專利名稱：棉花GbVe基因、其編碼蛋白及在植物抗黃萎病中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，特別是涉及棉花GbVe基因、其編碼蛋白及在植物抗黃 萎病中的應用。
背景技術：
棉花黃萎病被稱為“棉花癌癥”，其致病菌為大麗輪枝菌，由于抗病基因資源匱乏 和大麗輪枝菌治病機理復雜，尚無有效地防治方法，黃萎病已經成為世界范圍內影響棉花 產量和纖維品質的主要病害之一。黃萎病是一種土傳維管束疾病，其病菌可在土壤中長期 潛伏。到目前為止尚未能找到徹底防治棉花黃萎病的辦法。利用棉花抗黃萎病品種進行 黃萎病的防治由于受到育種周期長和抗黃萎病資源匱乏等因素的限制而未能廣泛應用。因 此，利用基因工程技術分離植物抗黃萎病相關基因并通過遺傳轉化培育抗黃萎病新品種， 是目前棉花抗黃萎病遺傳改良的一個重要方向。目前，已從棉花上克隆了一些抗病相關基因，這些基因的克隆為棉花抗病基因工 程的研究奠定了良好的理論基礎。最近，Parkhi等將NPRl基因導入棉花后，轉基因植株表 現為一種廣譜性抗病，不僅可以抗多種真菌病害，還同時對線蟲病害有一定的抗性。盡管前 人從棉花中克隆了大量與抗病相關的基因，但有關棉花抗黃萎病基因(Ve)的克隆及功能 分析尚無報道。番茄、馬鈴薯等作物是大麗輪枝菌侵害的主要對象，近年來其在抗黃萎 病基因克隆方面取得了突破進展。Kawchuk等用圖位克隆技術從番茄(Solanum lycopersicum “VFN8”)基因組文庫中成功分離了 2個大麗輪枝菌抗性基因Vel和Ve2， 且Ve賦予了轉基因馬鈴薯對強致病力黑白輪枝菌(Verticillium albo-atrum Reinke和 Berth)較強的抗性。Chai等依據Vel和Ve2基因的部分保守域設計引物，采用同源克隆法 從Solanum licopersicoides分離了 SlVel基因，研究發現轉SlVel的馬鈴薯提高了其抗黑 白輪枝菌的能力。以上結果表明Ve基因具有介導跨物種抗黃萎病的能力，并不嚴格受小種 特異性的限制，即具有多效性。Fei等利用RACE技術從水茄(S. torvum Swartz)中克隆了 全長3640bp的StVe基因；生物信息學分析顯示，StVe與Vel和Ve2在核酸水平具有較高同 源性，編碼的是一個富含亮氨酸(15. 89% )LRRs型跨膜細胞表面受體類蛋白，暗示了 StVe 可能具有抗黃萎病功能。Shi等從水茄(Solanum torvun)中分離StVe基因，并表明該基 因與抗黃萎病抗性有一定相關性。最近，Vining K等從長葉薄荷中(mentha longifolia) 分離到與Ve基因同源的mVel基因，并認為該基因在薄荷黃萎病抗性方面起著重要作用。 Emilie F.等將番茄Vel與Ve2基因通過農桿菌介導方法將其導入番茄作物，結果表明Ve 基因在番茄中超量表達，顯著提高了番茄黃萎病抗性。綜上所述，Ve基因在植物抗黃萎病 方面具有顯著的作用，應是一個理想的棉花轉基因抗黃萎病育種候選基因。目前關于棉花抗黃萎病基因的研究工作已經展開，篩選出的用于轉化的基因大部 分是具有廣譜抗性的抗真菌基因，而對黃萎病病菌專抗的基因很少，尤其是還未見有關棉 花中大麗輪枝菌抗性基因Ve的相關報道。因此，從高抗黃萎病的海島棉品種中克隆與抗黃萎病相關的關鍵基因(Ve)，研究其表達調控機制及功能，為獲得高抗黃萎病轉基因棉花提 供新的基因資源，進而為培育高抗黃萎病棉花新品種奠定基礎。
發明內容
本發明的目的是提供一種棉花GbVe基因及其編碼蛋白。本發明的另一目的是提供上述棉花GbVe基因在植物抗黃萎病中的應用。為了實現本發明目的，本發明的一種棉花GbVe基因編碼的蛋白，其具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功 能的氨基酸序列。例如在非活性區段，將第297位的谷氨酰胺(Gln)替換為脯氨酸(Pro)， 或是將第597位的蘇氨酸(Thr)缺失，或是在837位添加蘇氨酸(Thr)均不會影響蛋白的 功能。本發明還提供編碼上述蛋白的基因，其具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。本發明還提供含有棉花GbVe基因的載體及含有該載體的宿主細胞。本發明還提供含有棉花GbVe基因的轉化植物細胞。本發明進一步提供棉花GbVe基因在植物抗黃萎病中的應用。