鳳眼蓮的遺傳轉化方法

專利名稱：鳳眼蓮的遺傳轉化方法
技術領域：
本發明涉及鳳眼蓮的遺傳轉化方法。
背景技術：
鳳眼蓮(Eichhornia crassipes)屬于種子植物門雨久花科鳳眼蓮屬，俗稱水浮蓮、水葫蘆。1901年，鳳眼蓮被作為觀賞植物引入中國，上個世紀五六十年代被作為豬飼料推廣，從此之后鳳眼蓮在中國一發不可收拾。由于鳳眼蓮十分喜肥，尤其是氮磷肥，因此目前廣泛存在于我國滇池、巢湖、太湖等很多水體富營養化的水域中。鳳眼蓮具有很強的富集 N/P等營養元素、多種重金屬、吸收降解酚和氰等凈化作用，同時鳳眼蓮提取物本身具有抑制藻類生長的效果。另外，鳳眼蓮還具有作為豬等家畜禽飼料、肥料、造紙和釀酒原料、產沼氣等諸多應用潛力。然而，鳳眼蓮的繁殖能力極其旺盛，一旦處于適合的環境，它便無序地繁殖、成為當地的入侵雜草，抑制其他物種、破壞生態多樣性，造成該區生態惡化。而且，因其繁殖力過于強盛和難以及時打撈，導致其在水中腐爛、被吸收的N、P等重新釋放于水體中，達不到去除污染源的凈化作用。特別是鳳眼蓮爆發成災時可覆蓋整個湖面和河流，堵塞河道，降低水中溶解氧濃度和水體透光度，致使水生動植物缺氧、缺光而死亡。因此，目前的鳳眼蓮不但沒有成為消除富營養化的凈化植物，反而成了生態入侵的惡性水生雜草，以及導致各地投入大量人、物和財力進行治理的對象。鳳眼蓮在水體環境修復與治理工程中，至今未獲得成功的關鍵原因在于一是生長繁殖過盛而難以控制所導致的二次污染成災問題；二是可回收利用的價值低、產業化難的問題。因此，通過植物基因工程手段，對鳳眼蓮加以遺傳工程改良，介導其高附加值，提高其回收利用的經濟價值，將有助于促進鳳眼蓮水體凈化的周轉頻率，推進其回收應用的產業化進程。由于鳳眼蓮是具有特殊習性的水生植物，其外植體極易褐化，愈傷組織誘導及分化尚無法實現，人工組培鳳眼蓮完成生活史、并進一步開展基因工程改良也十分困難。因此，鳳眼蓮的基因轉化一直未見獲得成功的報道，在國內外尚處于空白。目前，植物基因轉化方法主要分為兩種1)介導載體系統轉化(農桿菌介導法、脂質體介導法等)；幻直接遺傳轉化(基因槍法、PEG法、電擊法、顯微注射法、花粉管通道法和超聲波法等)(Hamilton C Μ. et al.，1996 ；Liu Y G. et al.，1999 ；Ohta Y. 1986 ；任永霞等，2005)。其中，花粉管通道法遺傳轉化不需要組織培養過程，操作相對簡單、容易。花粉管通道法的基本原理是在授粉后向子房注射目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中從柱頭到胚囊之間形成的花粉管通道，使外源DNA能沿著花粉管通道滲入，經過珠心進入胚囊，最終轉化尚不具備完整細胞壁的合子或早期胚胎細胞，使外源 DNA被整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發育而成為轉入外源基因的新個體，實現基因轉化的目的。然而，該方法實際包括的是一個以狹義授粉/受精為中心的過程，是一個非常復雜的生理現象，即包括花粉形成、傳粉、花粉萌發、花粉管伸長以及繼花粉管伸長之后的受精等過程，甚至還包括拒絕受精現象。因此，對于不同植物，需要選擇的轉化時期、轉化方法
4也存在較大的差別。口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth disease vimse, FMDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性疫病，世界動物衛生組織 (OIE)將其列為動物衛生法典中的A類疫病之首。傳統的滅活疫苗在該病的防控中起了重要作用。近年來隨著生物技術的發展，因其具備諸多可食疫苗的優點而成為國內外研究的熱點。國內外在口蹄疫轉基因植物疫苗的研究中已取得了可喜的成果，易感動物食用該轉基因植物后能夠產生免疫力，達到預防口蹄疫的目的。目前為止，用作轉基因植物疫苗的免疫原基因主要是FMDV的編碼結構蛋白VPl基因和編碼病毒衣殼蛋白的Pl基因、非結構蛋白2A、3C所共同組成的免疫原基因。1999年， Wigdorovitz A等將FMDV結構蛋白基因在苜蓿中有效表達，表達產物口服和注射都產生了免疫反應和保護。2001年，Carrillo C等將FMDV VPl基因在馬鈴薯中表達。水生植物鳳眼蓮，繁殖力強大，生物量高，具備成為優良生物反應器的潛質。然而， 由于其特殊的生理特點，很難進行轉基因研究，深度開發利用受到限制。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種雨久花科植物的遺傳轉化方法。