專利名稱：IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種能作為酶標記抗體用于免疫測定的IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶 融合蛋白，屬于生物工程領域。
背景技術：
堿性磷酸酶(AlkalinePhosphatase, AP)和辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)是酶免疫測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)中較為常 用的免疫標記用酶。在ELISA中應用，AP系統的敏感性一般高于應用HRP系統，空白值也 較低。但由于AP較難得到高純度制劑，穩定性較HRP低，價格較HRP高，制備酶結合物時得 率較HRP低等原因，因此國內在ELISA中一般均采用HRP。堿性磷酸酶在免疫測定中作為標記用酶，是通過催化相應底物顯色實現的。常用 標記用酶的AP有兩個來源，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取，牛小腸堿性磷酸酶比活高 達2000U/mg蛋白，大腸桿菌堿性磷酸酶比活40-60U/mg蛋白。大腸桿菌為原核生物而不能 對蛋白質進行糖基化。序列分析表明AP活性中心Aspl01-Serl02-Ala103序列高度保守。 糖基化可能是影響其活性的重要因素，但并未得到證實。目前，免疫酶標試劑制備方式是采用雙功能試劑(如戊二醛，過碘酸鹽等)將抗體 與酶偶聯，按以上方法制備的結合物一般混有未結合的酶和抗體。理論上結合物中混有游 離酶不影響ELISA中最后的酶活性測定，因經過洗滌，非特異性吸附于固相上的游離酶已 被洗去。但游離的抗體則會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，因而減低結合到固相上的酶 標抗體量，故制備的結合物應予以純化。因此，傳統的抗體與酶的標記方式需要交聯、純化 等多步蛋白質操作；而且偶聯后往往存在蛋白質活性降低，抗體_酶結合物不均一，因而降 低了檢測的靈敏度。利用基因工程技術生產免疫測定標記用酶，可改變從生物體分離提純的生產方 式，也是得到符合標記要求高純度酶的一條新途徑。而將標記酶直接與抗體融合表達的方 式制備，可克服化學交聯劑偶聯方法的弊端。理論上盡管將堿性磷酸酶與抗體融合表達，但目前研究主要集中在單鏈抗體 (ScFv)與AP融合蛋白的構建，但是每檢測一種抗原就要制備相應的融合抗體，在不能或不 便構建抗體-酶融合蛋白時則融合標記受阻。因此，尋找一種可結合多種一抗的二抗并與 酶以融合表達方式來制備免疫酶標試劑具有重要意義。IgG抗體親和肽是來自葡萄球菌蛋白A (staphylococcal protein A, SpA)的ZZ結 構域。SpA為金黃色葡萄球菌細胞壁的單鏈多肽，分子量為42kD，能通過疏水作用結合人、 兔等多種動物IgG的Fc段，且這種結合不影響IgG的Fab段與抗原特異性結合的免疫活性， 根據SpA這一特性，SpA不僅用于免疫球蛋白和單克隆抗體的純化，還被多種標記物(HRP， AP，FITC，膠體金等)偶聯標記用于免疫測定；因SpA與IgG結合不受種屬限制，被稱為“廣 泛二抗”。
針對上述現有技術，本發明的目的在于提供一種無需再次標記即可用于酶免疫測 定的IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白(IgG affibody-Alkaline Phosphatase fusion protein，簡寫 IgG Ab-AP)。本發明是通過以下技術方案實現的一種IgG抗體親和肽_堿性磷酸酶融合蛋白，是IgG抗體親和肽和堿性磷酸 酶構成的融合蛋白，其一經產生即具有與IgG抗體的結合活性和AP催化活性，且二者 標記比例為1 1;該融合蛋白的酶比活力為386 士 82U/mg;與兔IgG抗體的親和常數 Ka ^ 6. 7 X IO7L · moF10本發明的IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白的制備方法，步驟如下(1)將IgG抗體親和肽基因和堿性磷酸酶基因連接，然后構建重組載體；(2)電轉化巴斯德畢赤酵母，選取重組載體整合到酵母基因組上的菌株；(3)經G418抗性壓力篩選高拷貝表達菌株；(4)培養菌株，誘導表達IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白；(5)提取純化IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白。