專利名稱：柑桔碎葉病毒巢式rt-pcr檢測方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于一種RT-PCR檢測方法及其檢測用試劑盒，具體的說，涉及一種柑桔碎 葉病毒巢式RT-PCR檢測方法及其試劑盒。
背景技術：
柑桔碎葉病毒(Citrus tatter leaf virus, CTLV)是威脅柑桔生產(chǎn)的重要病原 之一。CTLV在我國浙江、湖南、福建和廣西等地的局部地區(qū)曾造成比較嚴重的危害。應用和 推廣無病毒柑桔苗木是CTLV防治的有效措施。目前，柑桔無病毒苗木三級繁育體系已在我 國多個柑桔產(chǎn)區(qū)建立，無病毒苗木得到了大面積的推廣。為保證種苗安全，必須對采穗母本 樹進行定期鑒定，并對感染病毒的良種進行脫毒處理。這必然要求快速、靈敏的病毒檢測技 術。CTLV是發(fā)狀病毒屬(CapiIlovirus)正義單鏈RNA病毒，病毒粒子呈彎曲線狀，大 小約為600 700nmX15nm，基因組全長約6496 nt，5’端具帽子結(jié)構(gòu)，3’端具Poly (A)尾 巴。應用臘斯克枳橙等指示植物鑒定是CTLV檢測的常規(guī)手段之一，但其檢測周期較長(1 一 2年)并易受環(huán)境條件影響。血清學檢測技術大大提高了 CTLV的檢測速度，在美國、日本等 國得到廣泛應用。Kawai等還制備了 CTLV單克隆抗體用于酶聯(lián)免疫法檢測。但抗體制備 不易，檢測靈敏度有待提高。隨著分子生物學的發(fā)展，RT-PCR檢測方法以其速度快、靈敏度 高、特異性好等特點受到青睞。Magome等，Osvaldo等，Kirby等分別建立了 RT-PCR檢測 體系，成功擴增出了 CTLV特異性片段。Hailstones等建立了 CTLV的半巢式RT-PCR檢測 方法，比Kawai等酶聯(lián)免疫法的靈敏度提高500倍以上。已有的報道表明，巢式PCR往往 比普通PCR具有更高的靈敏度，但關于CTLV的巢式RT-PCR檢測方法尚無報道。我國可能 是CTLV的起源地，因而不同地域或品種的分離物可能存在較大變異。在對我國CTLV的實 際檢測中，上述方法在檢測靈敏度、檢測范圍上可能具有一定的局限性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有傳統(tǒng)檢測技術中的不足之處，提供一種柑桔碎葉病毒 的特異性強、靈敏度高的巢式RT-PCR檢測方法，本發(fā)明還提供了一種用于檢測柑桔碎葉病 毒的試劑盒，適合大規(guī)模、高通量樣品檢測。本發(fā)明目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明從自行設計的和已報道的檢測柑桔碎葉病毒的 引物中篩選出兩對特異性引物用于柑桔碎葉病毒的巢式RT-PCR檢測，其堿基序列為
上游外部引物5，-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3， 下游外部引物5，-AGAGTGGACAAACTCTA-3， 上游內(nèi)部引物5’ -GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3’ 下游內(nèi)部引物5’ - CTCCTAACCCTCCAGTTCCA -3，。本發(fā)明的目的可通過如下步驟來實現(xiàn)
(1)取適量CTLV寄主植物的葉或皮在液氮中充分研磨，加入核酸提取液提取樣品總核酸或RNA ；
(2)第一步RT-PCR反應，所用特異性引物為上游外部引物 5，-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3，、下游外部引物 5，-AGAGTGGACAAACTCTA-3，；反應體系總體 積 10μ L，包括2XPCR 緩沖液 5 μ L，10 μ mol/μ L 上下游引物各 0.5 μ L，50 mmol/L MgSO4 0. 3μ L,5 U/μ L RT/Taq 酶 0. 2yL，模板核酸 1 μ L，超純水 2. 5 μ L ;RT_PCR 擴增條件為: 42°C 30 min ；94°C 2 min ；94°C 20s, 54. 5°C 20 s，72°C 45s，40 個循環(huán)；72°C 10 min;
(3)第二步PCR反應，所用特異性引物為上游內(nèi)部引物 5，-GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3，、下游內(nèi)部引物 5，-CTCCTAACCCTCCAGTTCCA-3，；第二步擴增 以第一步PCR產(chǎn)物混合液作為模板進行，反應體系為10XPCR緩沖液2.5 μ L，10 mmol/L dNTP 0.8 μ L，50 mmol/L MgSO4 0· 8 μ L，10 μ mol/μ L 弓丨物各 1 μ L，5 U/μ L Taq 酶 0. 3 μ L，超純水17. 6 μ L，第一輪RT-PCR的反應混合液IyL ； PCR擴增條件為94°C，2 min ； 94°C, 20 s，56°C，20 s，72°C，45s，40 個循環(huán)；72°C 10 min。(4)瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰氨凝膠電泳、染色、獲取電泳圖譜；
