一種與乳腺癌相關的血清/血漿miRNA標志物及其應用的制作方法

專利名稱：一種與乳腺癌相關的血清/血漿miRNA標志物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程及腫瘤學領域，涉及一種與乳腺癌相關的血清/血漿miRNA 標志物及其應用。
背景技術：
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。據估計，全球2002年新發乳腺癌病例達115萬， 占女性全部惡性腫瘤發病的23%，預計2010年將達到140-150萬。在我國，乳腺癌的發病 率與西方國家相比較低，但近二十年來，其呈現顯著增長趨勢，平均年增長率達3-4%，遠遠 高于0.5%的世界平均增長水平。雖然乳腺癌的預后較好，但是由于其發病率較高，仍然是 女性因癌癥死亡的首要原因。在我國北京，上海，天津等城市乳腺癌發病率已高居女性惡性 腫瘤發病的第一位、第二位。在2000年到2005年這5年間，我國女性乳腺癌患者增加了 38. 5%，每年因乳腺癌死亡的女性達1. 3萬人。乳腺癌已成為威脅我國女性健康的首要惡 性腫瘤，是亟待解決的重大公共衛生問題。乳腺癌目前雖無特殊的預防措施，但是若能早期發現、早期診斷、早期治療，預后 情況一般較好。所以，當前及將來相當一段時間內，爭取早期診斷仍是乳腺癌防治的一項基 本策略。目前早期診斷乳腺癌的方式主要有乳腺自檢，乳腺鉬靶X線攝影、乳腺彩色多譜勒 超聲檢查、乳腺導管內視鏡檢查、乳腺導管灌洗、CT和磁共振等，若有無法辨別的腫塊或膿 腫可進行細胞學穿刺檢查。盡管近年來乳腺癌的診斷水平不斷上升，但真正較為成熟或有 較好應用前景的乳腺癌診斷手段尚不多，有些早期乳腺癌患者由于腫塊較小，或浸潤較輕、 呈膨脹性生長、表現為光滑、活動、邊界清楚，與良性腫瘤不易區別。此外，由于涉及社會文 化倫理等方面問題，一些年輕女性對于乳腺檢查容易忽視或產生抗拒心理，不但不能保證 診斷對癌癥患者診斷的準確性，對于處于早期階段的乳腺癌患者，尤其是年輕患者的診斷 能力更為有限。因此，我們亟需發現更加明確而有效的生物標志物，對乳腺癌做出明確的早 期診斷，這將有助于乳腺癌患者做出早期治療，提高生存率。MicroRNAs (即miRNAs)是近年來腫瘤分子生物學研究領域的一個熱點，它的成熟 狀態是一類長約19-23個核苷酸的小單鏈RNA分子，進化上具有高度保守性。它廣泛存在 于真核生物中，是一組不編碼蛋白質的短序列RNA，其本身不具有開放閱讀框(ORF)。MiRNA 的主要功能是調節生物體內在的與機體生長、發育、疾病發生過程有關的基因的表達。自從 參與調控線蟲時序發育的lin-4與let-7被發現以來，miRNA分別在2002年和2003年兩度 入選Science雜志年度十大科技突破。2005年預測miRNAs至少能調控5300個人類基因， 即所有基因的30%。隨著研究的深入，越來越多的miRNAs不斷被發現。聚光燈下的miRNA 已經逐步擺脫了 DNA光芒的掩蓋，從“配角”變成“主角”，并且對DNA的中心地位提出了新 的挑戰。近年來，miRNA與腫瘤的關系已經成為研究的熱點和重點，已經發現miRNA通過負 調控基因的表達與肺癌，乳腺癌，胃癌，乳腺癌等的發病高度相關。研究已經證實血清/血漿中存在幾百種的miRNAs，這些小分子RNAs性質穩定、 含量豐富、易于定量檢測，且存在顯著的疾病特異性。現有的成熟的技術，包括定性和定量miRNA分子的技術，表明利用血清miRNAs作為分子生物標志物的方法比傳統的特異蛋白分 子標記方法將更加有效，為生物標志物開拓了新境界。然而，目前還沒有用于乳腺癌診斷的較為穩定的生物標志物的報道，若能篩選出 乳腺癌異常表達的血清/血漿miRNAs作為生物標志物，并研制相應的診斷試劑盒，對我國 乳腺癌的診斷現狀必將是一次有力的推動。

發明內容
本發明的首要目的是針對上述技術問題，提出一種與乳腺癌相關的血清/血漿 miRNA標志物。本發明的第二個目的是提供上述血清/血漿miRNA標志物的引物。本發明的第三個目的是提供上述血清/血漿miRNA標志物及其引物在制備乳腺癌 輔助診斷試劑盒中的應用。本發明第四個目的是提供輔助乳腺癌診斷的試劑盒。發明人通過分離和研究乳腺癌患者及與其年齡匹配的健康女性對照血清/血漿 中的miRNAs，尋找一組與乳腺癌高度相關的高特異性和敏感性的miRNAs，并研制出可便于 臨床應用的乳腺癌診斷試劑盒，為乳腺癌的篩查和診斷提供數據支持，為發現具有潛在治 療價值的新型小分子藥物提供數據支持。本發明的目的是通過下列技術方案實現的一種與乳腺癌相關的血清/血漿miRNA標志物，該標志物為miR_16、miR_25、 miR-222 和 miR-324_3p 的組合。所述的血清/血漿miRNA標志物的引物，這些引物為miR-16 的引物為 SEQ ID No. 19 和 SEQ ID No. 20 ；miR-25 的引物為 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；miR-222 的引物為 SEQ ID No. 17 和 SEQ ID No. 18 ；miR-324_3p 的引物為 SEQ ID No. 13 和 SEQ ID No. 14。所述的血清/血漿miRNA標志物在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中的應用。