優選地，所述植物為 擬南芥。具體地，本發明是從高抗黃萎病菌的海島棉品種中克隆得到與抗黃萎病相關的基 因Ve，根據染色體步移技術，將擴增得到的5’端的GbVe基因片段和3’端的GbVe基因片段 拼接，然后根據基因序列設計合成可擴增全長GbVe基因的引物，采用RT-PCR技術經過常規 克隆測序方法獲得了全長GbVe基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。借由上述技術方案，本發明至少具有下列優點及有益效果(1)本發明提供了棉花GbVe基因及其編碼的蛋白，其核苷酸序列和氨基酸序列分 別如 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。(2)利用本發明提供的GbVe基因獲得的轉基因擬南芥的黃萎病抗性顯著提高。(3)本發明克隆得到的GbVe基因不僅有助于揭示棉花與黃萎病菌之間相互作用 的分子機制，為植物的抗黃萎病代謝途徑的研究提供重要理論基礎，也為植物基因工程領 域進行植物遺傳性狀的改良提供了更有價值的候選功能基因。
圖1為本發明棉花GbVe基因的cDNA全長序列PCR產物的電泳檢測結果，其中M 為DL 5000Marker, 1為目的片段。圖2為本發明載體pCamGbVe的結構示意圖。圖3為本發明pCamGbVe質粒雙酶切結果示意圖，其中M為DL12000 DNA Marker, 1禾口 2為BamHI和KpnI雙酶切質粒pCamGbVe的產物。圖4為本發明轉GbVe基因擬南芥的PCR檢測結果，其中M為DL2000 DNA Marker, 1 為水對照，2為非轉基因擬南芥陰性對照，3為GbVe-EST陽性質粒擴增結果，4_14為轉GbVe 基因擬南芥。圖5為本發明轉GbVe基因擬南芥的Southern檢測結果，其中M為DNA Marker，P 為陽性質粒對照；WT為陰性質粒對照；L3-L5為轉GbVe基因擬南芥株系。
圖6為本發明轉GbVe基因擬南芥的Northern檢測結果，其中WT為陰性質粒對照； L3-L5為轉GbVe基因擬南芥株系。圖7示例本發明轉GbVe基因擬南芥對大麗輪枝菌的抑制作用。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1棉花GbVe基因的克隆包括步驟l)GbVe基因中間片段的擴增；2)GbVe基因的3'染色體步移擴增；3)GbVe基因的5'染色體步移擴增；
4) GbVe基因全序列的gDNA和cDNA擴增。具體地，步驟1)選用天根生化公司提供的植物基因組DNA試劑盒(Plant Genomic DNA Kit)和植物基因組DNA提取試劑盒，從抗黃萎病的海島棉“Pima 90-53”的棉花幼嫩 葉片和根部組織分別提取出gDNA和總RNA，純化后用于隨后的染色體步移擴增和cDNA合 成，具體方法如下根據GenBank上公布的番茄Ve基因序列，在NCBI上進行BLAST比對， 根據比對結果設計特異性引物上游引物5‘ -GGAGTATCCCTGAGTCGATATGCA-3‘；下游引物 5 ‘ -CACTTCTGGTATTGGCCC-3 ‘。以純化后的 gDNA 為模板，取 1 μ LgDNA 進行 Touch Down PCR擴增，反應程序及條件為溫度95°C，時間5分鐘；溫度95°C，時間45秒，溫度62°C，時 間45秒，溫度72°C，時間1分鐘，5個循環；溫度95°C，時間45秒，溫度60°C、時間45秒，溫 度72°C，時間1分鐘，5個循環；溫度94°C，時間45秒，溫度58 °C，時間45秒，溫度72°C，時 間1分鐘，5個循環；溫度72°C，時間10分鐘，4°C保存；的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產 物，PCR產物通過T4DNA連接酶連接到質粒pGEM-T載體上，并轉化大腸桿菌DH5 α，然后涂 布到具有氨芐青霉素的LB平板上，37°C過夜培養直至菌落長出，隨機挑取3個陽性克隆進 行測序，序列分析獲得GbVe基因的中間部分基因序列。步驟2)選用TaKaRa公司提供的染色體步移試劑盒，按照說明書進行操作； 根據步驟1)中GbVe基因中間片段的測序結果，設計合成三條上游特異引物，3' SPl 5 ‘ -GGAGTATCCCTGAGTCGATATGCA-3 ‘ ,3 ‘ SP2 5 ‘ -GTCTAATAATTCCCTGAGCGGGTC-3 ‘， 3' SP3 5' -CGTGCATTGTTCAGAGAGGAGCC-3 ‘，用試劑盒提供的簡并引物 AP Primer 為下 游引物，以純化的gDNA為模板進行3輪PCR擴增。第1輪PCR采用特異性引物3' SPl與 試劑盒中提供的簡并引物AP Primer分別進行熱不對稱PCR反應。第1輪反應程序及條件 為94"C Imin98 "C Imin940C 30s, 650C lmin，72°C 2min，5 個循環94°C 30s, 25°C 3min,72°C 2min94°C 30s, 65°C lmin, 72°C 2min、