具體如下(1)構建重組載體首先在分泌型堿性磷酸酶基因上游和下游提供限制性內切酶 切割位點Sac I及Pst I，然后通過PCR擴增不帶N-信號肽及C-末端擴展肽的堿性磷酸酶 基因，將其插入到IgG抗體親和肽下游；然后在IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶基因上游和下 游提供限制性內切酶切割位點Not I，通過PCR擴增并插入pPIC9K的Not I位點，構建畢赤 酵母表達載體PlgG Ab-AP/9k ；(2)電轉化，并選取整合成功的菌株①挑取巴斯德畢赤酵母單菌落，接種于5mLYPD培養基中，30°C，250rpm培養過夜， 得過夜培養物；②取100 50(^1^的過夜培養物接種至5001111^ 0培養基中，301，250印111培養至 OD6tltl 達到 1.3-1. 5，得菌液；③將菌液于4°C，3000rpm離心5min，然后用500mL冰預冷的無菌水重懸菌體；④按步驟③離心，用250mL冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；⑤按步驟③離心，用20mL冰預冷的IM的山梨醇將菌體沉淀重懸；⑥按步驟③離心，用ImL冰預冷的IM的山梨醇重懸菌體；將細胞置于冰上；⑦將1 μ g經Sal I線性化的pAb_AP/9k載體DNA加入到80 μ L細胞中，將混合物 移至預冷的電轉杯中；⑧電轉參數電壓1500V，電容25 μ F，電阻200 Ω ；Gene Pulser Xcell電轉進行畢 赤酵母的電轉化，將目的基因導入到畢赤酵母中；⑨通過組氨酸缺陷型突變的互補篩選轉化子將電轉化后的細胞立即涂布到缺少 組氨酸的MD瓊脂平板上，在30°C孵育48-72h ；⑩挑取MD平板的酵母單菌落，通過菌落PCR直接檢查載體是否與基因組整合，選 取載體與基因組整合的菌落進行下一步操作；(3)篩選高拷貝表達菌株將上述⑩驗證正確的單菌落，用槍尖點種于含有不同
5G418濃度(1. Omg/mL-4. Omg/mL)的YPD平板上，30°C培養2_5天，出現G418抗性克隆；(4)誘導表達將通過G418壓力篩選的高拷貝單菌落(G418濃度4. Omg/mL平板生 長的菌落)，接種于BMGY培養基中，30°C，280rpm培養至OD600達到2 6 ；3000g離心5min 收集細胞，棄去上清，用BMMY培養基重懸細胞，轉入BMMY培養基中，30°C，280rpm誘導蛋白 表達；每24h補加一次甲醇至甲醇濃度為0. 5%，120小時結束誘導；(5)提取純化①取誘導后的發酵液，4°C，lOOOOrpm，離心IOmin ；②收集上清，并用0. 22 μ m濾膜過濾，使用Millipore超濾器，4°C，4000rpm，離心 30min濃縮，得濃縮發酵液；③將IOmL Ni-NTA倒入2. 5 X IOcm柱中，用3個柱床體積的緩沖液A在4°C進行柱
平衡；④將濃縮發酵液上樣，用6個柱床體積的緩沖液B清洗；⑤用6個柱床體積的緩沖液C洗脫目的蛋白；⑥使用Millipore超濾器，4°C，4000rpm，離心30min濃縮，將濃縮液以0. OlMTBS 稀釋，得稀釋液；⑦將稀釋液加入IgG-S印harose-4B 柱，流速 0. 2ml/min，以 0. OlMTBS 洗至 OD280nm < 0. 02為止，然后換用0. lmol/L pH2. 3甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫，流速0. 2ml/min,收集洗 脫液；⑧使用Millipore超濾器，4 °C，4000rpm，離心30min濃縮，即得IgG抗體親和