所述血清/血漿miRNA標志物的引物在制備乳腺癌診斷試劑盒中的應用。一種乳腺癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測血清/血漿中miR-16、miR-25、 miR-222 和 miR-324_3p。所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有血清/血漿miRNA中miR-16、miR-25和 miR-324-3p 的引物。所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有的血清/血漿miRNA標志物的引物為miR-16 的引物為 SEQ ID No. 19 和 SEQ ID No. 20 ；miR-25 的引物為 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；miR-222 的引物為 SEQ ID No. 17 和 SEQ ID No. 18 ；miR-324_3p 的引物為 SEQ ID No. 13 和 SEQ ID No. 14。所述診斷試劑盒還可以包括PCR反應常用的酶和試劑，如逆轉錄酶，緩沖液， dNTPs, MgCl2, DEPC水和Taq酶等；還可以含有標準品和/或對照品。具體地說，本發明解決問題的技術方案包括(1)建立統一標準的標本庫和數據 庫以標準操作程序(SOP)采集符合標準的血液樣本，系統收集完整的人口學資料和臨床 資料。(2)血清/血漿miRNA差異表達譜分析選擇乳腺癌病例、與乳腺癌病例年齡匹配的健康女性對照，檢測其血清/血漿miRNA表達譜及含量，分析乳腺癌病例和健康女性對照 間血清/血漿miRNA的共性和特性，篩選差異表達miRNAs，進行進一步大樣本多階段驗證。 (3)對已篩選的血清/血漿差異表達miRNAs在大樣本人群中進行定量分析，確定乳腺癌發 病相關血清/血漿miRNAs (4)血清/血漿miRNA篩查和診斷試劑盒的研制根據乳腺癌病 例和健康女性對照的特異血清/血漿miRNA開發miRNAs診斷試劑盒。本發明人以標準操作程序(SOP)采集符合標準的血液樣本，系統收集完整的人口 學資料、臨床資料等(這些資料可用于判斷疾病進展，并控制疾病分期、患者年齡等因素 對于發病的影響)，并采用了 RT-PCR、Real-time PCR方法、Solexa測序技術、TaqMan Low DensityArray (TLDA)芯片檢測等。具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分1.研究樣本的選擇(1)經病理學明確診斷的乳腺癌病例(2)采血前未經過手術和放化療，無手術前放化療(3)與病例年齡匹配的健康女性對照本研究共采用196例符合標準的樣本進行研究。2. Trizol 試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)和 miRNeasy Mini Kit (QIAGEN 公司) 提取血清/血漿總RNA，按常規方法操作。通常能得到 5yg RNA/50ml血清或血漿。3. Solexa 測序(1)總RNA進行PAGE電泳回收17_27nt RNA分子(2)將鏈接引物(adaptor prime，Solexa測序通用引物)酶聯在小RNA分子的3' 與5'端(3)進行RT-PCR反應后進行測序(4)數據分析與處理4. TLDA(Applied Biosystems 公司)芯片檢測(1)總RNA通過逆轉錄反應得到cDNA樣品(2)cDNA樣品進行預擴增反應(3)預擴增產物進行TLDA芯片檢測，得到miRNA的表達譜(4)數據分析與處理5. Real-time RT-PCR(qRT-PCR)方法(1)取受試者的血清/血漿總RNA，通過RNA逆轉錄反應得到cDNA樣品；(2)設計引物；(3)加入熒光探針或染料進行PCR反應；(4)檢測并比較乳腺癌病例與健康女性對照血清/血漿樣本中miRNA的量的變化。6.診斷試劑盒制備方法Solexa測序和TLDA芯片檢測方法綜合確定乳腺癌病例和健康女性對照中有拷貝 差異和表達差異，且方向一致的miRNA，通過qRT-PCR技術篩選在乳腺癌病例和健康女性對 照中表達量和差異程度大的一組血清/血漿miRNA，作為輔助乳腺癌診斷的指標。最后篩選 出的與乳腺癌發病有關的血清/血漿miRNA組成診斷試劑盒(miR-16、miR-25、miR-222和 miR-324-3p)。診斷試劑盒可以包括這些血清/血漿微小核糖核酸組合的引物，探針，以及
