豬檸檬酸脫氫酶基因IDH3β啟動子的分離克隆和鑒定的制作方法

專利名稱：：豬檸檬酸脫氫酶基因IDH3β啟動子的分離克隆和鑒定的制作方法
技術領域：
：本發明屬于豬的育種和分子生物學
技術領域：
，具體涉及一種豬檸檬酸脫氫酶基因ΙΗ3β啟動子的分離、克隆和鑒定。
背景技術：
：中國是世界第一養豬和豬肉消費大國。據聯合國糧農組織(FAO)統計資料，2007年中國生豬存欄4.464億頭、出欄6.208億頭、豬肉總產量為0.472億噸，分別占全世界47.43%,47.28%和45.75%，均居世界首位。目前我國規模化豬場飼養的豬種大多為外來瘦肉型品種，如杜洛克豬、大白豬、長白豬等，這些品種生長速度快，飼料報酬和瘦肉率高，滿足了市場對瘦肉的迫切需求；但同時在追求高瘦肉率的情況下也導致了豬肉品質的下降。肌內脂肪(intramuscularfat,IMF)含量被認為是目前最重要的肌肉品質性狀指標。國內外對豬肌內脂肪進行的相關研究結果表明，沉積在肌肉內的脂肪含量與肉的嫩度和風味有直接關系，2-3%的IMF含量可產生理想的口感，但目前對瘦肉率的選擇已使上述商品豬肉中平均IMF含量下降到1-1.5%，低于最佳范圍；同時PSE(pale，soft,exudative)和DFD(dry,firm,dark)豬肉的出現也使一些名牌瘦肉型豬聲譽大減。隨著人民生活水平的不斷提高，人們對豬肉的消費由量轉為了質，豬肉風味品質也越來越成為消費者追求的主要目標，再加上我國傳統的飲食文化、烹飪習慣，對于豬肉品質有著更高的要求，風味品質優良、瘦肉率適度的優質豬肉必將成為消費者的首要選擇，市場對優質豬肉的需求將會進一步擴大。目前，常規育種技術在實現豬雜種優勢利用、性能測定、遺傳評估及優良品種培育方面取得了顯著成就，不僅培育了目前現有的許多商業豬種，而且這些品種的遺傳改良也獲得了成功。但由于對復雜性狀(如品質性狀等)分析較難、選擇效率較低、育種周期較長，已不能滿足當前養殖業對優良品種的需求，培育突破性品種的難度越來越大，在品種改良上所獲得的遺傳增益日趨平緩，尤其在聚合高產、優質、抗逆等多個優良性狀的品種選育方面進展不大。轉基因技術的發展克服了常規育種方法周期長、預見性差、選擇效率低的局限性，能夠打破物種界限，克服生殖隔離困難，實現優良基因重組和聚合，定向選育優質、高抗動物新品種。例如2006年4月，美國密蘇里-哥倫比亞大學的賴良學等獲得了轉線蟲fat-Ι基因(ω-3去飽和酶基因)的體細胞克隆豬。其體內表達的轉基因可以將豬體內的ω-6系飽和脂肪酸轉化為ω-3系不飽和脂肪酸，提高了ω-3系脂肪酸含量，降低了ω-6/ω-3的比例，大大提升了豬肉的營養價值。這充分說明了轉基因育種技術與常規育種技術有機結合將成為取得豬育種水平新突破的重要途徑。我國是世界上豬種資源最豐富的國家，擁有48個地方品種，位居世界第一，約占世界豬種資源總量的1/3。我國的地方豬種不僅種類繁多，而且種質特性各異。經過長期馴養和選育，地方豬種大都具備肉質優良、繁殖力高、抗逆性強、耐粗飼等特點，但地方品種瘦肉率低、生長速度慢、飼料轉化率低的缺點，限制了其規模化飼養。如何采用現代的動物分子與細胞育種技術，把地方豬種和外來品種兩類優異基因資源聚合在一起，并縮短品種培育的進程，是急需解決的問題。而解決這些問題的重要途徑之一就是利用轉基因技術生產轉基因豬新品種(系)，盡快使我國優質轉基因豬研究整體水平與國際同步，大幅度提高我國畜牧科技的自主創新和國際競爭能力，為我國豬種改良、優異種質資源高效利用和種質資源創新提供技術支撐，促進農業可持續發展。生產轉基因豬就勢必涉及到與豬經濟性狀相關的具有重要育種價值的功能基因和調控元件的篩選和鑒定。目前，已確認的用于豬的主效基因有蘭尼啶受體(Rynadinereceptor1，RYR1)基因和酸肉(RendermentNapole,RN)基因等。影響豬肌內脂肪含量的功能基因包括了心臟脂肪酸結合蛋白(HeartFattyAcidBindingProtein,H-FABP)、脂肪組織脂肪酸結合蛋白(AdipocyteFattyAcid-bindingProtein，A-FABP)、鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin，CAST)、氟烷基因(HalothaneGene,Hal)、激素敏感脂肪酶(hormone-sensitivelipase,HSL)、肌肉生長抑制素基因(Myostatin)、甘油二酯酰轉移酶(DiacylglyceralAcyltransferase,DGAT)、過氧化物酶體增殖因子活化受體γ(PPARy)等。影響肌肉嫩度的因素主要有不同肌肉纖維類型組成以及MyoD家族成員MEF3和myf6、鈣蛋白酶I(CAPNl)和鈣蛋白酶II(CAPN2)、鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin，CAST)等基因。一般認為，提高I型肌纖維生成，可以明顯提高紅肌纖維比例，從而可以改善豬肉肉質。