(5)依據(jù)上述圖譜的條帶特征診斷CTLV的分子變異類型。見附圖1，與標準Marker 比較，電泳圖譜中如出現(xiàn)256bp擴增條帶，表明該樣品中存在柑桔碎葉病毒，如果沒有出現(xiàn) 256bp擴增條帶，表明該樣品中不存在柑桔碎葉病毒。在上述方案中步驟(1)的提取方法為稱取5 mg病毒寄主皮或葉裝入一無菌離心 管中，在液氮中研磨后依次加入60μ L TES緩沖液和60 μ L飽和酚氯仿異戊醇混合溶液， 所述酚氯仿異戊醇的體積比為25 24 :1，混勻；70°C水浴5 10分鐘；室溫下13 OOOrpm 離心5分鐘，吸取40 μ L上清液加入由S印hadex G_50_80構(gòu)成的微柱中，置于一新的無菌 離心管，5 OOOrpm離心4分鐘，收集洗脫液。本發(fā)明的檢測柑桔碎葉病毒的檢測試劑盒由以下試劑構(gòu)成由以下試劑構(gòu)成緩沖 液A、RT/Taq酶、Taq酶、CTLV正對照、緩沖液B和雙蒸水；其中，緩沖液A由10 mOl/L柑桔碎 葉病毒特異性上游外部引物5’ -CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3‘、10 mol/L柑桔碎葉病毒特異性下 游外部引物 5’-AGAGTGGACMACTCTA-3’、2XPCR 緩沖液、50 mmol/L MgSO4 和超純水 1. 5 μ L 組 成；緩沖液B由10 mol/L柑桔碎葉病毒特異性上游內(nèi)部引物5’ "GCTGATTTGGCTCGTGMTT-3’、 10 mol/L柑桔碎葉病毒特異性下游內(nèi)部引物5’ - CTCCTAACCCTCCAGTTCCA -3M0XPCR緩沖 液、10 mmol/L dNTP、50 mmol/L MgSO4 和超純水組成。單樣用量的緩沖液A含Ιθμπιο /L柑桔碎葉病毒特異性上游外部引物 5，-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3，0. 5 μ L，10 μ mol/L柑桔碎葉病毒特異性下游外部引物 5，-AGAGTGGACAAACTCTA-3，0. 5 μ L，2XPCR 緩沖液 5μ L,50 mmol/L MgSO4 0· 3 μ L、 超純水1.5yL;單樣用量的緩沖液B含ΙΟμπιοΙ/L柑桔碎葉病毒特異性上游內(nèi)部引物 5，-GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3，1 μ LUOy mol/L柑桔碎葉病毒特異性下游內(nèi)部引物5，-CTCCTAACCCTCCAGTTCCA -3，1 μ LUO XPCR 緩沖液 2.5 μ L, 10 mmol/L dNTP 0. 8 μ L, 50 mmol/L MgSO4 0. 8 μ L,超純水 17. 6 μ L。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于
(1)實用性強、檢測周期短，現(xiàn)有檢測方法中，其中臘斯克枳橙等指示植物鑒定方法檢 測周期很長，需要1-2年，且易受外界環(huán)境條件影響，血清學檢測技術雖然大大提高了 CTLV 的檢測速度，在美國、日本等國得到廣泛應用。Kawai等還制備了 CTLV單克隆抗體用于酶聯(lián)免疫法檢測。但抗體制備不易，而本發(fā)明的速度得到了很大的提高，從樣品制備到獲檢測結(jié) 果圖譜可在一天之內(nèi)完成，且制作簡單，實用性強；
(2)操作簡便，重復性好、穩(wěn)定性高，同一樣品的不同檢測批次，不同人員操作，其結(jié)果 一致性強，適合大規(guī)模、高通量的樣品分析。一次可處理樣品幾十個；
(3)靈敏度高，為了評估本發(fā)明檢測方法的靈敏度，發(fā)明人以嫁接了CTLV毒源的大葉 大果甜橙為對象按步驟1的方法抽提樣品總核酸并檢測其濃度，依次做10倍梯度稀釋后各 取Iy L平行進行一步法和巢式RT-PCR檢測。檢測結(jié)果顯示，所抽提的總核酸A260 /A280 平均值為1. 28，其濃度為126. 98ng · μ L — 1 ；RT-PCR結(jié)果顯示(圖2)，一步法RT-PCR能夠 檢測到IO2倍稀釋的模板，濃度約為1. 27ng · μ L_ \而巢式RT-PCR能夠檢測到IO5倍稀釋 的模板，濃度約為1. 27pg · μ I/1，這表明本發(fā)明檢測方法的檢測靈敏度較一步法RT-PCR提 高1000倍。