本發明所提供的雨久花科植物的遺傳轉化方法，包括如下步驟在授粉后的雨久花科植物雌蕊中的花粉管開始萌發之后和花粉管通道閉合之前，將含有外源基因的重組質粒的溶液或含有外源基因的重組菌的溶液滴加到授粉后的柱頭上，使所述外源基因通過花粉管通道導入受精卵細胞，隨著受精卵細胞的生長發育，得到轉入所述外源基因的種子；所述滴加至少為一次。上述方法中，所述在授粉后的雨久花科植物雌蕊中的花粉管開始萌發之后至花粉管通道閉合之前為自授粉時計起第2小時到第6小時，優選為第池到第5h，具體為第3小時或第4小時或第5小時，所述授粉時為第O小時。所述方法中，所述滴加為二次；第二次滴加的時機為自第一次滴加時計起第0. 5 小時后，所述第一次滴加時計為第O時；第二次滴加的方法為將含有外源基因的重組質粒的溶液或含有外源基因的重組菌的溶液滴加到授粉后的柱頭上。上述方法中，每次滴加時，所述含有外源基因的重組質粒的溶液的滴加量為Ml， 所述含有外源基因的重組菌的溶液的滴加量為5ul。上述方法中，所述授粉是人工授粉；所述人工授粉的時間為一束花序上有50%以上的花朵展開八成以上；上述方法中，所述含有外源基因的重組質粒的溶液中重組質粒的濃度為IOOng/ μ l-200ng/y 1,具體為lOOng/μ 1 ；所述含有外源基因的重組菌的溶液的OD6tltl值為 1. 0-1. 2，具體為 1. 0。上述方法中，所述人工授粉的時間為上午9點-11點；上述方法中，所述含有外源基因的重組質粒的溶液由0. IXSSC緩沖液和所述含有外源基因的重組質粒組成；上述方法中，所述含有外源基因的重組菌的溶液由蔗糖、Silvet L-77、赤霉素、 6-糠基氨基嘌呤、所述含有外源基因的重組菌和水組成，蔗糖在溶液中的濃度為50g/L，
5Silvet L-77在溶液中的濃度為200 μ L/L，赤霉素在溶液中的濃度為5 μ g/L，6-糠基氨基嘌呤在溶液中的濃度為0. lmg/L ；所述含有外源基因的重組菌的溶液的pH值為5. 8。本發明的另一個目的是提供一種培育轉基因雨久花科植物的方法。本發明所提供的培育轉基因雨久花科植物的方法，包括如下步驟1)用上述任一所述方法得到轉入外源基因的雨久花科植物種子；2)搓傷種皮將石英砂與所述轉入外源基因的雨久花科植物種子混合，摩擦，搓傷種皮，得到搓傷種皮的種子；3)將所述搓傷種皮的種子進行消毒處理，得到消毒后的種子；4)將所述消毒后的種子進行培養，得到植物幼苗；5)對5葉齡的植物幼苗進行抗性篩選，得到轉入外源基因的雨久花科植物幼苗。上述培育轉基因雨久花科植物的方法中，所述步驟2、中，所述石英砂與所述轉入外源基因的雨久花科植物種子的質量比為10 15 1，具體為10 1，所述摩擦的時間為 5分鐘 8分鐘，具體為8分鐘；上述培育轉基因雨久花科植物的方法中，所述步驟幻中消毒處理的方法包括如下步驟將所述搓傷種皮的種子用無菌水清洗3次，無水乙醇浸泡lmin，無菌水洗滌3次， 加入10% (體積百分含量)的次氯酸鈉水溶液浸泡lOmin，無菌水洗滌6次；上述培育轉基因雨久花科植物的方法中，所述步驟4)中，所述培養的方法包括如下步驟將所述消毒后的種子接種于MS培養基，在光照周期為1 光照/ 黑暗、光強為 100ymol/m2 · s、濕度為50%、溫度為25°C的條件下培養；上述培育轉基因雨久花科植物的方法中，所述步驟幻中，所述抗性篩選的方法包括如下步驟用濃度為0.15%-0. 25% (體積百分比)或0.2% (體積百分比)的草胺膦水溶液噴灑所述5葉齡的植物幼苗，自植物幼苗開始出現5葉時計起，第1周時噴灑第一次， 第2周時噴灑第二次，第5周時檢測幼苗是否存活，存活的幼苗即為所述轉入外源基因的雨久花科植物抗性幼苗，植物幼苗開始出現5葉時計為第1周。上述培育轉基因雨久花科植物的方法中，所述含有外源基因的重組質粒是將所述外源基因插入載體PGII 0229的多克隆位點間得到的；上述培育轉基因雨久花科植物的方法中，所述含有外源基因的重組菌是將重組表達質粒導入宿主菌得到的；所述重組表達質粒是將所述外源基因插入載體PGII 0229的多克隆位點間得到的。上述遺傳轉化方法中和上述培育轉基因雨久花科植物的方法中，所述雨久花科植物為雨久花科鳳眼蓮屬植物；所述雨久花科鳳眼蓮屬植物為鳳眼蓮(Eichhornia crassipes)；上述遺傳轉化方法中和上述培育轉基因雨久花科植物的方法中，所述外源基因為 VPl基因或GFP基因，所述VPl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示；所述GFP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；上述遺傳轉化方法中和上述培育轉基因雨久花科植物的方法中，所述宿主菌為農桿菌 EHA105。本發明首次對鳳眼蓮(Eichhornia crassipes)進行了遺傳轉化。本發明的花粉管通道法轉化具有以下優點1、首次創建了水生植物鳳眼蓮的花粉管通道遺傳轉化方法，