94°C 30s, 65°C lmin, 72°C 2min [ 15個循環
94°C 30s, 44°C lmin, 72°C 2min」72 °C 10min，4°C 保存第2輪PCR反應以第1輪PCR產物稀釋50倍為模板，采用特異性引物3‘ SP2與 試劑盒中提供的簡并引物AP Primer分別進行熱不對稱PCR反應。第2輪反應程序及條件
為
94 °C30s,65 °Clmin,72 0C2 min、94 °C30s,65 °Clmin,72 °C2 min94 °C30s,44 °Clmin,72 0C2 min ^72 "C 10min，4°C 保存第3輪PCR反應以第2輪PCR產物稀釋50倍為模板，采用特異性引物3‘ SP3與 試劑盒中提供的簡并引物AP Primer分別進行熱不對稱PCR反應。第3輪反應程序及條件 同第2輪反應程序及條件。的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，回收條帶特異清晰的PCR 產物按上述方法克隆到質粒PGEM-T載體上，隨機挑取3個陽性克隆進行測序，序列分析獲 得GbVe基因的3'端基因序列。步驟3)選用TaKaRa公司提供的染色體步移試劑盒，按照說明書進行操作； 根據步驟1)中GbVe基因中間片段的測序結果，設計合成三條上游特異引物，5' SPl 5' -GGAGGTAAACACCGTTAGGA-3‘ ,5' SP2 5' -ATTGCCTTCCAGGTCGACAAGCA-3‘ ,5' SP3 5 ‘ -CAGGAATAGACCCGCTCAGGGAA-3 ‘，用試劑盒提供的簡并引物AP Pr imer為下游引物，以 純化的gDNA為模板進行3輪PCR擴增。第1輪PCR采用特異性引物5' SPl與試劑盒中提 供的簡并引物APPrimer分別進行熱不對稱PCR反應。第1輪反應程序及條件為94"C Imin98 "C Imin940C 30s, 650C lmin，72°C 2min，5 個循環94°C 30s, 25°C 3min,72°C 2min
94°C 30s, 650C lmin, 72°C 94°C 30s, 65°C lmin, 72°C
94°C 30s, 440C lmin, 72°C72 °C 10min，4°C 保存第2輪PCR反應以第1輪PCR產物稀釋50倍為模板，采用特異性引物5' SP2與 試劑盒中提供的簡并引物AP Primer分別進行熱不對稱PCR反應。第2輪反應程序及條件
為
2min、
2min > 15個循環 2min J 72 °C 10min，4°C 保存第3輪PCR反應以第2輪PCR產物稀釋50倍為模板，采用特異性引物5‘ SP3與 試劑盒中提供的簡并引物AP Primer分別進行熱不對稱PCR反應。第3輪反應程序及條件 同第2輪反應程序及條件。的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，回收條帶特異清晰的PCR 產物按上述方法克隆到質粒PGEM-T載體上，隨機挑取3個陽性克隆進行測序，序列分析獲 得GbVe基因的5'端基因序列。根據中間片段、5'染色體步移、3'染色體步移的測序結果進行序列拼接，設計合 成一對特異的引物，擴增全長的GbVe基因，5'端GbVeF 5' -CTGGGATCCACCAATGATGATTTC ACC-3 ‘，3 ‘端引物 GbVeR 5 ‘ -CCTGGTACCCTAAGGAGAAAAGGGAGGAG-3 ‘；以純化的 gDNA 為 模板，選用LATaq酶進行PCR擴增，反應程序及條件為溫度94°C，時間5分鐘；溫度94°C， 時間45秒，溫度55 °C，時間45秒，溫度72 °C，時間3. 