圖1是本發(fā)明檢測結(jié)果示意圖；其中1-10代表柑桔碎葉病毒樣品(陽性，具有 256bp特征性條帶)，11代表負對照；M代表IOObp梯度DNA標準Marker ；
圖2是巢式RT-PCR與一步法RT-PCR檢測CTLV的靈敏度比較結(jié)果示意圖；1_7 巢式 RT-PCR ;8-14 —步法 RT-PCR ； 1-7 和 8-14 稀釋度分別依次是100，KT11KT2, 1(Γ3，1(Γ4， 1(Γ5，ΙΟ—6 ； M IOObp梯度DNA標準分子量。
具體實施例方式本發(fā)明中所使用的術語“PCR”又稱聚合酶鏈式反應，通常需要獲得感興趣 區(qū)域端或其外延的序列信息，從而可以設計寡核苷酸引物；這些引物應與待擴增模板相 反鏈的序列相同或相似，兩個引物的5’端核苷酸可以與擴增材料的兩端恰好重合，PCR 技術可用來擴增全部基因組DNA中的、從全細胞RNA、噬菌體或質(zhì)粒序列等轉(zhuǎn)錄獲得的 cDNA 中的待定 RNA 序列、待定 DNA 序列。見 Mullis 等，Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 51. 263(1987)。RT-PCR 為反轉(zhuǎn)錄 RCR (reverse transcription PCR)和實時 PCR (real time PCR)共同的縮寫。逆轉(zhuǎn)錄 PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄 PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR), 是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為 互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。TES緩沖液指三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸生物緩沖液。dNTP 指，deoxy-ribonucleoside triphosphate (三磷酸脫氧核糖核苷)。實施例1 柑桔碎葉毒病巢式RT-PCR檢測方法 (1)核酸提取
稱取病毒寄主皮或葉各5啤，分別裝入一無菌離心管中，在液氮中研磨后依次加入 60 μ L TES緩沖液和60 μ L飽和酚氯仿異戊醇(體積比為25 24 1 )，混勻。70°C水浴5 10 分鐘。室溫下13 OOOrpm離心5分鐘，吸取40 μ L上清液加入由S印hadex G-50-80構(gòu)成的 微柱中，置于一新的無菌離心管，5000rpm離心4分鐘，收集洗脫液，得到樣品1_11。(2)巢式 RT-PCR第一步RT-PCR反應，所用特異性引物為上游外部引物 5，-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3，、下游外部引物 5，-AGAGTGGACAAACTCTA-3，；反應體系總體 積 10μ L，包括2XPCR 緩沖液 5 μ L，10 μ mol/μ L 上下游引物各 0.5 μ L，50 mmol/L MgSO4 0. 3μ L,5 U/μ L RT/Taq 酶 0. 2yL，模板核酸 1 μ L，超純水 2. 5 μ L ;RT_PCR 擴增條件為: 42°C, 30 min;94°C，2 min ;94°C，20s，54. 5°C，20 s，72°C，45s，40 個循環(huán)；72°C 10 min;
第二步PCR反應，所用特異性引物為上游內(nèi)部引物5’ -GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3’、 下游內(nèi)部引物5’ -CTCCTAACCCTCCAGTTCCA-3，；第二步擴增以第一步PCR產(chǎn)物混合液作為 模板進行，反應體系為反應體系為10XPCR緩沖液2.5 yL,10 mmol/L dNTP 0.8 μ L， 50 mmol/L MgSO4 0. 8 μ L，10 μ mol/μ L 上下游引物各 1 μ L，5 U/μ L Taq 酶 0. 3 yL，超 純水17. 6 μ L，第一輪RT-PCR的反應混合液IyL; PCR擴增條件為94°C，2 min ；94°C，20 s，56°C，20 s，72°C，45s，40 個循環(huán)；72°C 10 min。(3)電泳及圖譜獲取
配制1. 2%瓊脂糖凝膠，將上步反應混合液5 μ L與3 μ L染料混勻后點樣，同時點5 μ L 的DNA標準Marker ；電泳條件為初始電壓150V，10分鐘；后續(xù)電壓100V，30分鐘。電泳完 畢后EB染色15分鐘，在凝膠成像系統(tǒng)中獲取圖譜。(4) CTLV 的診斷
