 NaCl、2. 7mM 的 KC1、1. 5mM 的 KH2P04、8mM 的 K2HPO4，所述裂解液包含 0. 05-1M 的 NaCl、pH6. 5-9. 05-50mM 的 Tris-HCl、10_50mM 的 EDTA 和 0. 25-2 % 的 SDS，所述磁珠 為一種核心為Fe3O4、外周包裹了 二氧化硅的磁珠，所述漂洗液包含pH6. 5-8. 0 5_50mM 的Tris-HCl、50-200mM的NaCl、10-50 %的無水乙醇和10-50 %的異丙醇，所述洗脫液為 pH7. 0-8. 5 5-50mM 的 Tris-HCl。本發明所述預處理緩沖液是一種不含核酸酶的磷酸鹽緩沖液，主要用來預處理樣 品；裂解液為DNA的提取提供了最優的緩沖條件，既能強烈抑制DNase的活性，又能高效裂 解微量樣品釋放DNA ；磁珠采用Promega公司產品，該磁珠在磁場的存在下能迅速聚集，離 開磁場能夠均勻分散，不出現聚集現象；漂洗液可以去除磁珠上吸附的雜質，如多糖、纖維 素、脂類及提取過程中殘留的胍鹽、SDS等，同時保證基因組DNA不會損失；洗脫液可以有效 的將磁珠上結合的基因組DNA洗脫下來。優選地，所述裂解液包含0. IM的NaCl、pH8. OlOmM的Tris_HCl、25mM的EDTA和 0. 5%的 SDS0優選地，所述漂洗液包含pH7. 5 IOmM的Tris-HCl、100mM的NaCl、25%的無水乙醇 和25%的異丙醇。優選地，所述洗脫液為pH8. 0 IOmM的Tris-HCl。本發明還提供一種從微量樣品中提取DNA的方法，包括以下步驟步驟1、將樣品進行預處理后充分裂解，所述樣品為血液、血跡、唾液、口腔拭子、漱 口水或毛發；步驟2、向裂解后所得溶液加入結合液混勻并靜置，所得混合液加入調節結合液再 次混勻，然后與磁珠充分作用，所述結合液包含3-8M的異硫氰酸胍、pH3. 5-5. 5 5_50mM的 Tris-HCl、5-25% 的 Ttiton-X 100、5_20mM 的 Urea、5_20mM 的 EDTA 和 5% 的 Tween20，所述 調節結合液為異丙醇；步驟3、取所述磁珠加入去蛋白液充分混勻，所述去蛋白液包含2-8M的鹽酸胍、 pH6. 5-8. 0 5-50mM 的 Tris-HCl 和 5-50% 的無水乙醇；步驟4、漂洗所述磁珠，然后洗脫所述磁珠上結合的DNA。
優選地，所述結合液包含4. 5M的異硫氰酸胍、pH4. 4 IOmM的Tris_HCl、20 %的 Ttiton-X IOOUOmM 的 Urea、IOmM 的 EDTA 禾Π 5%的 Tween20。優選地，所述去蛋白液包含6M的鹽酸胍、pH7. 5 25mM的Tris-HCl和37%的無水乙醇。其中，步驟2所述加入調節結合液的量為0. 5-1倍于混合液體積，優選為0. 8倍 于混合液體積，所述靜置為在55-70°C下靜置5-15min，優選地，所述裂解為在70°C下靜置 IOmin0其中，所述預處理采用pH值為7. 2，包含135mM的NaCl、2. 7mM的KC1、1. 5mM的 KH2PO4^SmM的K2HPO4的預處理緩沖液進行預處理。所述預處理包括對固體樣品需要將其處 理成適合提取的體積和形狀；對液體樣品需要加入一定量預處理緩沖液補足至合適體積其中，其中所述裂解采用包含0. 05-1M 的 NaCl、pH6. 5-9. 0 5_50mM 的 Tris-HCl、 10-50mM的EDTA和0. 25-2%的SDS的裂解液進行裂解，優選地，采用包含0. IM的NaCl、 pH8. 0 IOmM 的 Tris_HCl、25mM 的 EDTA 和 0. 5%的 SDS 進行裂解。其中，所述磁珠為一種核心為Fe3O4、外周包裹了二氧化硅的磁珠。其中，所述漂洗采用包含pH6. 5-8. 0 5_50mM 的 Tris-HCl、50_200mM 的 NaCl、 10-50%的無水乙醇和10-50%的異丙醇的漂洗液進行漂洗，優選地，采用包含pH7. 5IOmM 的Tris-HClUOOmM的NaCl、25%的無水乙醇和25%的異丙醇進行漂洗。其中，所述洗脫采用pH7. 0-8. 5 5_50mM的Tris-HCl進行洗脫，優選地，采用pH8. 0 IOmM的Tris-HCl進行洗脫。