5Taq酶、dNTP等試劑。7.統計分析方法運用x2檢驗(用于分類變量)或者student t檢驗(用于連續性變量)比較人 口學特征、組織類型和miRNA平均表達水平在研究對象組間分布的差異。我們在探索性樣本人群(48例乳腺癌病例和48例健康女性對照)中綜合運用 Solexa測序和TLDA芯片的研究結果發現有10種miRNAs與乳腺癌發病情況有顯著關聯。 個體miRNAs檢測的不同表達水平以表示，其中Δ Ct = CTtMi-CTrt ，我們在每一個樣本 提取時加入cel-mir-39的RNA作為參照，計算相對表達量。對有統計學顯著差異的miRNAs 在另外50例乳腺癌病例和50例對照中進行進一步驗證，進而觀察本研究結果的穩定程度。為了進一步研究這四種miRNAs構成的綜合指征用于乳腺癌診斷的效果，我們構 建了一個數學公式，綜合考慮每種miRNA與乳腺癌發病的正、負關聯情況和聯系強度。具 體來說，首先以探索性人群健康女性對照組miR-16、miR-25、miR-222和miR-324_3p表達 量的單側95%參考值范圍為標準，分別將這4種miRNA的表達水平評為0分和1分，然后 我們再以探索性樣本對照人群的回歸系數為權重，綜合考慮每種miRNA的表達情況給每 個病人確定一個危險分值。危險分值的計算方法如下危險分值=(4.023XmiR-16的評 分)+ (3. 646 XmiR-25 的評分)+ (2. 347 XmiR-222 的評分)+ (3. 219 XmiR-324_3p 的評分)， 獲得的危險分值系數以及界限值被直接應用于驗證樣本人群和總的196例樣本人群中。統計學分析均通過專門的統計學分析軟件完成(SAS，v. 9. 1. 3)。統計學顯著性水 平P值設為0. 05，所有統計學檢驗均為雙側檢驗。以下是本發明進一步的說明在上述48例符合條件的乳腺癌病例及48例健康女性對照中，兩組年齡按個體精 確匹配。我們將這兩組人群作為探索性樣本經Solexa測序試驗及TLDA芯片檢測獲得相關結果。根據Solexa測序方法，本發明人檢測到在“乳腺癌病例”組和“健康女性對照”組 的血清中存在差異表達(2組的拷貝數倍數差異大于4)的微小核糖核酸包括hsa-let-7b、 hsa-miR-1、hsa_miR-103、hsa_miR-107、hsa_miR-10a、hsa_miR-10b、hsa_miR-1246、 hsa-miR-1294、hsa_miR-1301、hsa_miR-1307、hsa-miR-151_3p、hsa-miR-199a_3p、 hsa-miR-199b_3p、hsa-miR-206、hsa_miR-22、hsa-miR-222、hsa-miR-223、hsa-miR-25、 hsa_miR-30a、 hsa_miR-320b、 hsa_miR-320c、 hsa-miR-324_3p、 hsa-miR-330_3p、 hsa-miR-339_3p、hsa-miR-342_5p、hsa-miR-361_3p、hsa—miR-375、hsa-miR-409_3p、 hsa-miR-423_3p、 hsa-miR-423_5p、 hsa_miR-425、 hsa_miR-432、 hsa_miR-433、 hsa—miR-451、hsa-miR-483_5p、hsa-miR-486_5p、hsa-miR-501_3p、hsa—miR-584、 hsa-miR-629、hsa_miR-720、hsa_miR_744、hsa_miR-874、hsa_miR_92a、hsa_miR_92b、 hsa_miR-99b0根據TLDA芯片檢測，本發明人檢測到在“乳腺癌病例”組和“健康女性對 照”組的血清中存在差異表達(Δ Δ CT > 2)的微小核糖核酸包括haS-miR-155、 hsa_let_7a氺、hsa_let_7b、 hsa_let_7e、 hsa_let_7g氺、hsa_let_7g、 hsa_miR_101、 hsa_miR—105、hsa_miR—106a、hsa_miR—106b、hsa_miR—10b*、hsa_miR—10b、hsa_miR—122*、 hsa-miR-125a_3p、 hsa_miR-126*、 hsa_miR-126、 hsa_miR-130a、 hsa_miR-132、hsa_miR-133a、hsa—miR-134、hsa_miR-135a*、hsa—miR-136*、hsa-miR-140_3p、 hsa-miR-140-5p、 hsa-miR-142_5p、 hsa_miR-143、 hsa_miR-l、 hsa_miR-144*、 hsa-miR-145*、h sa_miR_146a、hsa-miR-146b_3p、hsa-miR-146b_5p、hsa_miR-148b、 hsa-miR—149、 hsa—miR-150、 hsa—miR-15l_3p、 hsa_miR-15a*、 hsa-miR-16—1*、 hsa-miR-16、hsa_miR-17*、hsa_miR-17、hsa_miR-182、hsa_miR-183*、hsa_miR-183、 hsa-miR-lSSAhsa-miR-lSGAhsa-miR-lSa^hsa-miR-lStKhsa-miR-ig^Uhsa-miR-igSa-Sp、 hsa_miR-193b*、hsa—miR-195、hsa_miR-196b、hsa-miR-199a_3p、hsa-miR-199a_5p、 hsa_miR-19a、hsa_miR-19b、hsa_miR-200c、hsa—miR-205、hsa_miR-20a*、hsa_miR-20a、 hsa-miR-20b、hsa_miR_21*、hsa_miR-210、hsa_miR_21、hsa_miR-214、hsa_miR_22*、 hsa-miR-222、hsa_miR_223*、hsa_miR_223、hsa_miR_23a、hsa_miR_24、hsa_miR_25、 