檢測結(jié)果如圖1所示，通過與DNA標準Marker比較，可以看出 樣品1 一 10電泳圖譜中出現(xiàn)256bp特征性條帶，表明樣品中存在柑桔碎葉病毒，而負 對照11未出現(xiàn)256bp特征性條帶，表明樣品中不存在柑桔碎葉病毒。實施例2 —種同時檢測柑桔碎葉病毒的巢式RT-PCR試劑盒
該試劑盒由以下試劑組成(100樣)
其中，緩沖液A由ΙΟμπιοΙ/L柑桔碎葉病毒特異性上游外部引物 5’ -CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3\ 10 μ mol/L柑桔碎葉病毒特異性下游外部引物 5，-AGAGTGGACAAACTCTA-3\2XPCR 緩沖液、50 mmol/L MgSO4 和超純水組成，它們 的體積比為5:5:5:3:1.5 ；沖液B含ΙΟμπιοΙ/L柑桔碎葉病毒特異性上游內(nèi)部引物 5’ -GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3’、10 μ mol/L柑桔碎葉病毒特異性下游內(nèi)部引物5’ -CTCCTAACCCTCCAGTTCCA -3，、10 XPCR 緩沖液、10 mmol/L dNTP、50 mmol/L MgSO4 和超純 水，它們的體積比為10 10 25 8 8 176。 單樣用量的緩沖液A含ΙΟμπιοΙ/L柑桔碎葉病毒特異性上游外部引物 5，-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3，0. 5 μ L，10 μ mol/L柑桔碎葉病毒特異性下游外部引 物 5，-AGAGTGGACAAACTCTA-3，0. 5 μ L，2 X PCR 緩沖液 5 μ L, 50 mmol/L MgSO4 0. 3 μ L 超純水1.5yL;單樣用量的緩沖液B含ΙΟμπιοΙ/L柑桔碎葉病毒特異性上游內(nèi)部引物 5，-GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3，1 μ LUOy mol/L柑桔碎葉病毒特異性下游內(nèi)部引物5，-CTCCTAACCCTCCAGTTCCA -3，1 μ LUO XPCR 緩沖液 2.5 μ L, 10 mmol/L dNTP 0. 8 μ L, 50 mmol/L MgSO4 0. 8 μ L,超純水 17. 6 μ L。
權(quán)利要求
一種柑桔碎葉病毒巢式RT PCR檢測方法，其特征在于以柑桔碎葉病毒特異性上游外部引物、下游外部引物進行對待測樣品第一輪RT PCR擴增，再以柑桔碎葉病毒特異性上游內(nèi)部引物、下游內(nèi)部引物進行第二輪PCR擴增，最后電泳鑒定；所述柑桔碎葉病毒的特異性引物為上游外部引物5’ CCCTCTCAGCTAGAATTGAA 3’下游外部引物5’ AGAGTGGACAAACTCTA 3’上游內(nèi)部引物5’ GCTGATTTGGCTCGTGAATT 3’下游內(nèi)部引物5’ CTCCTAACCCTCCAGTTCCA 3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述柑桔碎葉病毒巢式RT-PCR檢測方法，其特征在于包括如下步驟(1)取適量CTLV寄主植物的葉或皮在液氮中充分研磨，加入核酸提取液提取樣品總核 酸或RNA ；(2)第一步RT-PCR反應，所用特異性引物為上游外部引物 5，-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3，、下游外部引物 5，-AGAGTGGACAAACTCTA-3，；反應體系總體 積 10μ L，包括2XPCR 緩沖液 5 μ L，10 μ mol/μ L 上下游引物各 0.5 μ L，50 mmol/L MgSO4 0· 3 μ L，5 U/μ L RT/Taq 酶 0· 2 μ L，模板核酸 1 μ L，超純水 2. 5 μ L ；RT-PCR 擴增條件為:42°C 30 min ；94°C 2 min ；94°C 20s, 54. 5°C 20 s，72°C 45s，40 個 循環(huán)；72°C 10 min;(3)第二步PCR反應，所用特異性引物為上游內(nèi)部引物 5，-GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3，、下游內(nèi)部引物 5，-CTCCTAACCCTCCAGTTCCA-3，；第二步擴增 以第一步PCR產(chǎn)物混合液作為模板進行，反應體系為10XPCR緩沖液2.5 μ L，10 mmol/L dNTP 0.8 μ L，50 mmol/L MgSO4 0· 8 μ L，10 μ mol/μ L 弓 |物各 1 μ L，5 U/μ L Taq 酶 0· 3 μ L，超純水17. 