5分鐘，30個循環；溫度72 °C，時間10 分鐘；1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，PCR產物按上述方法克隆到PMD19-T載體上，隨 機挑取3個陽性克隆進行測序，獲得GbVe基因的gDNA全長序列，所得到的重組質粒命名為 pMDGbVe。以提取的總RNA為模板，按照Takara公司提供的M-MLV試劑說明書合成cDNA第 一鏈，取1 μ L cDNA為模板，分別以GbVeF和GbVeR為上、下游引物，選用LATaq酶進行PCR 擴增，反應程序及條件為溫度94°C，時間5分鐘；溫度94°C，時間45秒，溫度55°C，時間45 秒，溫度72°C，時間3. 5分鐘，30個循環；溫度72°C，時間10分鐘；的瓊脂糖凝膠電泳檢 測PCR產物(圖1)，PCR產物按上述方法克隆到質粒PMD19-T載體上，隨機挑取3個克隆進 行測序，序列分析獲得GbVe基因的cDNA全長序列。實施例2棉花GbVe基因編碼蛋白的氨基酸序列的同源性分析將棉花GbVe基因編碼蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No. 2)在NCBI數據庫中進 行blast對比分析，發現它與多種植物體內的應答病原菌侵染重要的受體類抗病基因 (LRR-TM)均有一定相似度，但同源性較低。GbVe基因與StVe和SlVe2的一致性不到55%， 但它們同屬于植物應答病原菌侵染重要的受體類抗病基因(LRR-TM)，含有信號肽、跨膜域、 LRR重復單元、N端成熟區等保守結構域。利用DNAman分析軟件將分離克隆的GbVe基因 與GenBank上的植物應答病原菌侵染重要的受體類抗病基因所編碼的氨基酸序列進行比 對分析，結果如表 1 所示，分別為 SIVe，AY262015 ；Vel, AF272366 ；SlVe2, AY282579 ；Ve2, AF365929 ；StVe, AY311527 ；Cf-2. 2，U42445 ；Cf5, AF053993 ；HcrVf1, AJ297739 ；HcrVf2, AJ297740 ；HcrVf3, AJ297741 ；LeEiXl, AY359965 ；LeEiX2, AY359966。結果表明本發明獲得 的GbVe基因與以往的報道的植物應答病原菌侵染重要的受體類抗病基因序列具有明顯的 差異，證明該基因是一個新的抗大麗輪枝菌基因，且在棉花上為首次克隆。表1 GbVe基因與植物應答病原菌侵染重要的受體類抗病基因的氨基酸序列同源 性比較(％) 實施例3棉花GbVe基因在提高擬南芥黃萎病抗性中的應用1、棉花GbVe基因植物表達載體的構建及轉化將上述已構建好的pMDGbVe和真核基因表達啟動子35s和終止子構建成融合表達 基因，連接在雙元表達載體pCambial300(市售商品)的EcoRI/Hindlll酶切位點(結構如 圖2所示)，得到重組質粒pCamGbVe，經BamHI和KpnI雙酶切鑒定結果顯示為兩條目的片 段(圖3)，表明GbVe基因以正確的閱讀框架插入到pCambia1300中。將pCamGbVe轉化到 農桿菌GV3101中。按照侵染擬南芥花絮的方法轉化擬南芥獲得抗潮霉素(hptll)的轉基 因植株。2、轉GbVe基因植株的PCR檢測剪取轉GbVe基因植株和非轉GbVe基因植株的幼嫩葉片，采用CTAB法提取基因 組DNA，在室溫干燥后用適量無菌雙重蒸餾水懸浮，-20°C保存。提取的DNA模板量調整為 50ng/y L，取 1 μ L 為模板進行 PCR 擴增，94°C，5min ；94 °C, 45S, 55 °C, 45S, 72 °C, 30min, 30 個循環；72°C，10min。1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果表明獲得了 GbVe基因整合 到擬南芥植物基因組的轉基因植株(圖4)。3、轉GbVe基因擬南芥的Southern檢測剪取轉GbVe基因植株和非轉GbVe基因植株的幼嫩葉片，采用CTAB法提取基因 組DNA，在室溫干燥后用適量無菌雙重蒸餾水懸浮并純化，-20°C保存。用KpnI分別酶切 轉GbVe基因植株和非轉GbVe基因植株的gDNA，每個樣品酶切30 μ g，以GbVe基因的一 段長約530bp的EST為探針，按照地高辛DNA標記及檢測試劑盒(DIG DNA Labeling and Detection Kitl，Roche，德國)的說明書進行操作。結果表明GbVe基因在檢測的三個株系 中以單拷貝整合到擬南芥基因組中(圖5)。