肽-堿性磷酸酶融合蛋白。所述緩沖液A為50mM Tris，pH 8. 0的溶液，其中，含有IOmM咪唑及0. 3M氯化鈉。所述緩沖液B為50mM Tris，pH 8. 0的溶液，其中，含有20mM咪唑及0. 3M氯化鈉。所述緩沖液C為50mM Tris, pH 8. 0的溶液，其中，含有250mM咪唑及0. 3M氯化鈉。經上述制備方法得到的IgG親和肽_堿性磷酸酶融合蛋白具有高度均一性，無需 體外標記即可用于酶免疫測定；在Dot-ELISA檢測兔IgG抗體中，與常規標記的山羊抗兔 IgG-AP檢測效果相當。本發明的IgG親和肽_堿性磷酸酶融合蛋白是利用畢赤酵母表達的，為糖基化產 物，其堿性磷酸酶活性高于從大腸桿菌提取的天然堿性磷酸酶。本發明是利用基因工程技術直接將抗體或抗原與酶以融合的方式表達，不但避免 了繁瑣且低效率的酶與蛋白質的化學交聯，而且無需得到純化的酶和抗體或抗原。本發明將堿性磷酸酶基因與IgG親和肽重組構建IgG親和肽_堿性磷酸酶融合蛋 白，并利用巴斯德畢赤酵母分泌表達，該融合蛋白一經產生即具有與IgG抗體的結合活性 和AP催化活性，無需再次標記即可用于酶免疫測定；同時，IgG親和肽僅與IgG的Fc段結 合，提高了與IgG親和特異性，且無需每檢測一種抗原而制備相應的融合抗體。由背景技術可知，SpA被稱為“廣泛二抗”，但盡管SPA已作為一種“廣泛二抗”或 “替代二抗”在免疫測定中應用，但SpA的IgG結合活性來自E、D、A、B、C 5個高度同源的 IgG結合結構域。研究發現，其IgG結合結構域不僅與IgG的Fc段結合，也與某些IgG的 Fab段(如人IgGl的F (ab' )2)結合。為克服其弊端，以ZZ親和肽結構域代替SpA的5個同源IgG結合結構域，使IgG結合結構域的分子量減小到14kD，也克服了 SpA與某些IgG的 Fab段結合的缺點。因此本發明采用僅與IgG Fc段結合的ZZ結構域-IgG抗體親和肽，避 免對IgG的Fab段與抗原特異性結合的影響。本發明的IgG親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白，具有IgG親和肽和堿性磷酸酶的生 物學活性，無需體外標記即可用于酶免疫測定，且其活性較常規大腸桿菌提取的堿性磷酸 酶更高，本發明具有活性高、使用方便、效果好等優點。
圖1為含有融合蛋白基因的表達載體plgG Ab-AP/9k的質粒圖；圖2為IgG Ab-AP融合蛋白-山羊抗兔IgG-HRP百分結合率抑制標準曲線；圖3為IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白、山羊抗兔IgG-AP檢測兔IgG抗體 的對比示意圖。本發明中涉及的培養基的配方如下YPD 1 % east Extract ；2% Peptone ；2% Dextrose ；2% Agar ；MD 1. 34% YNB ；4X10_5% Biotin ；2% Dextrose ；1. 5% Agar ；BMGY 1 % Yeast Extract ；2% Peptone ；IOOmM potassium phosphate buffer, ρΗ6· 0 ；1. 34% YNB ；4X10-5% Biotin ；1% glycerol ；BMMY 1 % Yeast Extract ；2% Peptone ；IOOmM potassium phosphate buffer, ρΗ6· 0 ；1. 34% YNB ；4Χ10_5% Biotin ；0. 5% methanol。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的說明。實施例1 IgG抗體親和肽_堿性磷酸酶融合蛋白基因表達載體的構建為將堿性磷酸酶基因與IgG親和肽基因連接，首先在分泌型堿性磷酸酶基因 (secreted alkaline phos-phatase，SEAP，GenBank Accession No :U35316)上游禾口下游提 供限制性內切酶切割位點Sac I及Pst I，通過PCR擴增不帶N-信號肽及C-末端擴展肽的 堿性磷酸酶基因(1467bp)，插入IgG親和肽下游(pEZZ18的Sac I及Pst I位點)；第二步 在IgG親和肽-AP基因上游和下游提供限制性內切酶切割位點Not I，通過PCR擴增并插入 PPIC9K的Not I位點，構建畢赤酵母表達載體plgG Ab_AP/9k，如圖1所示。實施例2電轉化巴斯德畢赤酵母GS115為在巴斯德畢赤酵母GS115中轉化pAb_AP/9k并隨后整合進基因組中，載體首先 用Sal I線性化，使用Gene Pulser Xcell電轉儀電轉化進行1)挑取酵母單菌落，接種于5mLYPD培養基中，30°C，250rpm培養過夜；2)取100-500 μ L的過夜培養物接種至500mLYPD培養基中，30°C，250rpm培養至 OD600 達到 1. 3-1. 5 ；3)將菌液于4°C，3000rpm離心5min，用500mL冰預冷的無菌水重懸菌體；4)按步驟3離心，用250mL冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；5)按步驟3離心，用20mL冰預冷的IM的山梨醇將菌體沉淀重懸；6)按步驟3離心，用ImL冰預冷的IM的山梨醇重懸菌體；將細胞置于冰上；