hsa-miR-26a_l*、 hsa_miR_26b*、 hsa_miR-27a、 hsa_miR-27b、 hsa_miR-29a、 hsa-miR-29b-2*、hsa_miR_29b、hsa_miR_29c*、hsa_miR_29c、hsa_miR-30lb、h sa_miR-30a、hsa_miR-30d、hsa_miR-30e*、hsa_miR-30e、hsa—miR-320、hsa—miR-32、 hsa-miR-324_3p、 hsa_miR-326、 hsa-miR-330_3p、 hsa_miR-335、 hsa-miR-337_3p、 hsa-miR-338_3p、hsa-miR-339_3p、hsa_miR-33a*、hsa—miR-340、hsa-miR-342_3p、 hsa-miR-342_5p、 hsa_miR-345、 hsa_miR-346、 hsa_miR_34a*、 hsa_miR-34a、 hsa-miR-361_3p、hsa-miR-362_3p、hsa_miR-374a*、hsa_miR-376a、hsa_miR-376c、 hsa-miR-378^^ hsa-miR-378^ hsa-miR-382^ hsa_miR_410、hsa-miR-422a^ hsa-miR-424^ hsa-miR-425*、hsa-miR-425、hsa-miR-429、hsa-miR-432、hsa_miR-449a、hsa_miR-449b、 hsa-miR-451、 hsa_miR-452、 hsa_miR-454*、 hsa_miR-454、 hsa-miR-455_5p、 hsa-miR-486-3p、 hsa-miR-486_5p、 hsa_miR_493*、 hsa_miR_493、 hsa_miR_494、 hsa-miR-495、 hsa_miR_497、 hsa-miR-500*、 hsa-miR-500、 hsa_miR-5(U-5p、 hsa-miR-502_3p、hsa—miR-505*、hsa-miR-512_3p、hsa-miR-515_3p、hsa-miR-516a_3p、 hsa_miR-517a、hsa-miR-518a_3p、hsa-miR-519b_3p、hsa—miR-521、hsa_miR-526b*、 hsa-miR-532-3p、hsa-miR-532_5p、hsa_miR_541*、hsa_miR_545*、hsa_miR_545、 hsa-miR-548d_5p、 hsa_miR-55la、 hsa_miR-565、 hsa_miR-569、 hsa_miR-573、 hsa—miR-575、hsa-miR-576_3p、hsa—miR-579、hsa—miR-580、hsa-miR-589*、hsa—miR-589、 hsa-miR-590_5p、hsa—miR-597、hsa—miR-598、hsa—miR-601、hsa—miR-605、hsa—miR-616*、 hsa-miR-622、hsa_miR-625、hsa-miR-628_3p、hsa-miR-628_5p、hsa_miR-629*、 hsa—miR-636、h sa—miR-638、hsa_miR-639、hsa_miR-640、hsa_miR-642、hsa—miR-645、 hsa—miR-652、hsa-miR-654_5p、hsa—miR-655、hsa—miR-656、hsa—miR-659、hsa—miR-660、 hsa-miR-66U hsa_miR—7_1 氺、hsa_miR—7_2氺、hsa_miR_7、hsa_miR—744氺、hsa_miR—768_3p、 hsa-miR-770_5p、 hsa_miR-801、 hsa-miR-875_5p、 hsa_miR-877、 hsa-miR-886_3p、 hsa-miR-888、hsa_miR-889、hsa_miR_93*、hsa_miR_933、hsa_miR_93、hsa_miR_941、 hsa-miR-942、hsa—miR-9、hsa—miR-944、hsa_miR-99a*。 根據上述兩種方法檢測的結果，選擇滿足下列條件的miRNAs用qRT_PCR方法進一 步的驗證l)Solexa測序中這些miRNAs至少在一組研究對象(“乳腺癌病例”組或“健康 女性對照”組)中的拷貝數大于50且在TLDA芯片中兩組研究對象的CT值均不大于35以 提高檢測效率；2) Solexa測序在兩組的倍數差異達4倍，且TLDA芯片中Δ Δ CT大于3，兩種方法所得結果方向一致；3)SoleXa測序在兩組的倍數差異達8倍，且TLDA芯片中Δ ACT 大于2，兩種方法所得結果方向一致。滿足上述條件的miRNAs 包括let_7b、miR-222、miR-25、miR-324_3p、 miR-339-3p、miR-451、miR-486、miR-151_3p、miR_30a。鑒于 miR-16 在一些報道中被用作 內參，我們仍將miR-16納入后續分析中。探針法和染料法qRT-PCR結果均發現在48例乳 腺癌病例和48例健康女性對照中，有4種miRNAs (miR-16、miR-25、miR-222、miR-324_3p) 在“乳腺癌病例”組和“健康女性對照”組中的表達情況存在顯著性差異。