6并且獲得了轉化基因的陽性植株及種子，實驗證明，本發明方法的轉化效率高，平均可達 1. 44%，且得到的轉化種子成苗率高。2、建立了鳳眼蓮在溫室及室外的人工培育及繁殖技術，完成了鳳眼蓮從種子萌發到收獲種子的完整生活周期。3、該轉化方法操作簡便，流程簡單、成本低，周期短，易于掌握和推廣應用，不需要組織培養體系及裝備復雜的實驗室設施， 常規育種工作者即可以掌握。因此，本發明方法在鳳眼蓮(Eichhornia crassipes)的遺傳改造領域將有廣闊的應用前景。


圖 1 為質粒 pGII 0229-VP1 和 pGII 0229-GFP 的結構圖。圖2為鳳眼蓮花組織發育進程及其授粉與基因轉化最佳時間的細胞組織學分析。圖3為鳳眼蓮的花粉管通道法基因轉化及其技術流程。圖4為轉基因鳳眼蓮的除草劑抗性篩選流程(A-C)及其移植培養⑶。圖5為轉化pGII 0229-VP1基因鳳眼蓮除草劑抗性植株的PCR驗證。圖6為轉化pGII 0229-GFP基因鳳眼蓮除草劑抗性植株的PCR及flfestern-blot 驗證。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所使用的試劑、材料等如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中所用表達載體的名稱為pGII 0229 (nos-BAR LB)，購自John Innes Centre (網站 http //www, ρ green, ac. uk/a-ord~fr. htm)。PBI121購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，產品目錄號為MCV032。農桿菌 EHA105 購自北京 biovector 公司(http //biovector. bloR. 163. com)，產品目錄號為Biovec-11。用于遺傳轉化的開花的鳳眼蓮(Eichhornia crassipes)來源云南省石屏縣城河人工濕地污水處理站。鳳眼蓮(Eichhornia crassipes)的種子采集自云南省石屏縣城河人工濕地污水處理站，鳳眼蓮幼苗可購自花鳥魚市場，其無性繁殖技術非常成熟，取發芽的幼枝培養既可獲得植株。實施例1、向鳳眼蓮中轉入VPl基因一、質粒 pGII 02^_VP1 的構建質粒pGII 0229-VP1的構建過程包括人工合成序列1所示VPl基因，并使其兩端帶有BamHI和McI的酶切位點序列；用BamHI和McI酶切合成的基因和載體pBI121，將酶切產物連接，得到重組載體PBI121-VP1，其中VPl基因與啟動子35S和終止子nos形成表達盒。用HindIII和EcoRI同時酶切PBI121-VP1和pGII 0229，連接，得到重組質粒，轉化大腸桿菌，抗性篩選，液體培養，提取質粒，酶切和測序鑒定。結果顯示，酶切結果正確；測得的VPl基因序列如序列1所示，表明構建的重組質粒正確，命名為pGII 0229-VP1 (圖1A)， 其中35S-VPl-nos片段直接插入到pGII 0229的HindIII和EcoRI間。pGII 0229載體能夠表達除草劑抗性基因，作為篩選標記，連接VPl后的重組質粒，能夠有效表達免疫原基因
7VPl蛋白。質粒pGII 0229-VP1的溶液pGII 0229-VP1質粒提取采用了 MN公司的 NucleoBond Midi型試劑盒，從含有pGII 0229-VP 1的大腸桿菌中大量制備質粒DNA。PCR 鑒定后，將質粒DNA用0. 1 X SSC緩沖液調制成濃度為IOOng/ μ l-200ng/ μ 1的轉化液，凍存于-20度，備用于轉化。二、轉化及培育和鑒定(一 )轉化方法I1、花蕾選擇選擇健壯、長勢良好的鳳眼蓮花序作為轉化受體。鳳眼蓮花序為穗狀，有3-12朵兩性花，每朵花有6個雄蕊，三長三短，花藥成熟后自然裂開，每朵花中有一個雌蕊，花柱單一呈線形，子房呈長卵圓形。2、人工授粉1)授粉時機的選擇在一束花序上有50%以上的花朵展開八成以上時進行人工授粉，選擇在上午9-11點進行。由于同一花序的花朵自下而上開放，整個花序在1-2天內開閉，對于未開放的花蕾，用尖嘴鑷或剪刀剝開未開放的花萼，露出雌蕊進行授粉。2)授粉方法I、在露水已干，花粉尚未散落時收集不同花序上的花粉，混勻后用毛筆尖輕抹涂抹在當天開放花朵的柱頭上。