專利名稱：實時熒光定量pcr檢測基孔肯亞病毒核酸的方法
技術領域：
本發明提供一種利用實時熒光定量PCR檢測基孔肯亞病毒核酸的方法。
背景技術：
基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)是單股正鏈RNA病毒，屬于披膜病毒科 (Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)，引起基孔肯雅熱(Chikungunyafever，CHIK)。該 病為一種急性傳染病，通過伊蚊傳播給人，在臨床上以發熱、關節疼痛、皮疹和輕度出血為 特征。1953年首次從坦桑尼亞的1例發熱患者的血液中分離出基孔肯雅病毒。20世紀 60-90年代，在非洲中部和南部的許多國家該病均有流行，并分離到CHIK病毒，如蘇丹、烏 干達、剛果民主共和國、中非共和國、馬拉維、津巴布韋、肯尼亞和南非；西非的塞內加爾、貝 寧、幾內亞共和國、科特迪瓦和尼日利亞等；在東南亞，1999年印度尼西亞首次暴發CHIK， 2001-2003年此地再次出現該病流行；在印度洋島嶼，近幾年，印度洋島嶼出現大規模的 CHIK暴發流行。2005年，科摩羅島發生大暴發流行并迅速傳播到整個印度洋的其他島嶼； 在歐洲，2007年7月，意大利拉文納省的2個村莊發生CHIK ；2004-2007年，亞洲和非洲等 地區的CHIK暴發流行不斷發生，其中2006年全球共發生CHIK患者大約200萬例。值得注 意的是我國的臺灣地區在1967年和2006年曾發生過CHIK流行，2008年我國大陸首次發現 的CHIK輸入性病例。但截至目前我國尚無CHIK本土流行的確切報道。縱觀歷史，CHIK已 經成為全球區日益嚴重的公共衛生問題。目前，針對外來傳染病的實驗室快速檢測技術主要采用的是免疫學檢測及核酸檢 測技術，尤其以PCR技術為代表的核酸檢測技術，能夠非常靈敏的檢測出各種疫病病原體 的核酸。但是由于PCR擴增技術經常帶來特異性問題，各國科學家和技術人員都在PCR技術 基礎上，結合其它新技術，努力改善PCR技術的特異性和敏感度。近年來，基于PCR技術及 ABI Taqman探針雜交技術發展起來的實時熒光PCR技術極大地改善了傳統PCR技術的特異 性和敏感性以及抗污染的能力，已經越來越廣泛的應用到各種疫病的檢驗檢疫中。隨著探 針技術的進一步發展完善，一種新型的Hydro Easy Probes的出現，能夠有效的改進Taqman 探針本底信號高的缺點，并且進一步提高檢測的靈敏度。本發明擬采用新型HydroEasy Probes設計技術，開發基孔肯雅病毒的熒光PCR檢測診斷方法，為國境口岸的基孔肯雅病 毒的快速檢測提供有力保障。
發明內容
本發明的目的在于提供一種實時熒光定量PCR檢測基孔肯亞病毒核酸的方法。該 方法利用實時熒光定量PCR檢測技術，設計了一對引物和探針對病毒樣本進行實時定量檢 測。該方法檢測特異性好，靈敏度高。本發明實時熒光定量PCR檢測基孔肯亞病毒核酸的方法，首先包括獲得檢測基孔 肯亞病毒核酸的引物和探針的步驟，該步驟具體為(1)收集篩選基孔肯亞病毒全基因組序列，利用生物信息學軟件對其進行同源性比對，在其保守區設計引物；(2)根據PCR擴增 區域內的核苷酸序列設計特異性探針，并登錄GENEBANK中檢測探針的特異性；(3)對待檢 測物進行實時定量分析。在本發明上述方法中，所篩選的基孔肯亞病毒可以是NCBI公布的所有基孔肯亞 病毒全基因組序列。另外，本發明的方法中，可以利用DNASTAR軟件進行序列的同源性比 對。比對結果見
圖1。圖中陰影部分為全序列中某個高保守區。在本發明引物和探針設計中，首先在比對的序列保守區設計上下游引物，根據引 物設計原理，在保守區之間設計上游和下游引物，其中在下游引物的第5位和第25位存在 簡并性，設計位于擴增區域內的特異的探針，其中在探針的第19位和第21位存在簡并性。 引物和探針在合成時，探針5'端連接FAM熒光基團，3'端連接BHQ非熒光基團。引物的特 異性增強。引物和探針序列見表1。表 權利要求
實時熒光定量PCR檢測基孔肯亞病毒核酸的方法，其特征在于，該方法利用實時熒光定量PCR檢測技術，通過設計一對引物和探針對病毒樣本進行實時定量檢測，所設計引物和探針序列如下
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法包括引物和探針的獲得，對基孔肯 亞病毒核酸的檢測；其中，引物和探針的獲得步驟為(1)收集篩選基孔肯亞病毒全基因組 序列，利用生物信息學軟件進行同源性比對，并在其保守區設計引物，(2)根據PCR擴增區 域內的核苷酸序列設計特異性探針，并登錄 GENEBANK檢測探針的特異性；對基孔肯亞病毒 核酸的檢測步驟為首先提取病毒的核酸，然后利用所設計的引物和探針對待檢測物進行 實時熒光定量PCR檢測。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR擴增具體為配制一定組分濃度 的25 μ L PCR反應體系。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣本包括蚊蟲、蝙蝠、人血清及組織、細 胞培養液、野生靈長類、家畜等。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述實時熒光定量PCR檢測技術中，所述 探針上連接的熒光基團包括FAM-BHQ、FAM-TAMARA。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR反應適用于ABI實時PCR系統、 BioRad實時PCR檢測系統、Stratagene定量多聚酶鏈反應儀來完成。
全文摘要
本發明公開了一種實時熒光定量PCR檢測基孔肯亞病毒核酸的方法，該方法包括引物和探針的獲得及基孔肯亞病毒核酸的檢測。本發明具有特異性好，靈敏度高等優點。
文檔編號C12Q1/70GK101935715SQ20101027664
公開日2011年1月5日 申請日期2010年9月8日 優先權日2010年9月8日
發明者姚李四, 張曉龍, 燕清麗 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院