多因素Logistic回歸分析結果表明，這4種miRNAs的表達水平均與乳腺癌的發 病存在著顯著關聯4種miRNAs均在病例中高表達。根據上述結果，將這4個與乳腺癌發病相關的miRNAs在另外50例乳腺癌病例和 與其年齡匹配的50例健康女性對照中進一步的驗證。我們發現血清/血漿高表達miR-16、 miR-25、miR-222、miR-324_3p均與乳腺癌發病相關聯，染料法的結果與探針法一致。進一步分析這4種miRNA的組合用于乳腺癌診斷的效果，發現其組合對乳 腺癌發病診斷的 AUCArea Under the ROC Curve, ROC 曲線(Receiver Operating CharacteristicCurve，受試者工作特征曲線)下面積與單個miRNA相比增加。根據上述實驗結果，本發明人制備了一種能用于乳腺癌診斷的試劑盒，包含測定 受試者血清/血漿中穩定存在且可檢測的成熟miR-16、miR-25、miR-222和miR-324_3p的 引物和其他檢測試劑。具體而言，這4種miRNAs的組合，或者這4種miRNAs的引物組合構成的相關診斷 試劑盒有助于乳腺癌的診斷，為臨床醫生快速準確掌握患者的疾病狀態和病情嚴重程度， 及時采取更具個性化的防治方案提供支持，從而最大限度提高乳腺癌患者的生存率。本發明的有益效果本發明提供的血清/血漿微小核糖核酸(microRNAs/miRNAs)標志物作為乳腺癌 診斷的標志物的優越性在于(1)血清/血漿miRNAs是一種新型生物標志物，區別于傳統生物標志物，不僅穩 定、微創、易于檢測，且定量精確，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類小分子RNA 生物標志物的成功開發有助于乳腺癌的輔助診斷，為其他疾病生物標志物的研制提供借鑒。(2)血清/血漿miRNAs試劑盒是一種系統、全面的診斷和監測試劑盒，可用于乳腺 癌患者的輔助診斷，有助于反映乳腺癌患者的疾病狀態，為臨床醫生快速準確掌握患者病 情、及時采取更具個性化的防治方案提供支持。(3)采用嚴密的設計和評價體系，本發明人初期采用Solexa全基因組測序技術對 血清/血漿miRNAs進行直接測序，同時采用TLDA芯片檢測以獲取疾病特異和異常表達的 血清/血漿miRNAs表達譜，并應用qRT-PCR的方法在大樣本中進行了多階段驗證，采用了 兩種不同的方法(熒光探針法和染料法)進行驗證；以上方法和策略的應用加速和保證了 血清/血漿miRNAs生物標志物和診斷試劑盒的應用，也為其他疾病生物標志物的研制提供 方法和策略上的借鑒。本發明通過控制年齡等對疾病發展的影響因素，研究血清/血漿miRNA在乳腺癌 輔助診斷的應用前景，闡述異常表達的miRNAs對于乳腺癌進展的影響，揭示其篩查和診斷價值。因此，本發明獲得了乳腺癌發病相關血清/血漿miRNAs表達數據庫和特異性標志物； 通過血清/血漿miRNAs生物標志物和診斷試劑盒的研制和應用，可使得乳腺癌的診斷更加 方便易行，為臨床醫生快速準確掌握患者病情，為臨床治療效果評價奠定基礎，并為發現具 有潛在治療價值的新型小分子藥物靶標提供幫助。


圖1.顯示病例組和對照組的4種miRNA的表達箱線圖。顯示乳腺癌病例組和健康女性對照組的表達箱線圖。DS 探索性樣本，IS 驗證性樣本，Com 合并探索性樣本與驗證性樣本。圖2.顯示探索性樣本人群病例組和對照組的ROC曲線。顯示乳腺癌病例組對健康女性對照組為參照的ROC曲線。圖3.顯示驗證性樣本人群病例組和對照組的ROC曲線。顯示乳腺癌病例組對健康女性對照組為參照的ROC曲線。
具體實施例方式實施例1樣品的收集和樣品資料的整理發明人于2006年開始至今從江蘇省腫瘤醫院和常州武進區收集了大量的乳腺癌 患者和對照的外周血樣品(用于研究的樣本為同期收取，采樣、分裝、保存條件均一)，通過 對樣品資料的整理，發明人從中選擇了 196例符合下列標準的樣本作為Solexa測序、TLDA 芯片檢測和后續一系列qRT-PCR驗證的實驗樣品1、新發乳腺癌病例2、采血前未經過手術和放化療，無手術前放化療3、與病例年齡匹配的健康女性對照并系統采集了這些樣本的人口學資料、臨床資料等情況。實施例2血清/血漿中miRNA的Solexa測序實驗在上述符合條件的48例乳腺癌患者和48例健康女性對照中，兩組年齡匹配。將 這兩組人群經Solexa測序試驗獲得相關結果。具體步驟為1、分別取“乳腺癌病例”組和“健康女性對照”組患者的血清50ml，加入等體積的 Trizol 試劑；2、相分離室溫放置15min，然后按0. 2ml氯仿/lml Trizol試劑的體積比加入氯 仿，震蕩 15s,室溫 15min, 12，OOOg, 4°C，離心 15min ；3、將水相轉移到新的50ml的離心管，3步苯酚/氯仿除去蛋白相；4,RNA沉淀將水相轉移到新的離心管中，按0. 5ml異丙醇/lml Trizol試劑體積 加入異丙醇，_20°C保存 60min, 12，OOOg, 4°C，離心 60min ；5、用lml Trizol試劑重懸沉淀，將懸液轉移到新的1. 5ml的離心管中；6、重復2，4步(第四步離心改為15min)；7、RNA洗滌去掉上清，加入75%乙醇，12，000g，4°C離心5min ；8、測量濃度通常能得到 5 μ g RNA/50ml血清；9、總RNA進行PAGE電泳回收17_27nt RNA分子；