7)約1 μ g經Sal I線性化的pAb_AP/9k載體DNA加入80 μ L細胞，將混合物移至 預冷的電轉杯中；8)按照Gene Pulser Xcell電轉儀操作要求，進行畢赤酵母的電轉化，將目的基因 導入到畢赤酵母中；9)通過組氨酸缺陷型突變的互補篩選轉化子。將細胞立即涂布到缺少組氨酸的 MD瓊脂平板上，在30°C孵育48-72h ；10)挑取MD平板的酵母單菌落，通過菌落PCR直接檢查載體是否與基因組整合。實施例3高拷貝菌株的篩選及目的蛋白的表達為了獲得高拷貝的基因工程菌，使用選擇壓力進行篩選。將驗證正確的單菌落，用 槍尖點種于含有不同G418濃度的YPD平板上。點種時，按照G418濃度由低到高順序點種 平板，30°C培養。將通過G418(4. Omg/mL)壓力篩選的高拷貝單菌落，接種于25mL BMGY中，30°C， 280rpm培養至OD6tltl達到2_6。3000g離心5min收集細胞。棄去上清，用BMMY培養基重懸 細胞，轉入50mL BMMY中，30°C，280rpm誘導蛋白表達；.每24h取樣lmL，并補加一次甲醇 至甲醇濃度0. 5%，120小時結束誘導。實施例4IgG抗體親和肽_堿性磷酸酶融合蛋白的純化1)取誘導一定時間的發酵液，4°C，lOOOOrpm，離心lOmin。2)收集上清，并用0. 22 μ m濾膜過濾，使用Millipore超濾器(截留分子量為 IOkDa)，4°C，4000rpm，離心 30min 濃縮。3)將IOmL Ni-NTA倒入2. 5X IOcm柱中，用3個柱床體積的緩沖液A(50mM Tris, pH 8. 0 ；0. 3M氯化鈉；IOmM咪唑)在4°C進行柱平衡。4)將濃縮發酵液上樣，用6個柱床體積的緩沖液(50mM Tris，pH 8. 0 ；20mM咪唑； 0. 3M氯化鈉)清洗。5)用6個柱床體積的緩沖液(50mM Tris, pH 8. 0 ；250mM咪唑；0. 3M氯化鈉)洗
脫目的蛋白。6)使用Millipore超濾器(截留分子量為IOkD)，4°C，4000rpm，離心30min濃縮， 將濃縮液以適當0. 01MTBS稀釋。7)將步驟6溶液加入IgG-S印harose-4B柱，流速0. 2ml/min,以0. 01MTBS洗至 0D280nm < 0. 02為止，換用0. lmol/L ρΗ2· 3甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫，流速0. 2ml/min,收
集洗脫液。8)使用MiIlipore超濾器(截留分子量為IOkDa)，4°C，4000rpm，離心30min濃縮， 12% SDS-PAGE檢測純化效果。實施例5 IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白活性鑒定IgG抗體親和肽_堿性磷酸酶融合蛋白是一雙功能蛋白質，具有堿性磷酸酶的催 化活性及與IgG抗體結合的活性。堿性磷酸酶活性檢測原理
IgG Ab-AP
4-硝基苯磷酸酯^- 4-硝基苯酚+Pi
8
360 μ LpNPP 溶液(50mM 的 Tris-HCl 中含 2mM 乙酸鎂，pNPP 濃度 0. 25 10mM， ρΗΙΟ. 0)，加入IgG Ab-AP溶液40 μ L (BCA法定量，武漢博士德生物公司)，37°C反應IOmin, 3. 6mLIMNaOH終止反應，測定405nm的吸光度值。酶活力單位在上述條件下，每分鐘催化產生1 μ mol/L pNP所需的酶量定義為1 個活性單位(U)。Img酶所含有酶的單位數稱為比活力。根據下式計算計算活力單位U = MXA-1XeXb其中，M = IgG Ab-AP融合蛋白質量；A = 405nm吸光度；ε = 18700[LXmol—1 Xcm—1] ；b = Icm經測定，IgG Ab-AP融合蛋白的堿性磷酸酶比活力為 386士82U/mg蛋白，比活力高于市售大腸桿菌提取天然堿性磷酸酶。與兔IgG抗體親和活性測定1)兔IgG抗體用包被稀釋液稀釋后(lOOng/mL)包被酶標板，每孔100 μ L，4°C溫 育過夜，TBST(含 0. 