與功能基因的研究相比，有關啟動子的分離克隆和功能研究的報道要少得多。目前，克隆啟動子的方法包括利用基因組文庫篩選、利用啟動子探針質粒載體篩選、利用啟動子捕獲方法分離和鑒別和利用PCR技術克隆啟動子。本實驗室采用Siebert等(1995)發明的基因組PCR步行(genomePCRwalking)方法獲得了豬骨骼肌特異表達基因MEF2C、Myf5和Myf6基因的啟動子序列。該方法結合了SuppressionPCR和利用接頭的PCR的優點，具有簡單高效、特異性強、無須篩選引物、一次性獲得的未知序列較長等優點，已廣泛應用于基因的啟動子或其他上游調控序列的快速克隆(Oubrahim等，2005Jura等，2005)。啟動子結構和功能研究國內外通常采用生物信息學技術對獲得的啟動子序列進行初步預測和分析，了解啟動子序列可能包含的調控元件，為功能驗證奠定基礎。采用順序缺失法分析啟動子的結構，采用瞬時轉染和點突變等研究啟動子活性和特異性，采用共轉染技術、酵母單雜交和凝膠阻滯法等分析與調控元件作用的反式作用因子。本實驗室采用順序缺失、點突變和凝膠阻滯法等研究了MEF2C、Myf5,Myf6,ATGL和ADAMTS1基因的結構和功能。目前，可用于轉基因的啟動子數量和種類非常有限，主要是來源于病毒的啟動子，如巨細胞病毒(CMV)、肉瘤病毒40(SV40)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、人單純皰疹病毒(HSV)和乙型肝炎病毒(HBV)等組成型啟動子，他們可以在幾乎所有組織和物種細胞中調控外源基因表達，也沒有時空特異性。用這些啟動子調控目標基因表達時，由于大量目標蛋白在不需要的細胞或不需要的階段積累，往往容易造成動物形態和生理功能異常，以致早衰或死亡。在哺乳動物上雖然有少量特異性啟動子分離克隆的報道，但主要涉及動物乳房組織中特異表達，S卩β-乳球蛋白(BLG)、酪蛋白基因調控序列、乳清酸蛋白(WAP)調控序列和乳清白蛋白基因調控序列等(樊寶良等，2005；崔奎青等，2005；Hermighausen等，1992；Whitelaw等，2000)，涉及肌肉和脂肪組織的種類和數量非常有限。能用于轉基因豬制備的、擁有自主知識產權的高效表達載體和組織特異表達載體也很少。簡清等(2004)通過改造斑馬魚MLC2啟動子，構建了肌肉特異性表達紅色熒光蛋白表達載體，獲得了肌肉特異性高效表達紅色熒光蛋白轉基因斑馬魚。2000年，孟慶勇構建了含有牛骨骼肌α-actin啟動子和人工合成的羊GRF序列的真核表達載體。2007年，章倩倩構建小鼠CMV-SP(肌肉特異啟動子)雙啟動子高效特異表達載體。此外，人們對啟動子上的順式調控元件和反式作用因子的種類、結構和相互協調關系也不是十分清楚，限制了啟動子利用。因此，很有必要開展豬重要調控元件的篩選、克隆和功能驗證，獲得具有自主知識產權的可供選擇的啟動子，構建高效、穩定、特異表達的載體，滿足轉基因豬制備的需求。異檸檬酸脫氫酶(IsocitrateDehydrogenase,IDH)是生物體三羧酸循環(TricarboxylicAcidCycle)中的重要的限速酶，負責催化異檸檬酸氧化脫羧成α-酮戊二酸，并將氧化型NAD或NADP還原成NADH或NADPH(Chen，1990)。IDH在生物體內有兩種存在形式，即以NAD為電子受體的NAD-依賴型異檸檬酸脫氫酶(NAD-IDH)和以NADP為電子受體的異檸檬酸脫氫酶(NADP-IDH)。NADP-IDH廣泛存在于真核生物的各種細胞器(如葉綠體、線粒體等)、胞質和原核細胞中(Camacho等，1995)。NAD-IDH則普遍被認為僅存在于真核生物線粒體中，但有研究者在嗜酸硫細菌中也發現了NAD-IDH，因此它的分布也似乎變得廣泛起來(Inoue等，2002)。在哺乳動物中，主要有三種形式的IDH，即胞液型NADP-IDH(IDHl)、線粒體型NADP_IDH(IDH2)和線粒體型NAD_IDH(IDH3)。IDH3是由α、β、Y三個亞基以211的比例組成的異源四聚體，每個四聚體各有兩個ADP、異檸檬酸、NAD、NADH以及Mn2+結合位點，但未發現其他金屬離子結合位點。其中α亞基為催化亞基，并有一部分的異檸檬酸結合位點，而β、Y亞基可能與調節有關，上面有ADP結合位點(Kim等，1999)。目前國內外對豬IDH3i3啟動子的克隆、啟動子活性分析以及啟動子區突變研究等還是空白。