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10、將鏈接引物(adaptor prime，Solexa測序通用引物)酶聯在小RNA分子的3' 與5'端；11、進行RT-PCR反應后并進行測序；12、數據分析與處理在“乳腺癌病例”組和“健康女性對照”組中運用Solexa測 序方法發現的血清差異表達的微小核糖核酸在上文中已經羅列出。實施例3血清/血漿中miRNA的TLDA芯片檢測將上述進行Solexa測序的48例乳腺癌患者和48例健康女性對照經TLDA芯片檢 測獲得相關結果。具體步驟為1、分別取“乳腺癌病例”組和“健康女性對照”組患者的血清600 μ 1，加入3倍體 積的Trizol試劑；2、相分離室溫放置15min，加入終濃度為1(Γ4ρπι01/ μ 1的cel_39 (TAKARA)作為 內參，然后加入與血漿等體積的氯仿，震蕩50s，室溫15min，14，OOOrpm，4°C，離心15min ；3,RNA沉淀將水相轉移到新的15ml的離心管，加入1. 5倍水相體積的無水乙醇， 充分混勻；4、用QIAGEN miRNeasy kit富集RNA 每次吸取700 μ 1樣本至離心柱中， 14，OOOrpm離心15s，棄去收集管中濾液，重復至樣本均過柱；加入700 μ 1洗液1， 14，OOOrpm離心15s，棄收集管中濾液；加入500 μ 1洗液2，14，OOOrpm離心15s，棄收集管 中濾液；再加入500 μ 1洗液2，14，OOOrpm離心2min，棄收集管中濾液；將離心柱放回空的 收集管中，14，OOOrpm離心2min以干燥離心管；將離心管放入新的1. 5ml管中，加入50 μ 1 無核酸酶水，10, OOOrpm離心Imin ；將管中的液體倒回離心柱中，14，OOOrpm離心lmin，棄離 心柱；5、測量濃度通常能得到 1250ng RNA/600 μ 1血清；6、用TLDA芯片配套的逆轉錄試劑盒通過RNA逆轉錄反應得到cDNA。逆轉錄的反應 體系包括0. 8μ 1逆轉錄引物(10Χ)、0. 2μ 1 IOOmM dNTPs混合物、1. 5 μ 1逆轉錄酶(50U/ μ L)、0. 8 μ 1 IOX逆轉錄緩沖液、0. 9 μ 1 25mM氯化鎂、0. 1 μ 1 RNA抑制劑以及0. 2 μ 1無 核酸酶水。加入3 μ 1 (l-350ng)的總RNA。反應步驟為16°C孵育2分鐘，42°C反應1分鐘， 50°C反應1秒，上述3步經40個循環反應，再85°C孵育5分鐘；10、對芯片特異性的miRNA進行預擴增以增加表達所需的CNDA的量。預擴增的反 應體系包括12. 5μ 1預擴增Master Mix (2 X)、2· 5 μ 1預擴增引物(10 X)、7. 5 μ 1無核酸 酶水、2. 5 μ 1 CDNA。反應步驟為95°C 10分鐘一55V 2分鐘一72°C 2分鐘一95°C 15秒、 600C 4分鐘，12個循環一99. 90C 10分鐘；反應結束后加入75 μ 1 0. IX TE稀釋；11、取9μ 1稀釋后的預擴增產物，加入450μ 1基因表達Master Mix，441yl無 核酸酶水，充分混勻后，在TLDA芯片上加入100 μ 1/孔；IOOOrpm離心lmin，離心2次。 TLDA芯片實驗使用的是ABI Prism 7900熒光定量PCR儀。選擇384-well TaqMan Low DensityArray特定的程序進行反應；12、數據分析與處理用RQ-Manger軟件進行數據處理，Ct閾值設為0. 2，Δ Ct = Ct -Ctu6 (U6為TLDA芯片中的內源性U6，用以控制板間差異)，兩組樣品血清miRNAs的表達
量比值可用方程Δ Δ Ct表示，Δ ACt =厶(^病例-厶(^對照_厶(^小39，其中Δ CTcel_39 = CTcel_39 ]-CTcei-39 ' (cel-39用以控制RNA提取時的差異，)。運用TLDA芯片檢測發現的“乳腺 癌病例”組和“健康女性對照”組中血清差異表達的微小核糖核酸在上文中已經羅列出。
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實施例4血清/血漿中miRNA的qRT_PCR實驗根據上述Solexa和TLDA結果，選擇滿足下列條件的miRNAs用qRT_PCR方法進 一步的驗證1) Solexa測序中這些miRNAs至少在一組研究對象(“乳腺癌病例”組或“健 康女性對照”組)中的拷貝數大于50且在TLDA芯片中兩組研究對象的CT值均不大于35 以提高檢測效率；2) Solexa測序在兩組的倍數差異達4倍，且TLDA芯片中Δ Δ CT大于 3，兩種方法所得結果方向一致；3) Solexa測序在兩組的倍數差異達8倍，且TLDA芯片中 Δ Δ CT大于2，兩種方法所得結果方向一致。對所選擇的let-7b、miR-16、miR-222、miR-25、 miR-324-3p、miR-339-3p、miR-451、miR-486、miR-151-3p、miR-30a 等 10 個 miRNAs 設計逆 轉錄和qRT-PCR的引物(見表2)。對“乳腺癌病例”組和“健康女性對照”組的血清單個個 體進行miRNA的qRT-PCR檢測，見表1。在整個研究過程中均實施嚴格的質控。