4、轉GbVe基因擬南芥的Northern檢測剪取轉GbVe基因植株和非轉GbVe基因植株的幼嫩葉片，采用植物RNA試劑盒 (Tiangen，中國)提取總RNA。每個樣品取30 μ g在1 %的甲酰胺變性瓊脂糖凝膠上電泳， 以GbVe基因的一段長約530bp的EST為探針，按照地高辛DNA標記及檢測試劑盒(DIG DNA Labeling and Detection Kitl，Roche，德國)的說明書進行操作。結果表明GbVe基因在 檢測的三個株系高效表達(圖6)。5、轉GbVe基因擬南芥的黃萎病抗性鑒定大麗輪枝菌為河北農業大學棉花遺傳育種分子研究室保存的強致病力菌系，將該 病菌在PDA培養基上活化7-10天，并轉接到液體查彼克培養基中懸浮培養10-14天，接菌 時在顯微鏡下借助血球計數板將懸浮孢子液濃度調至5X 107cfu/mL。擬南芥種子經春化4 天，播種于營養缽中，22°C，光照16h/黑暗8h，濕度60-70%，培養四周。小心拔出幼苗，用 滅菌水沖洗根部，將處理好的幼苗根部浸入20mL的孢子懸浮液(5 X 107CfU/mL) 1分鐘，每 處理一個株系更換一次新的孢子懸浮液，對照按同樣方法接滅菌水。接種后將幼苗迅速移 栽回營養缽并保持高濕2天。定期觀察對照株系與轉基因株系的表型變化。結果顯示(圖7)，在接種大麗輪枝菌后，野生型擬南芥表現出葉片嚴重黃化甚至 干枯(圖7-E、F、G)，株高嚴重矮化(圖7-1)，長勢弱小，維管束褐變程度高(圖7-H)等癥 狀；而轉基因擬南芥出現輕微的葉片黃化(圖7-A、B、C)，株高較對照減少不明顯(圖7-1)， 生長健壯，維管束無明顯褐變現象(圖7-H)。說明GbVe基因可以明顯抑制大麗輪枝菌的繁 殖，顯著提高植株的黃萎病抗性。本發明屬于新基因的制備，特別是指抗黃萎病基因GbVe及其制備以及利用其編 碼的蛋白。包括以 5'端 5' -CTGGGATCCACCAATGATGATTTCACC-3‘和 3'端 5' -CCTGGTAC CCTAAGGAGAAAAGGGAGGAG-3 ‘為特異引物，以棉花根部cDNA為模板，采用PCR擴增方法獲得 抗黃萎病基因GbVe，并應用其編碼了對大麗輪枝菌具有顯著抑制作用的蛋白。本發明為抗 黃萎病基因工程提供了新的重要候選基因，利用本發明獲得了全長的GbVe基因及其構建 的植物表達載體，可為進一步轉化到重要作物提高轉基因植物的黃萎病抗性奠定基礎，具 有極大的經濟效益和應用價值。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
棉花GbVe基因編碼的蛋白，其特征在于，其具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于，其具有SEQID No. 1所示的核苷酸序列。
4.含有權利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權利要求4所述載體的宿主細胞。
6.含有權利要求2或3所述基因的轉化植物細胞。
7.權利要求2或3所述的基因在植物抗黃萎病中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其中所述的植物為擬南芥。全文摘要
本發明涉及棉花GbVe基因及其編碼蛋白，其是從高抗黃萎病的海島棉品種中克隆得到與抗黃萎病相關的Ve基因，根據染色體步移技術，將擴增得到的5’端的GbVe基因片段和3’端的GbVe基因片段拼接，然后根據基因序列設計合成可擴增全長GbVe基因的引物，采用RT-PCR技術經過常規克隆測序方法獲得了全長GbVe基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本發明為植物抗黃萎病基因工程提供了新的重要候選基因，利用本發明獲得的全長GbVe基因及其構建的植物表達載體，可為進一步轉化重要作物以提高轉基因作物的黃萎病抗性奠定基礎，具有極大的經濟效益和應用價值。
文檔編號C12N15/29GK101928338SQ201010275300
公開日2010年12月29日 申請日期2010年9月3日 優先權日2010年9月3日
發明者吳立強, 張桂寅, 張艷, 李志坤, 楊碩, 王省芬, 馬峙英 申請人:河北農業大學