授粉完畢后在花序的下端掛上標牌注明授粉的時間。3、基因轉化(1)轉化時機的摸索對鳳眼蓮花組織發育進程進行細胞組織學分析，以確定最佳轉化時機。如圖2所示，A 為授粉后第1小時(授粉時記作第0小時)的花粉管萌發狀態；鳳眼蓮花粉在柱頭上開始萌發，并沿著花粉管通道伸長至柱頭內部，B 為授粉后第6小時(授粉時記作第0小時)的花粉管萌發狀態；花粉管生長、進入胚珠、完成受精后花粉管通道逐漸關閉。在花粉管萌發后開始遺傳轉化操作(原則上在花粉管萌發之后到花粉管通道閉合之前的任何時間可以實施轉化)，具體為從授粉時計時，在第池到第他之間均可以實施轉化，優選時間為第: 到第證之間，所述授粉時為第ο小時。(2)轉化自授粉時(授粉時為第0小時)計起，從第池到第6小時之間進行轉化操作，優選時間為第池到第證之間，本方法選擇了從第4h開始進行。用微量移液器在授粉后的柱頭上第一次滴入3微升質粒pGII 02^-VPl的溶液，0.5小時后(第一次滴入時計為第0時) 以相同的方法第二次滴入(為提高轉化率)。由于授粉后第二天花葶即彎入水中，為防止轉化后的種子遺失，轉化一小時后的花序及時套上40-60目的網袋，并固定于鳳眼蓮的莖或葉柄上。每次滴加時，質粒pGII 0229-VP1的溶液的滴加量為!3ul，質粒濃度為lOOng/μ 1 ； 質粒pGII 0229-VP1的溶液由0. IXSSC緩沖液和質粒pGII 0229-VP1組成；0. IXSSC緩沖液的組成氯化鈉0. 15M，檸檬酸鈉0. 015M。質粒pGII 02^-VPl通過花粉管通道導入受精卵細胞，隨著受精卵細胞的生長發育，得到轉入質粒pGII 0229-VP1的種子。
4、種子發育及收獲轉化一周后，肉眼即可觀察到子房開始膨大，40-50天后，蒴果呈卵形，顏色變黃褐色，表明此時種子已成熟，可采收晾干。果皮裂開散出種子，種子呈棗核形，褐色或黃褐色，存儲于干燥器中，可長年保存。鳳眼蓮的花粉管通道法遺傳轉化流程見圖3(A 即將開花的鳳眼蓮，B 鳳眼蓮開始開花，C 用毛筆進行人工授粉，D 向柱頭上滴入外源DNA溶液，E 將轉化后的花序套袋，并防止其扎入水中，F 種子成熟后的花序，G 剝出成熟的鳳眼蓮種子)。(二)篩選及鑒定質粒pGII 0229-VP1上含有除草劑抗性標記基因(BAR)，通過該抗性標記篩選轉基因種子，對獲得的抗性幼苗進行分子檢測。1、建立轉基因鳳眼蓮種子的高效萌發體系。在自然界，鳳眼蓮主要以無性繁殖為主，兼有性生殖。由于鳳眼蓮種子的結實和休眠習性非常特殊，休眠期可達15年，且不經特殊處理則很難萌發成苗和實施篩選。為了對轉基因種子實施大規模篩選，需要建立高效萌發成苗的技術平臺。在嘗試了一系列化學、物理和機械等多種方法后，最終確定如下種子萌發方法用石英砂搓傷種皮將石英砂與種子以10 1的質量比混合后包裹于軟布中，輕柔摩擦8分鐘，得到搓傷種皮的種子，經摩擦的種皮產生多處傷口，利于種子吸水萌發；化學藥物消毒處理取搓傷種皮的種子放于2ml離心管中，無菌水清洗3次，無水乙醇浸泡lmin，無菌水洗滌3次，加入10% (體積百分比)的次氯酸鈉水溶液浸泡lOmin， 然后再以無菌水洗滌6次即可用于播種；催芽萌發成苗將所述消毒后的種子接種于MS培養基，在光照周期為1 光照 /8h黑暗、光強為lOOymol/m2 · s、濕度為50%、溫度為25°C的條件下培養；種子萌發判定標準胚根突破種皮，扎入培養基，子葉展開。統計種子萌發率，種子萌發率達到80%。本方法為實施轉基因鳳眼蓮種子高通量的篩選與鑒定提供了技術保障。2、轉基因鳳眼蓮幼苗的除草劑抗性篩選(1)除草劑(BASTA)抗性篩選濃度的摸索及篩選時機的確定鳳眼蓮幼苗在培養基上生長至5葉齡時，進行BASTA篩選。為了確定篩選濃度，首先以野生型為實驗材料，篩選濃度(體積百分比)分別設定為0. 1%,0. 15%,0. 2%,0. 25% 和0. 3%。操作具體過程如下在超凈工作臺中打開培養皿，采用不同濃度的BASTA溶液分別對葉面進行噴灑或涂抹，一周后重復一次。經培養3周后，檢測幼苗的生長狀況，以幼苗完全枯死的BASTA濃度作為實施篩選的處理濃度。實驗結果(如圖4A所示)顯示，野生型幼苗在0. 15%以上(V/V)濃度處理即可枯死，為了獲得更嚴格的篩選結果，本方法選擇了 0.2%作為篩選濃度。(2)抗性篩選方法用濃度為0. 2%的BASTA水溶液噴灑或涂抹5葉齡的植物幼苗，自植物幼苗開始出現5葉時計起，第1周時噴灑第一次，第2周時噴灑第二次，第5周時檢測幼苗是否存活，正常存活的幼苗即為抗性幼苗，植物幼苗開始出現5葉時為第1周。BASTA的化學名稱為4_[羥基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸，中文名稱為草胺膦；購自拜耳公司，產品目錄號為05936098。
