專利名稱：與雞300日齡產蛋量相關的garnl1基因上的位點及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程和遺傳工程領域，具體涉及與雞300日齡產蛋量相關的 GARNLl基因上的位點及其應用
背景技術：
我國優質雞資源豐富，但絕大部份的地方品種的繁殖性能普遍低下，年產蛋量平 均只有70-90枚，且具有頑固的就巢性(yang and jiang, 2005)。繁殖性能低下已經成為 制約優質雞產業發展的瓶頸，提高優質雞繁殖性能是優質雞育種中需要重點解決的問題。 傳統的育種方法對雞繁殖性能的提高卓有成效，經過多年的高強度的選育提高，育成了專 門化的商品蛋雞配套系，年產蛋量在280枚以上。但傳統的育種方法需要完整記錄整個母 雞生產周期的產蛋情況，世代間隔長，這也限制了優質雞繁殖性能的育種進展。若要進一步 提高優質雞的繁殖性能，必須對其遺傳機理有更為深入的了解。因而，應用分子標記的現代 育種技術對于提高優質雞產蛋量是先進有效的辦法。將DNA分析做為主要的研究手段應用 于優質雞的育種中，主要目的是通過在DNA分子水平上尋找與優質雞繁殖性狀密切相關的 遺傳標記，用于早期的選育，從而加快育種進程。雞的繁殖性狀是一個復雜的性狀，具有遺傳力低，易受環境影響等特點。通過對雞 神經內分泌的研究分析，表明了多個基因參與了雞的繁殖行為，如就巢行為被認為是雌激 素、孕酮和催乳素相互作用的結果(Gruaz et al，1993; Yasin et al, 1995; El Halawani et al, 2000)，而促性腺激素釋放激素(Gonadotrophin Releasing Hormone, GnRH)被認為 是控制產蛋的關鍵神經肽激素，雞基因組研究進展為家禽繁殖性狀的遺傳基礎提供可能。 候選基因法和QTL (Quantitative trait locus, QTL)定位被廣泛運用于雞繁殖性能的研 究上。雞的繁殖性狀已有研究被定位到了不同的染色體區域，但由于大部份的QTL定位研 究采用的都是雜交群體，因而限制了 QTL定位的結果在商業群體的直接應用。GARNLl基因目前的研究非常少，人上GARNLl基因的研究表明，它與神經表型和家 方矣基底節 丐化癥(Familial idiopathic basal ganglia calcification, IBGC ；XI^Fahr disease)相關(Schwarzbraun 等，2004)，且與腦部發育廷滯相關(Shimojima 等，2009)； 在雞上面的研究僅見于Chen等(2006,2007)通過消減雜交cDNA文庫篩選與產蛋量相關 基因，結果表明G^&VD基因在同一品系高產和低產組中表達差異極顯著，該研究表明了雞 GARNLl基因在mRNA水平上與雞繁殖性能的關系。
迄今為止，尚未將雞基因做為雞繁殖性狀的分子標記。
發明內容
本發明的目的在于根據現有優質繁殖性能雞的選育中存在的不足，提供一個與雞 300日齡產蛋量相關的似記見7基因上的位點，該位點可以作為分子標記，用于選育優質繁 殖性能雞。本發明還有一個目的在于提供上述與雞300日齡產蛋量相關的β^Ρ 基因上的位點的應用。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現
與雞300日齡產蛋量相關的GARNLl基因上的位點，所述位點位于雞的GARNLl基因外 顯子15上第138bp處的一個C — G突變，所述β^Ρ 基因外顯子15的核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1 所示。
GARNLl基因外顯子15上上第138 bp處存在有1個的堿基突變，但沒有引起酶切 位點的變化。我們使用質譜分型的方法來研究該位點的多態性。本發明與雞300日齡產蛋量相關的β^Ρ 基因上的位點作為分子標記，該位點等 位基因型為CC型個體的300日齡總產蛋量要極顯著高于GC型和GG型P < 0. 01，因而等位 基因C為300日齡總產蛋量優勢等位基因，可用于篩選具有優質繁殖性能的雞品種的具體 步驟如下
(1)從待測雞血液樣本中提取雞基因組DNA；
(2)根據NCBIdbSNP數據庫提供的雞似7&見7基因外顯子15上的位點序列，由深 圳華大基因科技有限公司根據序列設計引物擴增出待測SNP所在的核苷酸片段，利用 MALDI-T0F-MS質譜檢測平臺進行基因分型。質譜分型的原理是利用樣品分子在電場中的飛 行時間與分子的荷質比成正比的原理，通過檢測樣品分子的飛行時間，測得分子量，檢測出 SNP位點；
(3)根據基因分型所得到的圖譜，得到待測樣品的基因型。上述步驟(2)中，所述引物如SEQ ID NO:2^3所示。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
本發明標記為雞繁殖性能特別是300日齡總產蛋量的選育提供了一種新的分子標記。 實驗證明基因對雞300日齡總產蛋量有一定的影響，可以做為候選基因或300日齡 產蛋量的遺傳標記。
圖1為本發明的選育優質繁殖性能雞品種的技術流程圖； 圖2為純合子CC質譜分型圖譜結果；
圖3為雜合子GC質譜分型圖譜結果； 圖4為純合子GG質譜分型圖譜結果。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。實施例1
1、雞血樣的采集和DNA的提取