發明內容本發明的目的在于分離、克隆和鑒定豬檸檬酸脫氫酶基因IDH3i3啟動子，為豬的遺傳改良提供基因資源。本發明通過分離克隆方法，得到一種豬異檸檬酸脫氫酶基因IDH3i3的啟動子，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO1和SEQIDNO4所示。其中如序列表SEQIDNO1所示的啟動子是位于豬IDH3β基因上游5，側翼的基因組核苷酸序列，其長度為2447bp。制備如序列表SEQIDNO1所述的豬IDH3β基因上游5，側翼2447bp的基因組核苷酸序列的方法，按照如下步驟(1)以成年中國地方豬品種“梅山豬”的血液提取基因組DNA，作為TAIL-PCR模板，根據豬檸檬酸脫氫酶基因Π)Η3β基因第一外顯子的核苷酸序列設計正向引物，所述引物編號及其核苷酸序列如下所示正向引物1:GTCAGGGGCGTGGGTAAGACAGAGCA；正向引物2ACACACACGCCTTTGAGGTCAGGTCTG；正向引物3TACTTCAGTGAGCCCGCCACAAACAG；反向引物4=NGTCGASffGANAffGAA；反向引物5GTNCGASffCANAffGTT；反向引物6=WGTGNAGffANCANAGA；反向引物7=NCAGCTffSCTNTSCTTο①將上述正向引物1分別與反向引物4、5、6以及7配對進行PCR擴增。②以正向引物1和反向引物4擴增得到的PCR產物作為模板，用正向引物2與反向引物4配對再進行PCR擴增。以正向引物1和反向引物5擴增得到的PCR產物作為模板，用正向引物2與反向引物5配對再進行PCR擴增。以正向引物1和反向引物6擴增得到的PCR產物作為模板，用正向引物2與反向引物6配對再進行PCR擴增。以正向引物1和反向引物7擴增得到的PCR產物作為模板，用正向引物2與反向引物7配對再進行PCR擴增。③以正向引物2和反向引物4擴增得到的PCR產物作為模板，用正向引物3與反向引物4配對再進行PCR擴增。以正向引物2和反向引物5擴增得到的PCR產物作為模板，用正向引物3與反向引物5配對再進行PCR擴增。以正向引物2和反向引物6擴增得到的PCR產物作為模板，用正向引物3與反向引物6配對再進行PCR擴增。以正向引物2和反向引物7擴增得到的PCR產物作為模板，用正向引物3與反向引物7配對再進行PCR擴增。按上述操作，應用TAIL-PCR方法就能完成第一輪基因組步移，正向引物3分別與反向引物4/5/6和7配對進行PCR擴增的產物經純化后克隆測序，并進行序列分析，獲得如序列表SEQIDNO:2所述的核苷酸序列。(2)根據SEQIDNO:2所示的核苷酸序列再次設計如下所述的正向引物，實施TAIL-PCR第二輪基因組步移，所述引物編號及其核苷酸序列如下所示正向引物8GTCAGGGGCGTGGGTAAGACAGAGCA；正向引物9ACACACACGCCTTTGAGGTCAGGTCTG；正向引物10TACTTCAGTGAGCCCGCCACAAACAG。TAIL-PCR第二輪基因組步移的實施過程與第一輪相同，PCR擴增產物經純化后克隆測序，并進行序列分析，獲得如序列表SEQIDNO:3所述的核苷酸序列。(3)將獲得的如序列表SEQIDNO2和3所示的核苷酸序列進行拼接，拼接后的序列中包含豬異檸檬酸脫氫酶基因IDH3i3基因的第一外顯子序列，除去拼接序列中的第一外顯子序列，獲得如序列表SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。本發明提供了豬檸檬酸脫氫酶基因IDH3i3基因啟動子的鑒定及其啟動子活性測定方法，其步驟如下(1)設計引物采用生物信息學的方法對如序列表SEQIDNO=I所示的核苷酸序列進行轉錄因子結合位點預測。(2)根據上述預測結果，結合序列表SEQIDNO=I所示的核苷酸序列和豬檸檬酸脫氫酶基因IDH3i3基因第一外顯子核苷酸序列(GenBank登錄號為DQ507859)設計引物，所述引物編號及其核苷酸序列如下所示正向引物11GCCACGCGTGAGAGAGACGCTTTCATA；正向引物12GACACGCGTGCAGCCTCTGAGAAACTG；正向引物13GACACGCGTTCCCCAAGATGAGAACCA；正向引物14GACACGCGTCGCCTTTAGCGTCGGACA；正向引物15GCCACGCGTACTTAGGTCCTCCTTTGA；正向引物16GACACGCGTACATAAACAGGGTGACCG；正向引物17GTAACGCGTGTTCTGTGCCGCATCAGC；正向引物18GTAACGCGTCGCATCAGCCTCCAGGGG；正向引物19GTAACGCGTCAGGGGAAGGGGTGCGTA；正向引物20GTAACGCGTGGGGTGCGTAGGAGTACC；正向引物21GCCACGCGTGGAGTACCTAACGCAGGA；正向引物22GCGACGCGTCGCAGGAGGATGAAAAGTA；正向引物23GCCACGCGTGGATGAAAAGTAAGCACGAG；正向引物24GCCACGCGTCACGAGCTTTGTGTTGGA；正向引物25GCCACGCGTGTGTTGGAGGAAAAGAGAGAG正向引物26GCCACGCGTAAAAGAGAGAGCCACCCG；正向引物27GATACGCGTGTAGAGGCGCAGAGCCGC；正向引物28GATACGCGTGTAGAGGCGCAGAGCCGC；正向引物29GATACGCGTAGAGCCGCGCTGGATTCC；反向引物30GTACTCGAGTTCGCCGTAGGAAGTCGC。