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結果，不具除草劑抗性苗或未轉基因植株枯死而被淘汰(圖4B)，有35株幼苗為 BASTA抗性幼苗。3、抗性幼苗的分子生物學檢測。分別從上述抗性篩選陽性的幼苗中提取總DNA，分別用如下引物進行PCR擴增，同時以陽性質粒pGII 0229-VP1和野生型鳳眼蓮為對照。除草劑基因(BAR)弓丨物ATTTCGGTGACGGGCAGGAC,GCACCATCGTCAACCACTACATC。豬口蹄疫病毒疫苗(VPl)基因引物TTTTGAATTCATGACCACCTCTGCGGGC,GCGCCTGCAGTTACAGAAGCTGTTTTGCGGGT。結果如圖5所示(A 根據除草劑基因(ΒΑ 序列設計引物進行PCR檢測，B 根據豬口蹄疫病毒疫苗(VPl)基因序列設計引物進行PCR檢測。其中Ρ為陽性對照，N為陰性水對照，1-35為除草劑篩選獲得的抗性植株)。在35株抗性篩選苗中，有16株幼苗對BAR和VPl兩種基因的PCR檢測結果均為陽性，表明16株幼苗為轉化VPl基因的陽性植株(圖5)。將除草劑基因(BAR)檢測陽性、且豬口蹄疫病毒疫苗(VPl)基因檢測陽性的苗作為陽性苗。結果轉化效率為1.71%。轉化效率的計算公式為轉化效率=分子生物學鑒定陽性苗數/供BASTA篩選幼苗數(936株)。表明所創建的花粉管通道法轉化鳳眼蓮技術的成功有效。4、陽性幼苗的培育。在超凈工作臺中，將篩選獲得的陽性幼苗移入含MS培養基的三角瓶內，繼續在光照周期為IWi光照/8h黑暗、光強為100 μ mol/m2 *s、濕度為50%、溫度為25°C的條件下培養；培養2-3周的幼苗如圖4C ；然后進行土壤移植，移植所需的營養土必需提前浸透水分， 并且為了適應鳳眼蓮的生活習性，營養土表面要求有3-5cm的水層，土壤培養一個月開始分蘗增殖，獲得健壯繁茂的鳳眼蓮植株(圖4D)。統計成活率結果，分子檢測陽性苗的成活率為100%。5、陽性株系Tl代種子的收獲陽性植株發育至開花期開花時進行人工授粉，以保證結實率，于次日套入網袋中，以防花序扎入水中。待種子發育成熟后，收獲晾干種子(圖 4D)。方法II(一)轉化1、花蕾選擇與實施例1中方法I相同。2、人工授粉1)授粉時機的選擇與實施例1中方法I相同。2)授粉方法與實施例1中方法I相同。3、基因轉化自授粉時(授粉時為第0小時)計起，本方法選擇了從第池開始進行轉化操作。其他條件及轉化方法與實施例1中方法I相同。
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4、種子發育及收獲與實施例1中方法I相同。(二)篩選及鑒定1、建立轉基因鳳眼蓮種子的高效萌發體系。用石英砂搓傷種皮與實施例1中方法I相同。化學藥物消毒處理與實施例1中方法I相同。催芽萌發成苗與實施例1中方法I相同。統計種子萌發率，結果與實施例1中方法I無顯著差異。2、轉基因鳳眼蓮幼苗的除草劑抗性篩選與實施例1中方法I相同。3、抗性幼苗的分子生物學檢測與實施例1中方法I相同。采用本方法的轉化效率，結果與實施例1中方法I無顯著差異。4、陽性幼苗的培育與實施例1中方法I相同。采用本方法的成活率，結果與實施例1中方法I無顯著差異。5、陽性株系Tl代種子的收獲與實施例1中方法I相同。方法III(一)轉化1、花蕾選擇與實施例1中方法I相同。2、人工授粉1)授粉時機的選擇與實施例1中方法I相同。2)授粉方法與實施例1中方法I相同。3、基因轉化自授粉時(授粉時為第0小時)計起，本方法選擇了從第證開始進行轉化操作。其他條件及轉化方法與實施例1中方法I相同。4、種子發育及收獲與實施例1中方法I相同。(二)篩選及鑒定1、建立轉基因鳳眼蓮種子的高效萌發體系。用石英砂搓傷種皮與實施例1中方法I相同。化學藥物消毒處理與實施例1中方法I相同。催芽萌發成苗與實施例1中方法I相同。統計種子萌發率，結果與實施例1中方法I無顯著差異。2、轉基因鳳眼蓮幼苗的除草劑抗性篩選與實施例1中方法I相同。3、抗性幼苗的分子生物學檢測與實施例1中方法I相同。采用本方法的轉化效率，結果與實施例1中方法I無顯著差異。4、陽性幼苗的培育與實施例1中方法I相同。采用本方法的成活率，結果與實施例1中方法I無顯著差異。5、陽性株系Tl代種子的收獲與實施例1中方法I相同。實施實例2、植物表達質粒pGII 0229-GFP轉化鳳眼蓮。一、質粒 pGII 02^-GFP 的構建質粒pGII 0229-GFP的構建方法人工合成序列2所示GFP基因，并使其兩端帶有^CbaI和Mel的酶切位點序列；用)(bal和Mel酶切合成的基因和載體pBI121，將酶