5% Tween-20 的 0. OlM TBS 溶液，ρΗ8· 0) X5minX3 次；2)每孔加入封閉液200μ L，于37°C封閉lh, TBSTX5minX3次；3將純化的IgG Ab-AP融合蛋白以適當梯度稀釋后，與山羊抗兔 IgG-HRP(l 5000)按體積比1 1混勻；每孔加入上述混合液100 μ L，于37°C反應結合 lh, TBSTX5minX3 次；4)每孔加入TMB底物液100 μ L，37°C避光顯色，當對照孔出現明顯顏色反應時，每 孔加入終止液50 μ L，于20min內測定450/630nm ；5)以未包被兔IgG抗體的孔為空白值，以只加山羊抗兔IgG-HRP孔的A45(1/62(1值為Btl 值，加入不同濃度的IgG Ab-AP融合蛋白與山羊抗兔IgG-HRP混合液的A45(1/62(1值為B值。以 IgG Ab-AP融合蛋白的濃度負對數(-LogC)為橫坐標，以山羊抗兔IgG-HRP百分結合率(B/ B0%)為縱坐標，繪制抑制標準曲線，如圖2所示。當山羊抗兔IgG-HRP百分結合率為50%時 所對應的IgG Ab-AP融合蛋白濃度倒數，即為IgG Ab-AP融合蛋白與兔IgG抗體的親和常數。經測定，IgG Ab-AP融合蛋白與兔IgG抗體的親和常數Ka ^ 6. 7X IO7L · πιοΓ1。實施例6IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白在Dot-ELISA應用1)取NC膜用鉛筆作好加樣方格(5mmX 5mm)并作好相應標記；2)將膜浸入0. 01mol/L pH7. 4的TBS中15 30min，取出用濾紙吸干；3)將要包被的抗體(兔IgG抗體)包被稀釋液稀釋至工作濃度；4)加樣0.5μ L于相應格內，室溫自然干燥后，將NC膜片放入封閉液中振蕩封閉 30min ；5)將膜片放入洗滌液中振蕩洗滌3次，每次30min ；6)用濾紙吸干，將膜片放入酶標記抗體溶液(山羊抗兔IgG-AP，1 2000)或IgG Ab-AP溶液中，室溫振蕩30min ；7)將膜片放入洗滌液中振蕩洗滌4次，每次30min ；8)將膜片浸入BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色溶液中，在振蕩條件下充分顯色，用流水 沖洗數分鐘，放入蒸餾水中終止反應。如圖3所示，IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白與山羊抗兔IgG-AP檢測效果 相當。
權利要求
IgG抗體親和肽 堿性磷酸酶融合蛋白，其特征在于是IgG抗體親和肽和堿性磷酸酶構成的融合蛋白。
2.權利要求1所述的IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白的制備方法，其特征在于， 步驟如下(1)將IgG抗體親和肽基因和堿性磷酸酶基因連接，然后構建重組載體；(2)電轉化巴斯德畢赤酵母，選取重組載體整合到酵母基因組上的菌株；(3)經G418抗性壓力篩選高拷貝表達菌株；(4)培養菌株，誘導表達IgG抗體親和肽_堿性磷酸酶融合蛋白；(5)提取純化IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟如下，具體步驟如下(1)構建重組載體首先在分泌型堿性磷酸酶基因上游和下游提供限制性內切酶切割 位點Sac I及Pst I，然后通過PCR擴增不帶N-信號肽及C-末端擴展肽的堿性磷酸酶基 因，將其插入到IgG抗體親和肽下游；然后在IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶基因上游和下游 提供限制性內切酶切割位點Not I，通過PCR擴增并插入pPIC9K的Not I位點，構建畢赤酵 母表達載體PlgG Ab-AP/9k ；(2)電轉化，并選取整合成功的菌株①挑取巴斯德畢赤酵母單菌落，接種于5mLYPD培養基中，300C，250rpm培養過夜，得過 夜培養物；②取100 500μ L的過夜培養物接種至500mLYPD培養基中，30°C，250rpm培養至0D_ 達到1.3-1. 