以豬基因組DNA為模板，用上述正向引物11-29與反向引物30配對分別進行PCR擴增，PCR產物回收并純化。(3)將步驟⑵所獲得的產物與pGL3-BasiC載體連接(見圖3)，經鑒定正確無誤后轉染豬腎細胞，測定其活性。其活性測定的結果如圖4和圖5所示。本發明提供了序列表SEQIDNO1中包含的1處304bp的插入突變，其序列如序列表SEQIDNO:4所示。其制備步驟包括根據如序列表SEQIDNO1所示的核苷酸序列設計引物，其引物的編號及核苷酸序列如下正向引物31TGGCTCTGTCCAAGGGTT；反向引物32:AACTGGGATTTGTACTGC。在豬基因組DNA中進行PCR擴增，PCR擴增片段經瓊脂糖凝膠電泳檢測。本發明詳細制備方法參見“具體實施方式”。序列表SEQIDNO1是本發明克隆的豬檸檬酸脫氫酶基因IDH3β基因上游5，側翼2447bp的啟動子的核苷酸序列。序列表SEQIDNO2是本發明實施第一輪TAIL-PCR克隆的豬檸檬酸脫氫酶基因ΙΗ3β基因上游5’側翼的部分啟動子的核苷酸序列。序列表SEQIDNO3是本發明實施第二輪TAIL-PCR克隆的豬檸檬酸脫氫酶基因ΙΗ3β基因上游5’側翼的部分啟動子的核苷酸序列。序列表SEQIDNO4是本發明克隆的豬檸檬酸脫氫酶基因IDH3β基因啟動子區304bp插入突變的核苷酸序列。圖1是豬檸檬酸脫氫酶基因IDH3β基因5’側翼區插入突變分型結果。圖2是熒光素酶報告基因表達載體pGL3-BasiC的圖譜，外源片段將插入XhoI和MluI內切酶將pGL3-BasiC酶切后的多克隆位點。圖3是部分重組質粒的酶切鑒定。圖中1、3、5、7為pGL3-BasiC空載體的雙酶切，2、4、6、8分別為pGL-IB279、pGL-IB395、pGL-IB1254以及pGL-IB2282重組質粒的酶切結果。圖4是豬檸檬酸脫氫酶基因IDH3β基因啟動子區重組質粒熒光素酶相對活性的測定結果。圖中(A)pGL-IBs重組質粒構建示意圖；(B)用直方圖表示的熒光素酶相對活性，誤差線用標準差標示，重復數為3。圖5是pGL-IB395和pGL_IB395+304重組質粒熒光素酶相對活性的測定結果。用直方圖表示的熒光素酶相對活性，誤差線用標準差標示，重復數為3。具體實施例方式實施例1豬檸檬酸脫氫酶基因IDH3β基因上游5’側翼序列的制備采用TAIL-PCR方法(Liu等，1995)分離豬檸檬酸脫氫酶基因IDH3β的啟動子序列，該方法每次步移須經二輪PCR擴增，PCR反應條件見表1。表1.TAIL-PCR的三輪擴增條件反應輪次循環數參數設定第一輪(R-SE)第二輪(R-SF)第三輪(R-SG)(R-R)151151121301930C-lmin,95°C-5min94°C-30s,62°C-lmin,72°C-2.5min94°C-30s,25"Crampingto72°Cin3min,72°C-2.5min94°C-20s,68°C-3.5min94°C-20s,68°C-3.5min94°C-30s,42°C-lmin,72°C-2.5min72°C-5min,4"Chold940C-20s,65°C-3.5min12940C-20s,65°C-3.5min94"C-30s,42°C-lmin,72°C-2.5min2°C-5min，4°Chold94°C-30s,42°C-lmin,72°C-2.5min72"C-5min,4°Chold反應體系如下⑴第一輪100ng豬基因組DNA，0.2μΜ基因特異引物1(SE)，2口]隨機引物1(11、12、13和14)，2.5口1^2mMdNTP,IUTaqDNA聚合酶，2.5μLIOXTaqDNA聚合酶緩沖液，加入至總體積25μL；(2)第二輪。將第一輪PCR產物稀釋50倍，取1μL作為模板，0.2μMSE基因特異引物2(SF)，2μM隨機引物R(R1、R2、R3和R4)，2.5μL2mMdNTP,IUTaqDNA聚合酶，2.5μL10XTaqDNA聚合酶，加入至總體積25μL；(2)第三輪將第二輪PCR產物稀釋10倍，取1μL作為模板，0.2μMSE基因特異引物3(SG)，0.2μM隨機引物R(R1、R2、R3和R4)，2.5μL2mMdNTP，IUTaqDNA聚合酶，2.5μLIOXTaqDNA聚合酶緩沖液，加去離子水至總體積25μL，同時，設計兩個對照將基因特異引物SG分別換成基因特異引物4(SH)和R，其他不變。將第三輪PCR擴增產物回收、克隆和測序。序列分析后，以該序列為模板，設計基因特異引物，繼續步移。本發明中豬異檸檬酸脫氫酶基因IDH3B啟動子序列分離的引物，所述引物編號及其核苷酸序列如下所示正向引物1GTCAGGGGCGTGGGTAAGACAGAGCA；正向引物2ACACACACGCCTTTGAGGTCAGGTCTG；正向引物3TACTTCAGTGAGCCCGCCACAAACAG；正向引物8GTCAGGGGCGTGGGTAAGACAGAGCA；正向引物9ACACACACGCCTTTGAGGTCAGGTCTG；正向引物10TACTTCAGTGAGCCCGCCACAAACAG；反向引物4NGTCGASffGANAffGAA；反向引物5GTNCGASffCANAffGTT；反向引物6WGTGNAGffANCANAGA；反向引物7NCAGCTffSCTNTSCTTο①將上述正向引物1分別與反向引物4、5、6以及7配對進行PCR擴增。