11切產物連接，得到重組載體PBI121-GFP，其中GFP基因與啟動子35S和終止子nos形成表達盒。用HindIII和EcoRI同時酶切PBI121-GFP和pGII 0229，連接，得到重組載體，轉化大腸桿菌，抗性篩選，液體培養，提取質粒，酶切和測序鑒定，結果酶切結果正確，測得的 GFP基因序列如序列2所示，表明構建的重組質粒正確，命名為pGII 0229-GFP(圖IB)，其中35S-GFP-nos片段直接插入到pGII 0229的HindIII和EcoRI間。pGII 0229載體能夠表達除草劑抗性基因，作為篩選標記，連接GFP后的重組質粒，能夠有效表達綠色熒光蛋白 (GFP)。質粒pGII 02^_GFP構建完成后，轉化農桿菌EHA 105，經卡那霉素和利福平篩選、PCR鑒定后，獲得含有目的質粒DNA的農桿菌菌株，于-80度保存菌種，用于下一步的植株轉化。將含有pGII 02^-GFP表達質粒的農桿菌以1 100的比例接菌于LB液體培養基(含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平)中，28°C、230rpm/h振蕩培養16h，再以1 100 的比例轉接于新鮮LB培養液、同樣條件培養12小時(( _在1.5-2.0)。經離心收集菌體后，加入等體積的滲透培養基重懸至0D_為1. 0，備用于轉化。滲透培養基組成由蔗糖、Silvet L_77、GA、KT和水組成，蔗糖在滲透培養中的濃度為50g/L，Silvet L-77在滲透培養中的濃度為200μ L/L，赤霉素(GA)在滲透培養中的濃度為5yg/L，激動素(KT，6-糠基氨基嘌呤)在滲透培養中的濃度為0. lmg/L;pH值為5.8。二、轉化及培育和鑒定(一)轉化方法I1、花蕾選擇與實施例1中方法I相同。2、人工授粉1)授粉時機的選擇與實施例1中方法I相同。2)授粉方法與實施例1中方法I相同。3、基因轉化自授粉時(授粉時為第0小時)計起，從第池到第他之間可以進行轉化操作，優選時間為從第池到第證之間，本方法選擇了從第4h開始進行轉化。用微量移液器在授粉后的柱頭上第一次滴入5微升含有質粒pGII 02^-GFP的重組菌的溶液，0.5小時后(第一次滴入時計為第0時)以相同的方法滴入第二次(為提高轉化率)。由于授粉后第二天花葶即彎入水中，為防止轉化后的種子遺失，轉化一小時后的花序及時套上40-60目的網袋， 并固定于鳳眼蓮的莖或葉柄上。每次滴加時，所述含有質粒pGII 0229-GFP的重組菌的溶液的滴加量為5ul ；含有質粒pGII 0229-GFP的重組菌的溶液的OD6tltl值為1. 0 ；含有質粒pGII 0229-GFP的重組菌的溶液由蔗糖、Silvet L-77、GA、KT和所述含有外源基因的重組菌組成，蔗糖在溶液中的濃度為50g/L，Silvet L-77在溶液中的濃度為 200 μ L/L,赤霉素(GA)在溶液中的濃度為5 μ g/L，激動素(KT，6-糠基氨基嘌呤)在溶液中的濃度為0. lmg/L ；所述含有外源基因的重組菌的溶液的pH值為5. 8。4、種子發育及收獲轉化一周后，肉眼即可觀察到子房開始膨大，40-50天后，蒴果呈卵形，顏色變黃褐色，表明此時種子已成熟，可采收晾干。果皮裂開散出種子，種子呈棗核形，褐色或黃褐色，存儲于干燥器中，可長年保存。
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(二)篩選及鑒定質粒pGII 0229-GFP上含有除草劑抗性標記基因(BAR)，通過該抗性標記篩選轉基因種子，對獲得的抗性幼苗進行分子檢測。1、種子萌發方法用石英砂搓傷種皮與實施例1中方法I相同。化學藥物消毒處理與實施例1中方法I相同。催芽萌發成苗與實施例1中方法I相同。種子萌發判定標準與實施例1中方法I相同。統計種子萌發率結果，與實施例1中方法I無顯著差異。2、轉基因鳳眼蓮幼苗的除草劑抗性篩選所采用除草劑、抗性篩選條件及篩選方法均與實施例1中方法I相同。抗性篩選結果，有31株幼苗為BASTA抗性幼苗。3、抗性幼苗的分子生物學檢測。(I)PCR 鑒定分別從上述抗性篩選陽性的幼苗中提取總DNA，分別用如下引物進行PCR擴增，同時以陽性質粒PGII 0229-GFP和野生型鳳眼蓮為對照。GFP基因引物GATGGTGATGTTAATGGGCA, GCAGATTGTGTGGACAGGTA結果在31株抗性幼苗中，共得到10株幼苗為PCR鑒定陽性，表明該10株幼苗為轉化pGII 0229-GFP基因的陽性植株(部分結果見圖6A所示P為陽性對照，WT為野生型植株，28-33為抗性篩選植株)。