本發明所述方法采用磁珠吸附法，通過預處理緩沖液、裂解液、結合液、調節結合 液、磁珠、去蛋白液、漂洗液、洗脫液從微量樣品中提取DNA。其中，生物磁珠是一種新型的亞 微米級或納米級的功能化載體，包括磁性顆粒和有活性基團的超順磁性材料。生物磁珠是 分散在基液中而形成的磁性液體材料，超順磁性材料在一定條件下可以在溶液中分散，而 在外磁場作用下可以定向運動和富集。因此，生物磁珠兼具有液體的流動性和固體磁性材 料的特點，在外磁場的作用下可以定向移動或集中，撤去外磁場后稍加振蕩或抽吸又可均 勻分散于液體中，從而使固液相的分離變得十分快捷方便，通過簡單的洗脫就可以得所提 DNA。本發明根據不同樣品耗時不同，微量血液樣品可以在30分鐘內完成，血跡、唾液、 漱口水、口腔拭子等可以在60分鐘內完成，毛發等難以裂解的樣品一般可在2小時內完成， 相比常見的離心柱提取法，提取時間均不同程度縮短。采用本發明所述從微量樣品中提取DNA的試劑盒及方法，所提DNA含量高、純度 高，提取速度快，不采用有毒試劑。


圖1示從干血點中提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；泳道M 分子量 Marker，從上至下依次為 23130bp、9416bp、6557bp、4361bp、 2322bp ；泳道1 本發明從干血點中提取的DNA條帶；泳道2 離心柱法從干血點中提取的DNA條帶；
圖2示從唾液中提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；泳道M 分子量 Marker，從上至下依次為 23130bp、9416bp、6557bp、4361bp、 2322bp ； 泳道1 本發明從唾液中提取的DNA條帶；泳道2 離心柱法從唾液中提取的DNA條帶；圖3示從毛發中提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；泳道M 分子量 Marker，從上至下依次為 23130bp、9416bp、6557bp、4361bp、 2322bp ；泳道1 本發明從毛發中提取的DNA條帶；泳道2 離心柱法從毛發中提取的DNA條帶；
具體實施例方式本發明公開了一種從微量樣品中提取DNA的試劑盒及其方法，本領域技術人員可 以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本 領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的試劑盒及方法已 經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本 文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。依照本發明，所述從微量樣品中提取DNA的試劑盒包括結合液、調節結合液和去蛋白液，所述結合液包含3-8M的異硫氰酸胍、pH3. 5-5. 5 5-50mM 的 Tris-HCl、5-25 % 的 Ttiton-X 100、5_20mM 的 Urea、5_20mM 的 EDTA 禾Π 5 % 的 Tween20，所述調節結合液為異丙醇，所述去蛋白液包含2-8M的鹽酸胍、pH6. 5-8. 0 5_50mM 的Tris-HCl和5-50%的無水乙醇。本發明所述結合液主要用來進一步裂解細胞，并且提供磁珠與基因組DNA結合的 環境；調節結合液用于促進磁珠與基因組DNA的結合，使基因組DNA和磁珠形成磁珠-DNA 復合物，而蛋白、RNA以及其他代謝產物不能結合在磁珠上；去蛋白液能有效去除磁珠上殘 余的蛋白質，并且保證基因組DNA不會損失。優選地，所述結合液包含4. 5M的異硫氰酸胍、pH4. 4 IOmM的Tris-HCl、20 %的 Ttiton-X IOOUOmM 的 Urea、IOmM 的 EDTA 禾Π 5%的 Tween20。優選地，所述去蛋白液包含6M的鹽酸胍、pH7. 5 25mM的Tris-HCl和37%的無水乙醇。本發明所述從微量樣品中提取DNA的試劑盒還包括預處理緩沖液、裂解液、磁珠、漂洗液和洗脫液，所述預處理緩沖液pH值為7. 2， 包含 135mM 的 NaCl、2. 7mM 的 KC1、1. 