②以正向引物1和反向引物4擴增得到的PCR產物作為模板，用正向引物2與反向引物4配對再進行PCR擴增。以正向引物1和反向引物5擴增得到的PCR產物作為模板，用正向引物2與反向引物5配對再進行PCR擴增。以正向引物1和反向引物6擴增得到的PGR產物作為模板，用正向引物2與反向引物6配對再進行PCR擴增。以正向引物1和反向引物7擴增得到的PCR產物作為模板，用正向引物2與反向引物7配對再進行PCR擴增。③以正向引物2和反向引物4擴增得到的PCR產物作為模板，用正向引物3與反向引物4配對再進行PCR擴增。以正向引物2和反向引物5擴增得到的PCR產物作為模板，用正向引物3與反向引物5配對再進行PCR擴增。以正向引物2和反向引物6擴增得到的PCR產物作為模板，用正向引物3與反向引物6配對再進行PCR擴增。以正向引物2和反向引物7擴增得到的PCR產物作為模板，用正向引物3與反向引物7配對再進行PCR擴增；④按上述操作，TAIL-PCR就完成第一輪基因組步移，正向引物3分別與反向引物4/5/6和7配對進行PCR擴增的產物經純化后克隆測序，并進行序列分析，獲得如序列表SEQIDNO:2所述的核苷酸序列。⑤根據SEQIDNO:2所示的核苷酸序列再次設計正向引物，實施TAIL-PCR第二輪基因組步移。TAIL-PCR第二輪基因組步移的實施過程與第一輪相同，PCR擴增產物經純化后克隆測序，并進行序列分析，獲得如序列表SEQIDNO:3所述的核苷酸序列。⑥將獲得的如序列表SEQIDNO2和3所示的核苷酸序列進行拼接，拼接后的序列中包含IDH3i3基因的第一外顯子序列，除去拼接序列中的第一外顯子序列，獲得如序列表SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。實施例2豬檸檬酸脫氫酶基因IDH3β上游5’側翼序列突變的檢測方法選擇2頭國外血緣豬品種“大白豬”和2頭中國地方豬品種“梅山豬”提取基因組DNA，根據實施例1獲得的豬檸檬酸脫氫酶基因IDH3i3的2447bp的5’側翼序列為試驗材料，設計以下引物，引物編號及核苷酸序列如下所示正向引物31:TGGCTCTGTCCAAGGGTT；反向引物32:AACTGGGATTTGTACTGC。用引物31和32在上述2頭大白豬和2頭梅山豬基因組DNA中進行PCR擴增，PCR反應體系為25μ1，其中模板DNA為50ng，dNTPs濃度為200μmol/L，每條引物濃度為0.3ymol/L，lU的TaqDNA聚合醇(BiostarInternational,Canada)，力口去離子水至總體積25μ1；PCR反應程序94°C預變性4min；然后94°C變性50s、58°C退火50s、72°C延伸lmin，共35個循環；最后72°C延伸7min。不同豬種的PCR產物經純化(參見武漢生工公司UNIQ-IO柱式DNA膠回收試劑盒說明書)、克隆后，進行序列測定。擴增產物經克隆測序后，采用CLUSTALW分析發現，該區域存在一段304bp的插入突變，其核苷酸序列如序列表SEQIDN0:4所示。當個體存在該插入突變時，擴增產物是一條大小為369bp(即A等位基因)的片段；當個體沒有該片段的插入時，擴增產物是一條大小為673bp(即B等位基因)的片段。豬檸檬酸脫氫酶基因IDH3i3的分型結果如圖1所示。實施例3含有豬檸檬酸脫氫酶基因IDH3β上游5’側翼序列表達載體的構建1.引物設計根據pGL3-BasiC載體(購自美國Promega公司)的多克隆位點和豬ACL基因啟動子序列的特征，采用缺失的方法設計引物，在上下游引物5’端分別有XhoI和MluI酶切位點(酶切位點序列加下劃線，如表3所示)，并在酶切位點識別序列上游分別加上3個保護堿基，保證酶切位點不丟失。以大白豬基因組DNA為模板進行PCR反應，PCR擴增的退火溫度為58°C。引物編號及其核苷酸序列如下所示正向引物11GCCACGCGTGAGAGAGACGCTTTCATA；正向引物12GACACGCGTGCAGCCTCTGAGAAACTG；正向引物13GACACGCGTTCCCCAAGATGAGAACCA；正向引物14GACACGCGTCGCCTTTAGCGTCGGACA；正向引物15GCCACGCGTACTTAGGTCCTCCTTTGA；正向引物16GACACGCGTACATAAACAGGGTGACCG；正向引物17GTAACGCGTGTTCTGTGCCGCATCAGC；正向引物18GTAACGCGTCGCATCAGCCTCCAGGGG；正向引物19GTAACGCGTCAGGGGAAGGGGTGCGTA；正