6 μ L，第一輪RT-PCR的反應混合液IyL;PCR 擴增條件為94°C，2 min ；94°C,20 s，56°C，20 s，72°C，45s，40 個循環(huán)；72°C 10min ；(4)瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰氨凝膠電泳、染色、獲取電泳圖譜；(5)依據(jù)上述圖譜的條帶特征診斷CTLV的分子變異類型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述柑桔碎葉病毒巢式RT-PCR檢測方法，其特征在于步驟(1) 的提取方法為稱取5啤病毒寄主皮或葉裝入一無菌離心管中，在液氮中研磨后依次加入 60μ L TES緩沖液和60μ L飽和酚、氯仿、異戊醇混合溶液，混勻，所述酚氯仿異戊醇的體 積比為25 24 1 ；70°C水浴5 10分鐘；室溫下13000rpm離心5分鐘，吸取40 μ L上清液加 入由S印hadex G-50-80構(gòu)成的微柱中，置于一新的無菌離心管，5000rpm離心4分鐘，收集 洗脫液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述柑桔碎葉病毒巢式RT-PCR檢測方法，其特征在于所述柑桔碎 葉病毒特異性引物巢式擴增產(chǎn)物大小為256bp。
5.一種檢測柑桔碎葉病毒的檢測試劑盒，其特征在于由以下試劑構(gòu)成緩沖液A、RT/ Taq酶、Taq酶、CTLV正對照、緩沖液B和雙蒸水；其中，緩沖液A由10 μ mol/L柑桔碎葉病 毒特異性上游外部引物5’ -CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3’、10 μ mol/L柑桔碎葉病毒特異性下 游外部引物 5，-AGAGTGGACAAACTCTA-3，、2XPCR 緩沖液、50 mmol/L MgSO4 和超純水組成；沖液B含10 μ mo 1 /L柑桔碎葉病毒特異性上游內(nèi)部引物5 ’ -GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3，、 10 μ mol/L柑桔碎葉病毒特異性下游內(nèi)部引物5，- CTCCTAACCCTCCAGTTCCA -3，UOXPCR 緩沖液、10 mmol/L dNTP、50 mmol/L MgSO4 和超純水。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測柑桔碎葉病毒的檢測試劑盒，其特征在于單樣用量的緩 沖液A含10 μ mo 1 /L柑桔碎葉病毒特異性上游外部引物5 ’ -CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3 ’ 0. 5 μ L，10 μ mol/L柑桔碎葉病毒特異性下游外部引物5’ -AGAGTGGACAAACTCTA-3’ 0. 5 μ L，2 XPCR 緩沖液 5yL，50 mmol/L MgSO4 0. 3 μ L、超純水 1. 5 μ L ；單樣用量的緩沖 液B含10 μ mo 1 /L柑桔碎葉病毒特異性上游內(nèi)部引物5 ’ -GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3，1 μ L、10ymol/L柑桔碎葉病毒特異性下游內(nèi)部引物5’ - CTCCTAACCCTCCAGTTCCA -3’ 1 μ LU0XPCR 緩沖液 2.5 μ L, 10 mmol/L dNTP 0.8 μ L,50 mmol/L MgSO4 0.8 yL，超純 水 17. 6 μ L0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測柑桔碎葉病毒的巢式RT-PCR檢測方法和試劑盒，屬于生物技術領域。本方法通過提取核酸，應用柑桔碎葉病毒特異性上游外部引物、下游外部引物對待測樣品進行第一輪RT-PCR擴增，再以柑桔碎葉病毒特異性上游內(nèi)部引物、下游內(nèi)部引物進行第二輪PCR擴增，最后電泳判斷檢測樣品中是否存在柑桔碎葉病毒電泳圖譜中如出現(xiàn)256bp特征性條帶，表明該樣品中存在柑桔碎葉病毒，如果沒有出現(xiàn)256bp特征性條帶，表明該樣品中不存在柑桔碎葉病毒。本發(fā)明還相應地建立了檢測試劑盒，可特異、靈敏、高效地檢測柑桔碎葉病毒，適用于田間樣品檢測、CTLV流行監(jiān)控、脫毒苗木鑒定等多種用途。
文檔編號C12Q1/70GK101914633SQ20101028155
公開日2010年12月15日 申請日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月15日
發(fā)明者劉科宏, 周常勇, 唐科志, 宋震, 李中安, 楊方云 申請人:西南大學