5mM 的 KH2P04、8mM 的 K2HPO4，所述裂解液包含 0. 05-1M 的 NaCl、pH6. 5-9. 05-50mM 的 Tris-HCl、10_50mM 的 EDTA 和 0. 25-2 % 的 SDS，所述磁珠 為一種核心為Fe3O4、外周包裹了 二氧化硅的磁珠，所述漂洗液包含pH6. 5-8. 0 5_50mM 的Tris-HCl、50-200mM的NaCl、10-50 %的無水乙醇和10-50 %的異丙醇，所述洗脫液為 pH7. 0-8. 5 5-50mM 的 Tris-HCl。本發明所述預處理緩沖液是一種不含核酸酶的磷酸鹽緩沖液，主要用來預處理樣 品；裂解液為DNA的提取提供了最優的緩沖條件，既能強烈抑制DNase的活性，又能高效裂解微量樣品釋放DNA ；磁珠采用Promega公司產品，該磁珠在磁場的存在下能迅速聚集，離 開磁場能夠均勻分散，不出現聚集現象；漂洗液可以去除磁珠上吸附的雜質，如多糖、纖維 素、脂類及提取過程中殘留的胍鹽、SDS等，同時保證基因組DNA不會損失；洗脫液可以有效 的將磁珠上結合的基因組DNA洗脫下來。優選地，所述裂解液包含0. IM的NaCl、pH8. O IOmM的Tris_HCl、25mM的EDTA和 0. 5%的 SDS0優選地，所述漂洗液包含pH7. 5 IOmM的Tris-HCl、100mM的NaCl、25%的無水乙醇 和25%的異丙醇。優選地，所述洗脫液為pH8. O IOmM的Tris-HCl。本發明還提供一種從微量樣品中提取DNA的方法，包括以下步驟步驟1、將樣品進行預處理后充分裂解，所述樣品為血液、血跡、唾液、口腔拭子、漱 口水或毛發；步驟2、向裂解后所得溶液加入結合液混勻并靜置，所得混合液加入調節結合液再 次混勻，然后與磁珠充分作用，所述結合液包含3-8M的異硫氰酸胍、pH3. 5-5. 5 5_50mM的 Tris-HCl、5-25% 的 Ttiton-X 100、5_20mM 的 Urea、5_20mM 的 EDTA 和 5% 的 Tween20，所述 調節結合液為異丙醇；步驟3、取所述磁珠加入去蛋白液充分混勻，所述去蛋白液包含2-8M的鹽酸胍、 pH6. 5-8. O 5-50mM 的 Tris-HCl 和 5-50% 的無水乙醇；步驟4、漂洗所述磁珠，然后洗脫所述磁珠上結合的DNA。優選地，所述結合液包含4. 5M的異硫氰酸胍、pH4. 4 IOmM的Tris_HCl、20 %的 Ttiton-X IOOUOmM 的 Urea、IOmM 的 EDTA 禾Π 5%的 Tween20。優選地，所述去蛋白液包含6M的鹽酸胍、pH7. 525mM的Tris-HCl和37%的無水乙其中，步驟2所述加入調節結合液的量為0. 5-1倍于混合液體積，優選為0. 8倍 于混合液體積，所述靜置為在55-70°C下靜置5-15min，優選地，所述裂解為在70°C下靜置 IOmin0其中，所述預處理采用pH值為7. 2，包含135mM的NaCl、2. 7mM的KC1、1. 5mM的 KH2PO4^SmM的K2HPO4的預處理緩沖液進行預處理。所述預處理包括對固體樣品需要將其處 理成適合提取的體積和形狀；對液體樣品需要加入一定量預處理緩沖液補足至合適體積其中，其中所述裂解采用包含0. 05-1M 的 NaCl、pH6. 5-9. 0 5_50mM 的 Tris_HCl、 10-50mM的EDTA和0. 25-2%的SDS的裂解液進行裂解，優選地，采用包含0. IM的NaCl、 pH8. 0 IOmM 的 Tris_HCl、25mM 的 EDTA 和 0. 5% 的 SDS 進行裂解。其中，所述磁珠為一種核心為Fe3O4、外周包裹了二氧化硅的磁珠。其中，所述漂洗采用包含pH6. 5-8. 0 5_50mM 的 Tris-HCl、50_200mM 的 NaCl、 10-50%的無水乙醇和10-50%的異丙醇的漂洗液進行漂洗，優選地，采用包含pH7. 5 IOmM 的Tris-HClUOOmM的NaCl、25%的無水乙醇和25%的異丙醇進行漂洗。其中，所述洗脫采用pH7. 0-8. 5 5_50mM的Tris-HCl進行洗脫，優選地，采用pH8. 0 IOmM的Tris-HCl進行洗脫。