5，得菌液；③將菌液于4°C，3000rpm離心5min，然后用500mL冰預冷的無菌水重懸菌體；④按步驟③離心，用250mL冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；⑤按步驟③離心，用20mL冰預冷的IM的山梨醇將菌體沉淀重懸；⑥按步驟③離心，用ImL冰預冷的IM的山梨醇重懸菌體；將細胞置于冰上；⑦將1μ g經Sal I線性化的pAb_AP/9k載體DNA加入到80 μ L細胞中，將混合物移至 預冷的電轉杯中；⑧電轉參數電壓1500V，電容25μ F，電阻200 Ω ；Gene Pulser Xcell電轉進行畢赤酵 母的電轉化，將目的基因導入到畢赤酵母中；⑨通過組氨酸缺陷型突變的互補篩選轉化子將電轉化后的細胞立即涂布到缺少組氨 酸的MD瓊脂平板上，在30°C孵育48-72h ；⑩挑取MD平板的酵母單菌落，通過菌落PCR直接檢查載體是否與基因組整合，選取載 體與基因組整合的菌落進行下一步操作；(3)篩選高拷貝表達菌株將上述⑩驗證正確的單菌落，用槍尖點種于含有不同G418 濃度的YPD平板上，30°C培養2-5天，出現G418抗性克隆；(4)誘導表達將通過G418壓力篩選的高拷貝單菌落，接種于BMGY培養基中，30°C， 280rpm培養至OD6tltl達到2 6 ；3000g離心5min收集細胞，棄去上清，用BMMY培養基重懸 細胞，轉入BMMY培養基中，30°C，280rpm誘導蛋白表達；每24h補加一次甲醇至甲醇濃度為 0.5%，120小時結束誘導；(5)提取純化①取誘導后的發酵液，4°C，lOOOOrpm，離心IOmin；②收集上清，并用0.22 μ m濾膜過濾，使用Mi 11 ipore超濾器，4°C，4000rpm,離心30min 濃縮，得濃縮發酵液；③將IOmLNi-NTA倒入2. 5X IOcm柱中，用3個柱床體積的緩沖液A在4°C進行柱平④將濃縮發酵液上樣，用6個柱床體積的緩沖液B清洗；⑤用6個柱床體積的緩沖液C洗脫目的蛋白；⑥使用Mi11 ipore超濾器，4°C，4000rpm,離心30min濃縮，將濃縮液以0. 0IM TBS稀釋， 得稀釋液；⑦將稀釋液加入IgG-S印harose-4B柱，流速0.2ml/min,以0. OlM TBS洗至OD28tlnm < 0. 02為止，然后換用0. lmol/L pH2. 3甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫，流速0. 2ml/min,收集洗 脫液；⑧使用Millipore超濾器，4°C，4000rpm，離心30min濃縮。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述緩沖液A為50mMTris, pH 8.0 的溶液，其中，含有IOmM咪唑及0. 3M氯化鈉。
5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述緩沖液B為50mMTris, pH 8. 0 的溶液，其中，含有20mM咪唑及0. 3M氯化鈉。
6.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述緩沖液C為50mMTris, pH 8. 0 的溶液，其中，含有250mM咪唑及0. 3M氯化鈉。
7.權利要求1所述的IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白作為酶標記抗體用于免疫 測定的應用。
全文摘要
本發明公開了一種IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白，是IgG抗體親和肽和堿性磷酸酶構成的融合蛋白，能作為替代酶標記抗體用于免疫測定，其一經產生即具有與IgG抗體的結合活性和AP催化活性，且二者標記比例為1∶1；該融合蛋白的酶比活力為386±82U/mg；與兔IgG抗體的親和常數Ka≌6.7×107L·mol-1。本發明的IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白的制備方法如下(1)將IgG抗體親和肽基因和堿性磷酸酶基因連接，構建重組載體；(2)電轉化巴斯德畢赤酵母；(3)經G418抗性壓力篩選高拷貝表達菌株；(4)培養菌株，誘導表達；(5)提取純化IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白。
文檔編號C12N15/62GK101948545SQ201010275380
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月8日 優先權日2010年9月8日
發明者唐金寶, 楊洪鳴, 梁淑娟, 陳永 申請人:濰坊醫學院