向引物20GTAACGCGTGGGGTGCGTAGGAGTACC；正向引物21GCCACGCGTGGAGTACCTAACGCAGGA；正向引物22GCGACGCGTCGCAGGAGGATGAAAAGTA；正向引物23GCCACGCGTGGATGAAAAGTAAGCACGAG；正向引物24GCCACGCGTCACGAGCTTTGTGTTGGA；正向引物25GCCACGCGTGTGTTGGAGGAAAAGAGAGAG正向引物26GCCACGCGTAAAAGAGAGAGCCACCCG；正向引物27GATACGCGTGTAGAGGCGCAGAGCCGC；正向引物28GATACGCGTGTAGAGGCGCAGAGCCGC；正向引物29GATACGCGTAGAGCCGCGCTGGATTCC；反向引物30GTACTCGAGTTCGCCGTAGGAAGTCGC。以豬基因組DNA為模板，用正向引物11-29與反向引物30配對分別進行PCR擴增。2.雙酶切將PCR產物回收純化后進行雙酶切，酶切體系如下PCR純化產物30μL，IOH緩沖液4μL，20UXhoI和MluI內切酶(寶生物工程(大連)有限公司)，加水至總體積40μL。37°C酶切5h以上后電泳回收。同時，將pGL3-BasiC載體也進行酶切(pGL3-BasiC載體如圖2所示，用XhoI和MluI內切酶進行雙酶切，外源片段將插入該位點)，雙酶切體系總體積為20μL，其中含有經過質粒提取獲得的pGL3-BasiC載體DNA7μL(約5μg)，IOHbuffer2μL，IOUXhoI和MluI內切酶，加水至總體積20μL。放入烘箱，37°C酶切5h以上后電泳回收。為防止載體的自身連接，回收后立即構建重組子，將其放置在-20°C冰箱保存，放置時間一般不超過2個月。3.連接連接反應體系中插入DNA與載體DNA按31的摩爾數進行，反應總體積為10μL，其中，IyL10Ligasebuffer，T4DNA連接酶(購自美國Promega公司)lyL，各缺失分析的PCR雙酶切純化產物4.5μL，pGL3-Basic載體的酶切純化產物1.5μL，雙蒸水2μL。在4°C連接過夜。然后轉化入大腸桿菌DH5α。4.重組質粒的原核表達鑒定挑取轉化生長好的單菌落，接種于氨芐青霉素(Amp)抗性的液體LB培養基中(58mL，50ng/ml)，37°C于搖床上200r/min培養6h以上。吸取1μL大腸桿菌DH5α菌液，進行PCR鑒定。5.質粒的抽提及酶切鑒定質粒抽提用QIApr印SpinMiniprepKit質粒抽提試劑盒(購自德國Qiagene公司)進行，主要操作步驟如下(1)第一次使用該質粒抽提試劑盒時，從-20°C取出RNA酶A(德國Qiagene公司的試劑盒自帶)全部加入到緩沖液(Buffer)Pl中，混勻后，做好標記置于4°C保存。將該試劑盒的其它試劑保存于室溫；(2)取PCR鑒定為陽性的菌液約1.5mL置于1.5mL離心管中，于室溫下8000rpm離心Imin；(3)加入250yLBufferP1，在旋渦振蕩器上振蕩直至打散細菌團塊為止，加入BufferP2250μL，輕輕上下混勻呈半透明狀，將離心管室溫下放置lmin，加入350μLBufferP3，上下顛倒數次混勻，可見有白色絮狀物出現，于室溫下13000rpm離心IOmin；(4)從試劑盒中取出DNA結合柱，插入到2mL離心管中(上述德國Qiagene公司提供的試劑盒提供)，做好標記。取上清于DNA結合柱中，室溫下13000rpm離心Imin；(5)棄流出液，加入750μLBufferPE，室溫下13000rpm離心Imin；(6)為進一步除去殘留BufferPE，室溫下13000rpm再離心Imin；(7)將結合柱移入一新的1.5ml離心管中，加入50μLBufferEB于柱中心，室溫下放置30min后，于室溫13000rpm離心lmin，為達到更好的抽提效果，可將離心管中的BufferEB取出加入到結合柱里再洗滌一次。質粒提取后進行濃度和純度測定并進行雙酶切鑒定。酶切結果如圖3所示，酶切后瓊脂糖電泳檢測，結合PCR鑒定結果，送菌液測序以鑒定重組子中插入序列的正確性，測序結果表明插入序列是目的序列，且未發生突變。實施例4豬檸檬酸脫氫酶IDH3i3基因上游5’側翼序列轉錄活性檢測方法的建、,111.細胞培養將豬腎細胞(PorcineKidneyCell，PK-15，2006年9月購于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，英文簡稱CCTCC)在10%新生牛血清的含雙抗DMEM(Dulbecco，sModifiedEagle，sMedium)培養基(購自美國Gibico公司)中，其培養條件為37°C，濃度為5%的C02。當細胞處于指數生長期時，進行傳代培養，操作如下用洗滌液快速洗滌細胞一次，加入2mL胰酶，37°C消化約2min，在顯微鏡下觀察到細胞已成球狀后立即棄去胰酶，向培養基中加入細胞生長培養基，并用吸管吹打細胞使其盡量以單個細胞的形式存在。