本發明根據不同樣品耗時不同，微量血液樣品可以在30分鐘內完成，血跡、唾液、漱口水、口腔拭子等可以在60分鐘內完成，毛發等難以裂解的樣品一般可在2小時內完成， 相比常見的離心柱提取法，提取時間均不同程度縮短。取相同質量的干血點采用本發明的方法和離心柱法分別提取DNA，本發明所提 取的DNA的含量為0. 54 μ g, 0D260/0D280值為1. 78 ；離心柱法所提取的DNA的含量為 0. 19 μ g, 0D260/0D280 值為 2. 08。取相同質量的唾液采用本發明的方法和離心柱法分別提取DNA，本發明所提取的 DNA的含量為1. 35 μ g,0D260/0D280值為1. 98 ；離心柱法所提取的DNA的含量為1. 05 μ g， 0D260/0D280 值為 2. 02。取相同質量的毛發采用本發明的方法和離心柱法分別提取DNA，本發明所提取的 DNA的含量為3. 14 μ g，0D260/0D280值為1. 85 ；離心柱法所提取的DNA的含量為0. 81 μ g， 0D260/0D280 值為 1. 95。以上實驗表明，本發明從各種微量樣品中所提取的DNA總量均明顯高于離心柱法 所提取的DNA，并且其0D260/0D280值均接近于標準值1. 8，表明DNA純度較高。下面結合實施例進一步闡述本發明。實施例1 本發明所述試劑盒本發明所述從微量樣品中提取DNA的試劑盒包括預處理緩沖液pH值為 7. 2，包含 135mM 的 NaCl、2. 7mM 的 KC1、1. 5mM 的 KH2PO4、8mM W K2HPO40 具體配制方法分別稱取 0. 8gNaCl、0. 02g KC1、0. 024g KH2P04、0. 18g K2HPO4，加 適量蒸餾水分別溶解后混合，再用HCl調pH7. 2，然后定容到100ml。裂解液0.IM 的 NaCl、pH8. 0 IOmM 的 Tris_HCl、25mM 的 EDTA 和 0. 5% 的 SDS。具 體配制方法分別量取 IM 的 Tris-HCl (pH 為 8. 0) lml.O. 5M 的 EDTA(pH 為 8. 0)5ml、5M 的 NaCl 2ml、10%的SDS 5ml，加入適量蒸餾水后定容到100ml。結合液4.5M 的異硫氰酸胍、pH4. 4 IOmM 的 Tris_HCl、20 % 的 Ttiton-X 100、 IOmM的UreaUOmM的EDTA和5 %的Tween20。具體配制方法分別稱取53. 172g異硫氰 酸胍和0. 06g Urea,加入適量蒸餾水分別溶解，然后加入IM的Tris-HCl (pH為4. 4) 1ml、 0.5M EDTA (pH 為 8. 0) 2ml、Triton-X 10020ml、Tween20 5ml，50°C加熱攪拌溶解，然后定容 到 100ml。調節結合液分析純的異丙醇。生物磁珠核心為Fe3CV外周包裹二氧化硅，Promega公司產品。磁性分離架內置磁鐵。去蛋白液6M的鹽酸胍、pH7. 5 25mM的Tris-HCl和37%的無水乙醇。具體配制 方法稱取57. 3g鹽酸胍，加蒸餾水充分溶解，然后加入IM的Tris-HCl (pH為7. 5) 2. 5ml、 無水乙醇37ml，定容到100ml，充分混勻。漂洗液pH7. 5 IOmM的Tris-HClUOOmM的NaCl、25%的無水乙醇和25%的異丙 醇。具體配制方法量取PH值為7. 5、濃度為IM的Tris-HCl 1ml，再量取5M的NaCl 2ml, 加入適量的蒸餾水混勻，再加入25ml的無水乙醇和25ml的異丙醇，定容到100ml，充分混勻。洗脫液pH8·0 IOmM 的 Tris-HCl。實施例2 從干血點中提取DNA
利用實施例1所述試劑盒從干血點中提取DNA。1、提取試劑預處理緩沖液pH值為 7. 2，包含 135mM 的 NaCl、2. 7mM 的 KC1、1. 5mM 的 KH2PO4、8mM 的 K2HPO4。裂解液0.IM 的 NaCl、pH8. 0 IOmM 的 Tris_HCl、25mM 的 EDTA 禾口 0. 5% 的 SDS。結合液4.5M 的異硫氰酸胍、pH4. 4 IOmM 的 Tris_HCl、20% 的 Ttiton-X IOOUOmM 的 Urea、IOmM 的 EDTA 禾Π 5%的 Tween20。調節結合液分析純的異丙醇。生物磁珠核心為Fe3CV外周包裹二氧化硅，Promega公司產品。