每個樣本連 續檢測三次。所有檢測均采用盲法，即在不清楚樣本背景的情況下完成以避免偏倚。分別 用染料法和探針法兩種方法進行qRT-PCR檢測。(1)制備RNA樣品a)取100 μ 1血清；b)加3倍體積的Trizol室溫放置15min， 加入終濃度為10_4ρπιΟ1/μ 1的cel-39 (TAKARA)作為內參，然后加入與血漿等體積的氯仿， 震蕩50s，室溫15min，14，000rpm，4°C，離心15min ；c)將水相轉移到新的15ml的離心管， 加入1. 5倍水相體積的無水乙醇，充分混勻；d)用QIAGEN公司的miRNeasy kit富集RNA 每次吸取700 μ 1樣本至離心柱中，14，OOOrpm離心15s，棄去收集管中濾液，重復至樣本 均過柱；加入700 μ 1洗液1,14, OOOrpm離心15s，棄收集管中濾液；加入500 μ 1洗液2， 14，OOOrpm離心15s，棄收集管中濾液；再加入500 μ 1洗液2，14，OOOrpm離心2min，棄收集 管中濾液；將離心柱放回空的收集管中，14，OOOrpm離心2min以干燥離心管；將離心管放入 新的1. 5ml管中，加入50 μ 1無核酸酶水，10, OOOrpm離心Imin ；將管中的液體倒回離心柱 中，14，OOOrpm離心lmin，棄離心柱，將管中的液體作為RNA樣品；(2)探針法使用ABI試劑盒。a)通過RNA逆轉錄反應得到cDNA。探針法的逆轉錄反應體系包括0. 15 μ 1 IOOmMdNTPs混合物、1 μ 1逆轉錄酶(50U/ μ L)、1. 5 μ 1 IOX逆轉錄緩沖液、0. 19 μ 1 RNA抑 制劑以及3μ 1 5Χ逆轉錄引物一種或幾種的混合物。加入9. 16 μ 1的總RNA。反應步驟為 16 °C孵育30分鐘，42 °C反應30分鐘，85 °C孵育5分鐘；b) q-PCR 將cDNA加入5μ 1水稀釋，取1μ 1稀釋后的cDNA，加入 0. 25μ 120 XMicroRNA檢測探針、2· 5μ 1 2 X 基因表達 Master Mix、1. 25 μ 1 雙蒸水，5 μ 1 體系進行q-PCR。儀器使用的是ABI Prism 7900熒光定量PCR儀，PCR的反應條件是95°C、 5分鐘進行1個循環一950C、15秒，60°C、1分鐘進行45個循環。(3)染料法a)通過RNA逆轉錄反應得到cDNA。染料法的逆轉錄的反應體系包括4 μ 1 5 X AMV 緩沖液、2 μ 1 IOmM dNTP 混合物(Takara 公司)、0· 5 μ 1 RNase 抑制劑(Takara公司)、2 μ 1 AMV(Takara公司)以及1.5μ1 miRNA特異性反向引物一種或幾種的混合物。反應步驟為 16°C孵育15分鐘，42°C反應1小時，85°C孵育5分鐘；b)q_PCR 將 cDNA 按 1/5 體積稀釋，取 0. 5μ 1 稀釋后的 cDNA，加入 0. 15μ 1 Taq 酶(Takara 公司)，0· 5μ 1 20 X EVA GREEN, 0. 1 μ 1 10 μ M 正向引物一種，0· 1 μ 1 10 μ Mil 用反向引物(URP :TGGTGTCGTGGAGTCG, SEQ ID No. 23) ,0. 6 μ 1 25mM MgCl2,0. 8 μ 1 2. 5mMdNTP混合物(Takara公司)，1 μ 1 10XPCR緩沖液，6. 75 μ 1雙蒸水，10 μ 1體系進行q-PCR。 儀器使用的是ABI Prism 7900熒光定量PCR儀，PCR的反應條件是95°C、5分鐘進行1個 循環一950C、15秒，60°C、1分鐘進行45個循環。(4)數據處理與分析兩組樣品血清miRNAs的表達量比值可用方程2_Δ"表示，其中Δ Ct =
,,我們在每一個樣本提取時加入cel-39的RNA作為參照，計算相對表達量(cel_39 =SEQ IDNo. 21 和 SEQ ID No. 22)。探針法和染料法qRT-PCR結果均發現在96例樣本中，有4種miRNAs (miR_16、 miR-25、miR-222和miR-324-3p)在兩組間的表達情況存在顯著性差異，探針法結果見表1、 表3、圖1，染料法結果因與探針法類似不再列出。實施例5血清中微小核糖核酸qRT-PCR實驗的進一步研究根據上述結果，將這4種與乳腺癌發病相關的miRNAs在另外50例乳腺癌患者與 50例年齡匹配的健康女性對照中進行進一步檢測。我們發現miR-16、miR-25、miR-222和 miR-324-3p在乳腺癌病例組血清中的表達均顯著高于對照組(表4、圖1)，探針法與染料法 結果同樣一致。實施例6利用危險度評分方法進一步分析4種miRNA的組合對乳腺癌發病的診斷根據上述Real-time PCR結果，本發明人通過對2組血漿樣品(“乳腺癌病例組” 和“健康女性對照組”)的miRNAs表達水平的分析，以探索性人群健康女性對照組miR-16、 miR-25、miR-222和miR-324_3p表達量的單側95%參考值范圍為標準，對這4種miRNA進 行評分，表達量小于第95百分位數評分為0分，表達量大于等于第95百分位數評分為1分， 以回歸系數為權重，進一步求得危險分值，以危險分值的中位數(中位數=2. 783)為界值， 繪制ROC來評估預測的靈敏性和特異性，進而評估這4種miRNAs高表達對乳腺癌發病的 判斷能力。