將獲得的細胞懸液一部分留在細胞培養瓶中傳代培養，另一部分等體積分裝到24孔板中，置于培養箱中培養用于轉染。2.瞬時轉染當24孔板中細胞達到60%70%的匯合率時準備轉染。首先將重組質粒和pGL3-Basic載體(購自美國Promega公司)用BufferEB(購自美國Promega公司)稀釋成lOOng/yL，將內參照質粒載體pRL-TK(購自美國Promega公司)稀釋成20ι^/μ，稀釋后將兩者按體積比501的比例混合，取30μL混合質粒DNA和6μLLipofectamine2000分別加入150μLopti-MEM培養基(購自美國Invitrigen公司)中，輕輕混勻，室溫下靜置5min后將兩者混合均勻，再室溫靜置20min。取轉染液100μL加A24孔板的其中一個孔中，這樣每個重組質粒可保證3次重復。均勻混合后放入培養箱中溫育，6h后棄凈24孔板里液體，加入10%新生牛血清的無雙抗DMEM培養基繼續培養(美國Gibico公司)。24h后收集細胞。3.熒光素酶相對活性測定與分析使用雙熒光素酶測定活性，測定前，準備以下試劑(1)1X磷酸裂解緩沖液(PLB)，用購自美國Promega公司試劑盒提供的5XPLB與滅菌水按體積比14比例混合，每次使用前配置；(2)LARII(LuciferaseAssayReagentII熒光分析劑)，將美國Promega公司試劑盒提供的凍干熒光分析底物重懸于IOmLLARII中，混勻、分裝后做上標記置于_70°C保存備用；(3)Stop&Gi0eReagent，每次使用前配置，將50XStop&Gi0Substrate(終止劑)與Stop&GloBuffer(終止緩沖劑)按體積比為150混合。試劑配置完畢后進行熒光素酶活性測定，操作步驟如下(1)將上述24孔板中轉染有目的DNA的貼壁細胞用1XPBS洗滌一次，棄去殘液，加入100μL新鮮配制的IXPLB，室溫下，置于搖床上振蕩15min以裂解細胞；(2)將裂解液收集到1.5mL離心管，做好標記；(3)取若干個1.5mL離心管，均加入100μLLARII溶液(_70°C取出，室溫下融化)，(4)打開TD20/20照度計(購自美國Promega公司)電源開關，儀器自檢300s后，進入“home”主菜單，按下“O”設定空白，按下“setup”(設置)設定各種參數，包括Display(顯示):3s；integratetime(整合時間):15s；r印eat(重復)3。靈敏度選用默認值，設定好后返回“home”；(5)在“home”狀態下，在含IOOyLLARII溶液的1.5mL離心管中加入上述樣品20μL，用吸頭混勻后，放入樣品檢測池中，按“go”，儀器自動處理，計算出螢火蟲熒光素酶活力，顯示“ready”，此時取出1.5mL離心管，再加入100μL新鮮配制的Stop&GloReagent，混勻后，放回樣品檢測池中，按“go”，儀器便會再計算出海腎熒光素酶活力(內參照)，并計算出兩種熒光素酶活力比值，即熒光素酶相對活力。記錄結果，然后用同樣方法檢測下一個樣品。待全部測定結束將結果輸入Excel表格進行數據分析，繪制直方圖。結果如圖4所示。在所構建的豬檸檬酸脫氫酶IDH3β基因5’側翼序列的19個重組子中，除pGL-IB58、pGL-IB44和pGL_IB34外，其它重組子的熒光素酶活性與陰性對照均達到顯著(P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)，表明他們均具有啟動子活性；與陽性對照相比，PGL-IB279活性高很多，表明該基因的啟動子活性很高。從圖4可以看出，啟動子活性開始于PGL-IB82，然后雖然有些波動，但是活性一直下降直到-164bp處，之后活性又開始升高，直到-279bp處活性達到最高，這些表明維持該啟動子的基本活性區域位于_82bp到+16bp之間，從-82bp到-279bp之間的179bp區域具有最高的啟動子活性。另外，申請人在豬檸檬酸脫氫酶IDH3β基因上游_217bp處發現一處304bp的插入突變(見圖2)，根據此變異，申請人構建了pGL-IB395和pGL_IB395+304重組質粒，并根據同樣方法測定了它們的熒光素酶相對活性(結果見圖5)，結果表明，PGL-IB395質粒活性較pGL-IB395+304質粒低，且差異顯著(P<0.05)。主要參考文獻1.崔奎青等，水牛酪蛋白5'啟動區的克隆和序列分析廣西農業生物科學，2005，24(2):94-98。2.樊寶良等，水牛α-乳清蛋白基因部分序列的測定與分析.中國畜牧雜志，2005,41(7):21-24。3.簡清等，斑馬魚Mylz2啟動子的克隆與轉綠色熒光蛋白基因魚的構建，中國水產科學，2004，11(5):391-395。