磁性分離架內置磁鐵。去蛋白液6M的鹽酸胍、pH7. 525mM的Tris-HCl和37%的無水乙醇。漂洗液pH7. 510mM的Tris-HCl、IOOmM的NaCl、25 %的無水乙醇和25%的異丙洗脫液pH8.0 IOmM 的 Tris-HCl。2、提取方法(1)取帶有干血點(直徑2mm)的濾紙放入1. 5ml離心管，加入200 μ 1組織裂解液 和20 μ 1蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分混勻，56°C放置30-60min，期間不斷渦旋混勻直至血 跡被洗脫下來。(2)避開濾紙將上清移至另一 1. 5ml離心管中，加入200 μ 1結合液，立刻渦旋振蕩 充分混勻，在70°C放置lOmin，每隔2min顛倒混勻一次。(3)冷卻后加入10 μ 1磁珠及350 μ 1異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻。(4)室溫孵育5min，每隔2min輕微渦旋一次。孵育完畢后將離心管置于磁性分離 架上20s，勿將離心管取下直接傾倒上清，并用移液器小心吸盡殘液。(5)加入300 μ 1去蛋白液，渦旋混勻后將離心管置于磁性分離架上20s，勿將離心 管取下直接傾倒上清，并用移液器小心吸盡殘液。(6)加入500 μ 1漂洗液，渦旋混勻后將離心管置于磁性分離架上20s，勿將離心管 取下直接傾倒上清，重復此步驟1-2次。最后一次漂洗結束后，用移液器小心吸盡殘液，室 溫瞭干5min。(7)加50μ 1洗脫液，渦旋混勻后56°C放置5min，期間不斷渦旋混勻，將離心管置 于磁性分離架上20s，將上清移至另一干凈離心管中，即得基因組DNA。3、所提DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測同樣取上述本發明提取方法中所述帶有干血點(直徑2mm)的濾紙，采用離心柱法 提取DNA，采用本發明方法提取的干血點DNA與離心柱法提取的干血點DNA進行1 %瓊脂糖 凝膠電泳檢測，上樣量為5 μ 1，電壓為100V，電泳時間為25min，結果參見圖1。結果顯示， 本發明方法所提取的DNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示出單一的目的條帶，沒有出現雜帶， 并且條帶亮度明顯亮于離心柱法提取的干血點DNA，表明本發明方法提取的干血點DNA含 量和純度較高。4、所提DNA的含量及0D260/0D280值檢測使用分光光度計對采用本發明方法提取的干血點DNA與離心柱法提取的干血點DNA進行含量和0D260/0D280值檢測，結果參見表1。
表1 DNA的含量及0D260/0D280值檢測
材料本發明方法離心柱法DNA總量OD26O/OD28ODNA總量OD260/OD280干血點1.780.19μ82.08結果顯示，本發明所提取的DNA總量明顯高于離心柱法提取的DNA總量，此外本發 明所提取的DNA的0D260/0D280值與標準值(1. 8)無明顯差異，表明本發明方法提取的干 血點DNA含量和純度較高。實施例3 從唾液中提取DNA1、本發明所述從微量樣品中提取DNA的試劑盒本發明所述從微量樣品中提取DNA的試劑盒包括預處理緩沖液pH值為 7. 2，包含 135mM 的 NaCl、2. 7mM 的 KC1、1. 5mM 的 KH2PO4、8mM 的 K2HPO4。裂解液0.05M 的 NaCl、pH6. 5 5mM 的 Tris-HClUOmM 的 EDTA 禾Π 0. 25% 的 SDS。結合液3Μ的異硫氰酸胍、ρΗ3. 5 5mM 的 Tris_HCl、5% 的 Ttiton-Xl00、5mM 的 Urea、5mM 的 EDTA 禾口 5% 的 Tween20。調節結合液分析純的異丙醇。生物磁珠核心為Fe3O4、外周包裹二氧化硅，Promega公司產品。磁性分離架內置磁鐵。去蛋白液2M的鹽酸胍、pH6. 5 5mM的Tris-HCl和5%的無水乙醇。漂洗液pH6. 55mM的Tris_HCl、50mM的NaCl、10%的無水乙醇和10%的異丙醇。洗脫液pH7.05mM 的 Tris-HCl。2、提取方法采用上述提取試劑從唾液中提取DNA。