300日齡繁殖性狀測定完成后，采用一次性注射器從雞翅下靜脈中抽取約1 mL血液， 注入經高壓滅菌并裝有約 200 μ L 2% 無菌 EDTA (Ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)抗凝劑的1. 5 mL離心管中，輕輕搖勻，記錄翅號，_80°C保存備用。基因組DNA的抽提采用苯酚_氯仿抽提法(奧斯泊F等，1998)(1)取全血30μ L置于1. 5 mL離心管，分別加入470 μ L 1 X SET緩沖液、12.5 μ L 20% SDS和6 μ LlO mg/mL蛋白酶K，混合均勻后放于55°C水浴過夜；
(2)取出樣本于1.5mL離心管，加入500μ L飽和苯酚，輕搖20 min，10，000 rpm離心 10 min ；
(3)取上清，再次加入500μ L飽和苯酚，輕搖20 min, 10, 000 rpm離心10 min ；
(4)取上清，加入500μ L氯仿-異戊醇( 23 :1)輕搖20 min, 10, 000 rpm離心10 min ；
(5)取上清，加入1mL冰無水乙醇(_20°C)，來回搖擺以沉淀DNA，10，000 rpm離心10 min后倒出乙醇；
(6)用1mL 75%乙醇清洗DNA —次，倒掉乙醇，置于50°C干燥箱內烘干；(7)待DNA完 全干燥后加入300 μ L滅菌后的雙蒸水溶解，50°C水浴鍋中過夜以溶解DNA ；
(8)存放于-20°C冰箱中保存備用。2、目的片段的獲得及質譜分型 (1)擴增含待測位點的核苷酸片段
根據序列，委托深圳華大基因科技有限公司設計引物，擴增出待測位點的核苷酸片段。 該引物序列如SEQ ID N0:2 3所示。(2)針對待測位點，設計單條特異引物 引物核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。當退火時，特異引物的3’端的堿基剛好與待測位點的前一個堿基結合。(3)單(雙)堿基延伸SNP位點
在反應體系中加入ddNTP和DNA聚合酶，當某一 ddNTP與待測位點堿基互補并結合 時，鏈延伸反應終止，得到延伸一個堿基的樣品分析物。(4)質譜檢測，自動分型
將制備的樣品分析物與晶片基質共結晶后放入質譜儀的真空管，用瞬時納秒(10-9s) 強激光激發；由于基質分子經輻射所吸收的能量，導致能量蓄積并迅速產熱而使基質晶體 升華，核酸分子解吸附并轉變為亞穩態離子，產生的離子多為單電荷離子，在加速電場中獲 得相同的動能，進而在一非電場漂移區內按照其質荷比率加以分離，在真空小管中飛行到 達檢測器。MALDI產生的離子通過飛行時間(Time-of-Flight，T0F)檢測器來檢測，離子質 量越小，就越快到達。3、基因型判定及關聯分析
根據質譜的結果判定該位點在檢測群體中的基因型。實施例2
m% GARNLl基因位點不同基因型與雞繁殖性狀進行關聯分析的檢測應用。1% GARNlA 基因位點分析結果如表1所示。由表1可以得到基因型間對雞300日齡產蛋量(EN300)的 影響達到了極顯著水平(P < 0. 01)。表1 GARNLl基因rsl4532787位點與雞300日齡產蛋量的關聯分析
權利要求
與雞300日齡產蛋量相關的GARNL1基因上的位點，其特征在于所述位點位于雞的GARNL1基因外顯子15上138bp處的一個C→G突變，所述GARNL1基因外顯子15的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.權利要求1所述與雞300日齡產蛋量相關的GARNLl基因上的位點的應用，其特征在 于所述與雞300日齡產蛋量相關的GARNLl基因上的位點作為分子標記，該位點等位基因型 為CC型個體的300日齡總產蛋量要極顯著高于GC型和GG型，因而等位基因C為300日齡 總產蛋量優勢等位基因，用于篩選具有優質繁殖性能的雞品種。
3.根據權利要求2是所述與雞300日齡產蛋量相關的GARNLl基因上的位點的應用，其 特征在于所述篩選方法包括如下步驟(1)從待測雞血液樣本中提取雞基因組DNA；(2)根據雞GARNLl基因外顯子15上第138bp處的C/G突變位點，設計引物擴增出待測 SNP所在的核苷酸片段后，進行基因分型；(3)根據基因分型所得到的圖譜，得到待測樣品的基因型。
4.根據權利要求3所述與雞300日齡產蛋量相關的GARNLl基因上的位點的應用，其特 征在于步驟(2)中，所述引物如SEQ ID N0:2 3所示。
5.根據權利要求3所述與雞300日齡產蛋量相關的GARNLl基因上的位點的應用，其特 征在于步驟(2)中，所述基因分型是通過MALDI-T0F-MS質譜檢測平臺完成的。
全文摘要
本發明公開了一個與雞300日齡產蛋量相關的GARNL1基因上的位點及其應用。本發明雞300日齡產蛋量相關的GARNL1基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述位點位于GARNL1基因外顯子15上第138bp處的一個C/G突變。該位點與雞300日齡總產量極顯著相關(P＜0.01)，且等位基因C為300日齡總產量中高產蛋量的優勢等位基因。本發明與雞300日齡產蛋量相關的GARNL1基因上的位點可用于篩選具有優質繁殖性能的雞品種。
文檔編號C12Q1/68GK101948831SQ20101028038
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月14日 優先權日2010年9月14日
發明者張細權, 曾華, 沈栩, 謝亮 申請人:華南農業大學