(2) Western-blot 驗證分別從PCR陽性幼苗和野生型植株中提取總蛋白進行ffestern-blot檢測，其中一抗為GFP多克隆抗體，二抗為堿性磷酸酶標記的羊抗兔抗體。GFP多克隆抗體購自天根生化科技(北京)有限公司，產品目錄號為AB105-02。圖6B顯示了 Western-blot檢測的部分結果，M為蛋白分子量標準，WT為野生型植株，28-33為抗性篩選植株。Western-blot驗證結果顯示，在轉基因陽性植株四、30、31和 33中檢測出與GFP抗體結合的表達蛋白(箭頭標注)，表明外源基因GFP在轉基因鳳眼蓮中有效表達出GFP蛋白。將GFP基因檢測陽性，且ffestern-blot驗證有效表達目的蛋白的植株作為陽性
田ο結果轉化效率為1. 16%。轉化效率的計算公式為轉化效率=分子生物學鑒定陽性苗數/供BASTA抗性篩選幼苗數(862株)。4、陽性幼苗的培育與實施例1中方法I相同。統計成活率結果，與實施例1中方法I無顯著差異。5、陽性株系Tl代種子的收獲與實施例1中方法I相同。方法II(一)轉化1、花蕾選擇與實施例1中方法I相同。
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2、人工授粉1)授粉時機的選擇與實施例1中方法I相同。2)授粉方法與實施例1中方法I相同。3、基因轉化自授粉時(授粉時為第0小時)計起，本方法選擇了從第池開始進行轉化操作。 其他條件及轉化方法與實施例2中方法I相同。4、種子發育及收獲與實施例1中方法I相同。(二)篩選及鑒定1、建立轉基因鳳眼蓮種子的高效萌發體系。用石英砂搓傷種皮與實施例1中方法I相同。化學藥物消毒處理與實施例1中方法I相同。催芽萌發成苗與實施例1中方法I相同。種子萌發率，結果與實施例1中方法I無顯著差異。2、轉基因鳳眼蓮幼苗的除草劑抗性篩選與實施例1中方法I相同。3、抗性幼苗的分子生物學檢測與實施例2中方法I相同。轉化效率，結果與實施例2中方法I無顯著差異。4、陽性幼苗的培育與實施例1中方法I相同。成活率，結果與實施例1中方法I無顯著差異。5、陽性株系Tl代種子的收獲與實施例1中方法I相同。方法III(一)轉化1、花蕾選擇與實施例1中方法I相同。2、人工授粉1)授粉時機的選擇與實施例1中方法I相同。2)授粉方法與實施例1中方法I相同。3、基因轉化自授粉時(授粉時為第0小時)計起，本方法選擇了從第證開始進行轉化操作。 其他條件及轉化方法與實施例2中方法I相同。4、種子發育及收獲與實施例1中方法I相同。(二)篩選及鑒定1、建立轉基因鳳眼蓮種子的高效萌發體系。用石英砂搓傷種皮與實施例1中方法I相同。化學藥物消毒處理與實施例1中方法I相同。催芽萌發成苗與實施例1中方法I相同。種子萌發率，結果與實施例1中方法I無顯著差異。2、轉基因鳳眼蓮幼苗的除草劑抗性篩選與實施例1中方法I相同。3、抗性幼苗的分子生物學檢測與實施例2中方法I相同。轉化效率，結果與實施例2中方法I無顯著差異。4、陽性幼苗的培育。與實施例1中方法I相同。
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成活率，結果與實施例1中方法I無顯著差異。5、陽性株系Tl代種子的收獲與實施例1中方法I相同。
權利要求
1.一種雨久花科植物的遺傳轉化方法，包括如下步驟在授粉后的雨久花科植物雌蕊中的花粉管開始萌發之后和花粉管通道閉合之前，將含有外源基因的重組質粒的溶液或含有外源基因的重組菌的溶液滴加到授粉后的柱頭上，使所述外源基因通過花粉管通道導入受精卵細胞，隨著受精卵細胞的生長發育，得到轉入所述外源基因的種子；所述滴加至少為一次。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述在授粉后的雨久花科植物雌蕊中的花粉管開始萌發之后至花粉管通道閉合之前為自授粉時計起第2小時到第6小時，優選為第池到第5h，具體為第3小時或第4小時或第5小時，所述授粉時為第0小時。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法中，所述滴加為二次；第二次滴加的時機為自第一次滴加時計起第0. 5小時后，所述第一次滴加時計為第0時。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于每次滴加時，所述含有外源基因的重組質粒的溶液的滴加量為:3ul，所述含有外源基因的重組菌的溶液的滴加量為5ul。