(1)取10 μ 1新鮮的唾液放入1. 5ml離心管，補加預處理緩沖液至500 μ 1，顛倒混 勻后12000rpm離心5min，棄上清。(2)加入200μ 1組織裂解液和20μ 1蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分重懸沉淀， 56°C孵育15min，每隔5min渦旋混勻一次。(3)加入200 μ 1結合液，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70°C放置lOmin，每隔2min顛 倒混勻一次。(4)冷卻后加入20 μ 1磁珠及350 μ 1異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻。(5)室溫孵育5min，每隔2min輕微渦旋一次。孵育完畢后將離心管置于磁性分離 架上20s，勿將離心管取下直接傾倒上清，并用移液器小心吸盡殘液。(6)加入300 μ 1去蛋白液，渦旋混勻后室溫靜置l-2min，將離心管置于磁性分離 架上20s，勿將離心管取下直接傾倒上清，并用移液器小心吸盡殘液。(7)加入500 μ 1漂洗液，渦旋混勻后將離心管置于磁性分離架上20s，勿將離心管 取下直接傾倒上清，重復此步驟1-2次。最后一次漂洗結束后，用移液器小心吸盡殘液，室溫瞭干5min。(8)加100 μ 1洗脫液，渦旋混勻后56°C放置5min，期間不斷渦旋混勻，將離心管置 于磁性分離架上20s，將上清移至另一干凈離心管中，即得基因組DNA。3、所提DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測同樣取上述本發明提取方法中所述新鮮唾液10μ 1，用離心柱法提取DNA，采用本 發明方法提取的唾液DNA與離心柱法提取的唾液DNA進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，上樣 量為5 μ 1，電壓為100V，電泳時間為25min，結果參見圖2。結果顯示，本發明方法所提取的 DNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示出單一的目的條帶，沒有出現雜帶，并且條帶亮度明顯亮于 離心柱法提取的唾液DNA，表明本發明方法提取的唾液DNA含量和純度較高。4、所提DNA的含量及0D260/0D280值檢測使用分光光度計對采用本發明方法提取的唾液DNA與離心柱法提取的唾液DNA進 行含量和0D260/0D280值檢測，結果參見表2。表2 DNA的含量及0D260/0D280值檢測
權利要求
一種從微量樣品中提取DNA的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括結合液、調節結合液和去蛋白液，所述結合液包含3 8M的異硫氰酸胍、pH3.5 5.5 5 50mM的Tris HCl、5 25％的Ttiton X 100、5 20mM的Urea、5 20mM的EDTA和5％的Tween20，所述調節結合液為異丙醇，所述去蛋白液包含2 8M的鹽酸胍、pH6.5 8.0 5 50mM的Tris HCl和5 50％的無水乙醇。
2.根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述結合液包含4.5M的異硫氰酸胍、 pH4. 4 IOmM 的 Tris_HCl、20 % 的 Ttiton-X IOOUOmM 的 UreaUOmM 的 EDTA 和 5 % 的 Tween20o
3.根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述去蛋白液包含6M的鹽酸胍、pH7.5 25mM的Tris-HCl和37%的無水乙醇。