對4個標志物的聯合分析發現，在探索性樣本人群中，這4種miRNAs以91. 7% 的AUC將健康女性對照組和乳腺癌癌病例組分開，最佳臨界點的靈敏度為91. 7%，特異度 91. 7% ；在驗證樣本人群中，這4種miRNAs以93. 0%的AUC將健康女性對照組和乳腺癌癌 病例組分開，最佳臨界點的靈敏度為92. 0%，特異度94. 0% (圖2、3)。運用危險分值的界 值在探索性樣本人群中錯判率為8. 3% (8/96)，在驗證性樣本人群中錯判率為8% (8/100) (表 5)。因此，本發明人證明了采用miR-16、miR-25、miR-222和miR-324_3p能夠很好地將 健康女性對照和乳腺癌患者區分。實施例7用于乳腺癌輔助診斷的miRNA試劑盒的制作miRNA試劑盒的制作和操作流程是基于solexa測序，TLDA芯片檢測，RT-PCR和 real-time PCR等技術。試劑盒包括血清/血漿miRNA引物(包括下列引物miR_16的引物 為 SEQ ID No. 19 和 SEQ ID No. 20 ；miR-25 的引物為 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；miR-222 的引物為 SEQ ID No. 17 和 SEQ ID No. 18 ；miR-324_3p 的引物為 SEQ ID No. 13 和 SEQ IDNo. 14)，還可以有相應PCR反應所需的常用酶和/或試劑，如逆轉錄酶，緩沖液，dNTPs, MgC12，去核酸酶水，熒光染料或探針、Taq酶、通用反向引物(URP :TGGTGTCGTGGAGTCG，SEQ ID NO 23)等，可根據具體采用的實驗方法選用，這些常用酶和/或試劑是本領域技術人員 熟知的，另外還可以有標準品和對照(如定量標化的線蟲mir-39樣本等)及正常參考值
12(miR-16 5. 84*l(T2，mir-25 2. 26*l(T3，miR-222 2. 75*l(T3，miR-324-3p 3. 60*1(Γ4)。此試 劑盒的價值在于只需要血清/血漿而不需要其它組織樣品，通過最精簡的熒光或探針法檢 測miRNA的變化趨勢，再通過該趨勢輔助診斷乳腺癌，不僅穩定，檢測方便，且定量精確，大 大提高疾病診斷的敏感性和特異性，因此將此試劑盒投入實踐，可以幫助指導臨床準確做 出診斷。
表3探索性樣本人群單因 考值為界值)
logistic回歸分析結果(以對照組表達值的95%參 15
1、蟬蓉 lnr>v§ s 氺要 0 表4驗證性樣本人群單因素logistic回歸分析結果(以探索性樣本對照組表達 值的95%參考值為界值) 表5運用探索性樣本人群ROC曲線的界值所得的錯判比例
權利要求
一種與乳腺癌相關的血清/血漿miRNA標志物，其特征在于該標志物為miR 16、miR 25、miR 222和miR 324 3p的組合。
2.權利要求1所述的血清/血漿miRNA標志物的引物，其特征在于該引物為 miR-16 的引物為 SEQ ID No. 19 和 SEQ ID No. 20 ；miR-25 的引物為 SEQ ID No. 1 禾口 SEQID No. 2 ；miR-222 的引物為 SEQ ID No. 17 和 SEQ ID No. 18 ；miR-324_3p 的引物為 SEQ ID No.13 和 SEQ ID No. 14。
3.權利要求1所述的血清/血漿miRNA標志物在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中的應用。
4.權利要求2所述的血清/血漿miRNA標志物的引物在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中 的應用。
5.一種乳腺癌輔助診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒用于檢測血清/血漿中miR-16、 miR-25、miR-222 和 miR-324_3p。
6.根據權利要求5所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有血清/血漿miRNA中 miR-16、miR-25、miR-222 和 miR-324_3p 的引物。
7.根據權利要求5所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權利要求2所述的血 清/血漿miRNA標志物的引物。
8.根據權利要求6或7所述診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還可以包括PCR反應常 用的酶和試劑。
全文摘要
本發明屬于基因工程及腫瘤學領域，公開了一種與乳腺癌相關的血清/血漿miRNA標志物及其應用。該標志物為miR-16、miR-25、miR-222和miR-324-3p的組合。該標志物及其引物可用于制備診斷試劑盒，用于乳腺癌的輔助早期診斷。
文檔編號C12Q1/68GK101921760SQ20101027555
公開日2010年12月22日 申請日期2010年9月8日 優先權日2010年9月8日
發明者張辰宇, 沈洪兵, 胡志斌, 董靜, 馬紅霞 申請人:南京醫科大學