4.CamachoML,BrownRA,BoneteMJ,DansonMJ,HoughDlIsocitratedehydrogenasesfromHaloferaxvolcaniiandSulfolobussolfataricusenzymepurification,characterisationandN-terminalsequence.FEMSMicrobiolLett,1995,134:85-90.5.ChenSS.Redoxelectrodeformonitoringdehydrogenase-catalyzedreactions.ClinChimActa,1990,190(3)129-37.6.Hennighausen,L.Theprospectsfordomesticatingmilkproteingenes.JCellBiochem.1992,49(4):325_32.7.InoueH,TamurT,EharaN,NishitoA,NakayamaY,MaekawaM,ImadaK,TanakaH,InagakiK.BiochemicalandmolecularcharacterizationoftheNAD(+)-dependentisocitratedehydrogenasefromthechemolithotrophAcidithiobacillusthiooxidans.FEMSMicrobiolLett，2002，214:127-132.8.JuraJ,JuraJ,MurzynK,WegrzynP,ZarebskiA.Cloningandcharacterizationof5'upstreampromoterregionofratWAPgene.BI0CHIMICAETBIOPHYSICAACTA-GENESTRUCTUREANDEXPRESSION.2005,1727(1)58-649.KimIK,WakHJ,AhnJE,SoJN,LiuM,KohKN,KohGY.Molecularcloningandcharacterizationofanovelangiopoietinfamilyproteinangiopoietin-3.FEBSLett,1999，443(3):353_356.10.LiuYG,WhittierRF.ThermalasymmetricinterlacedPCRautomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromPlandYACclonesforchromosomewalking.Genomics.1995，25:674_68L11.OubrahimH，WangJ，StadtmanER,ChockPB.Molecularcloningandcharacterizationofmurinecaspase_12genepromoter.PROCEEDINGSOFTHENATIONALACADEMYOFSCIENCESOFTHEUNITEDSTATES0FAMERICA.2005，102(7):2322_2327.12.SiebertPD，ChenchikA，KelloggDE,LukyanovKA,LukyanovSA.AnimprovedPCRmethodforwalkinginunclonedgenomicDNA.NucleicAcidsRes.1995，23(6)1087-8.13.Whitelaw,CB.Nucleosomeorganisationofthebeta-lactoglobulingene.Transcriptioncomplexformation.AdvExpMedBiol.2000，480:147—53.權利要求一種豬異檸檬酸脫氫酶基因IDH3β的啟動子，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示。2.一種豬異檸檬酸脫氫酶基因IDH3β的啟動子，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO4所示。3.權利要求1或2所述的啟動子在豬遺傳改良中的應用。全文摘要本發明屬于豬的動物生物技術與育種領域，具體涉及豬異檸檬酸脫氫酶基因IDH3β的啟動子的克隆、活性分析和啟動子區突變研究。本發明的步驟包括從豬血液中提取基因組DNA，設計引物，采用TAIL-PCR技術經過兩輪擴增獲得豬IDH3β基因上游5’側翼2447bp的基因組堿基序列，并進行序列比較分析和遺傳變異檢測；采用5’端缺失策略擴增IDH3β基因上游5’側翼區，將獲得的DNA序列構建熒光素酶報告基因載體，測定其啟動子活性，鑒定IDH3β基因啟動子。本發明克隆的豬異檸檬酸脫氫酶基因IDH3β的啟動子的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1和SEQIDNO4所示。本發明為豬的遺傳改良應用提供了基因資源。文檔編號C12N15/10GK101974527SQ201010278620公開日2011年2月16日申請日期2010年9月10日優先權日2010年9月10日發明者任竹青,熊遠著,蔣思文,鄧昌彥申請人:華中農業大學