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述授粉是人工授粉；所述人工授粉的時間為一束花序上有50 %以上的花朵展開八成以上；所述含有外源基因的重組質粒的溶液中重組質粒的濃度為lOOng/μ l-200ng/y 1，具體為lOOng/μ 1 ；所述含有外源基因的重組菌的溶液的OD6tltl值為1. 0-1. 2，具體為1. 0。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述人工授粉的時間為上午9點-11點所述含有外源基因的重組質粒的溶液由0. IXSSC緩沖液和所述含有外源基因的重組質粒組成；所述含有外源基因的重組菌的溶液由蔗糖、Silvet L-77、赤霉素、6-糠基氨基嘌呤、所述含有外源基因的重組菌和水組成，蔗糖在溶液中的濃度為50g/L，Silvet L-77在溶液中的濃度為200 μ L/L，赤霉素在溶液中的濃度為5 μ g/L，6-糠基氨基嘌呤在溶液中的濃度為 0. lmg/L ；所述含有外源基因的重組菌的溶液的pH值為5. 8。
7.一種培育轉基因雨久花科植物的方法，包括如下步驟1)用權利要求1-6中任一所述方法得到轉入外源基因的雨久花科植物種子；2)搓傷種皮將石英砂與所述轉入外源基因的雨久花科植物種子混合，摩擦，搓傷種皮，得到搓傷種皮的種子；3)將所述搓傷種皮的種子進行消毒處理，得到消毒后的種子；4)將所述消毒后的種子進行培養，得到植物幼苗；5)對5葉齡的植物幼苗進行抗性篩選，得到轉入外源基因的雨久花科植物幼苗。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟幻中，所述石英砂與所述轉入外源基因的雨久花科植物種子的質量比為 10 15 1，具體為10 1，所述摩擦的時間為5分鐘 8分鐘，具體為8分鐘；所述步驟幻中消毒處理的方法包括如下步驟將所述搓傷種皮的種子用無菌水清洗3 次，無水乙醇浸泡lmin，無菌水洗滌3次，加入10% (體積百分含量)的次氯酸鈉水溶液浸泡lOmin，無菌水洗滌6次；所述步驟4)中，所述培養的方法包括如下步驟將所述消毒后的種子接種于MS培養基，在光照周期為16h光照/8h黑暗、光強為100 μ mol/m2 · s、濕度為50 %、溫度為25 V的條件下培養；所述步驟幻中，所述抗性篩選的方法包括如下步驟用濃度為0. 15% -0. 25% (體積百分比)或0. 2% (體積百分比)的草胺膦水溶液噴灑所述5葉齡的植物幼苗，自植物幼苗開始出現5葉時計起，第1周時噴灑第一次，第2周時噴灑第二次，第5周時檢測幼苗是否存活，存活的幼苗即為所述轉入外源基因的雨久花科植物抗性幼苗，植物幼苗開始出現5 葉時計為第1周。
9.根據權利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述含有外源基因的重組質粒是將所述外源基因插入載體PGII 0229的多克隆位點間得到的；所述含有外源基因的重組菌是將重組表達質粒導入宿主菌得到的；所述重組表達質粒是將所述外源基因插入載體PGII 0229的多克隆位點間得到的。
10.根據權利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于所述雨久花科植物為雨久花科鳳眼蓮屬植物；所述雨久花科鳳眼蓮屬植物為鳳眼蓮(Eichhornia crassipes)；所述外源基因為VPl基因或GFP基因，所述VPl基因的核苷酸序列如SEQ IDNO 1所示；所述GFP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；所述宿主菌為農桿菌EHA105。
全文摘要
本發明公開了鳳眼蓮的遺傳轉化方法。該方法包括如下步驟在授粉后的雨久花科植物雌蕊中的花粉管開始萌發之后和花粉管通道閉合之前，將含有外源基因的重組質粒的溶液或含有外源基因的重組菌的溶液滴加到授粉后的柱頭上，使所述外源基因通過花粉管通道導入受精卵細胞，隨著受精卵細胞的生長發育，得到轉入所述外源基因的種子。實驗證明，本發明方法的轉化效率高，平均轉化率可達1.44％，且得到的轉化種子成苗率高。因此，本發明方法在鳳眼蓮(Eichhomia crassipes)的遺傳改良領域將有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/42GK102399812SQ20101027608
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月7日 優先權日2010年9月7日
發明者于祥春, 付力文, 任嬌, 何善平, 孔雙蕾, 安成才, 宋蓮芬, 張旭, 張磊, 張起濤, 李艷東, 楊揚, 鄔倩, 高超, 黃國維, 黃萍 申請人:北京大學