4.根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括預處理緩沖液、裂解液、磁珠、漂洗液和洗脫液，所述預處理緩沖液PH值為7. 2，包 含 135mM 的 NaCl、2. 7mM 的 KC1、1. 5mM 的 KH2P04、8mM 的 K2HPO4,所述裂解液包含 0. 05-1M 的 NaCl、pH6. 5-9. 0 5-50mM 的 Tris-HCl、10_50mM 的 EDTA 和 0. 25-2 % 的 SDS，所述磁 珠為一種核心為Fe3O4、外周包裹了二氧化硅的磁珠，所述漂洗液包含pH6. 5-8. 0 5_50mM 的Tris-HCl、50-200mM的NaCl、10-50 %的無水乙醇和10-50 %的異丙醇，所述洗脫液為 pH7. 0-8. 5 5-50mM 的 Tris-HCl。
5.根據權利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述裂解液包含0.IM的NaCl、pH8. 0 IOmM 的 Tris-HCl、25mM 的 EDTA 和 0. 5% 的 SDS，所述漂洗液包含 pH7. 5 IOmM 的 Tris-HCl、 IOOmM的NaCl、25%的無水乙醇和25%的異丙醇，所述洗脫液為pH8. 0 IOmM的Tris-HCl。
6.一種從微量樣品中提取DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1、將樣品進行預處理后充分裂解，所述樣品為血液、血跡、唾液、口腔拭子、漱口水 或毛發；步驟2、向裂解后所得溶液加入結合液混勻并靜置，所得混合液加入調節結合液再次 混勻，然后與磁珠充分作用，所述結合液包含3-8M的異硫氰酸胍、pH3. 5-5. 5 5-50mM的 Tris-HCl、5-25% 的 Ttiton-X 100、5_20mM 的 Urea、5_20mM 的 EDTA 和 5% 的 Tween20，所述 調節結合液為異丙醇；步驟3、取所述磁珠加入去蛋白液充分混勻，所述去蛋白液包含2-8M的鹽酸胍、 pH6. 5-8. 0 5-50mM 的 Tris-HCl 和 5-50% 的無水乙醇；步驟4、漂洗所述磁珠，然后洗脫所述磁珠上結合的DNA。
7.根據權利要求6所述方法，其特征在于，所述結合液包含4.5M的異硫氰酸胍、pH4. 4 IOmM 的 Tris-HCl、20% 的 Ttiton-X IOOUOmM 的 UreaUOmM 的 EDTA 禾Π 5% 的 Tween20，所 述去蛋白液包含6M的鹽酸胍、pH7. 525mM的Tris-HCl和37%的無水乙醇。
8.根據權利要求6所述方法，其特征在于，步驟2所述加入調節結合液的量為0.5-1倍 于混合液體積。
9.根據權利要求6所述方法，其特征在于，步驟2所述靜置為在55-70°C下作用 5-15min。
10.根據權利要求6所述方法，其特征在于，所述預處理采用PH值為7.2，包含135mM的 NaCl,2. 7mM的KC1、1. 5mM的KH2P04、8mM的K2HPO4的預處理緩沖液進行預處理，所述裂解采用包含 0. 05-1M 的 NaCl、pH6. 5-9. 05_50m M 的 Tris-HCl、10_50mM 的 EDTA 和 0. 25-2% 的 SDS 的裂解液進行裂解，所述磁珠為一種核心為Fe3O4、外周包裹了二氧化硅的磁珠，所述漂洗采 用包含 pH6. 5-8. 0 5-50mM 的 Tris-HCl、50_200mM 的 NaCl、10-50% 的無水乙醇和 10-50% 的異丙醇的漂洗液進行漂洗，所述洗脫采用PH7. 0-8. 5 5-50mM的Tris-HCl進行洗脫。
全文摘要
本發明涉及分子生物學領域，公開了一種從微量樣品中提取DNA的試劑盒，還公開了一種從微量樣品中提取DNA的方法。該試劑盒包括結合液、調節結合液和去蛋白液，所述結合液包含3-8M的異硫氰酸胍、pH3.5-5.55-50mM的Tris-HCl、5-25％的Ttiton-X 100、5-20mM的Urea、5-20mM的EDTA和5％的Tween20，所述調節結合液為異丙醇，所述去蛋白液包含2-8M的鹽酸胍、pH6.5-8.0 5-50mM的Tris-HCl和5-50％的無水乙醇。本發明所述試劑盒及方法提取的DNA含量和純度較高，提取速度快，不采用有毒試劑，適用于提取各種微量樣品的DNA。
文檔編號C12N15/10GK101935646SQ20101028159
公開日2011年1月5日 申請日期2010年9月13日 優先權日2010年9月13日
發明者李艷萍 申請人:原平皓(天津)生物技術有限公司