專利名稱：一種利用味精發酵廢棄菌體生產有機酸的方法
技術領域：
本發明涉及生物化工領域中的有機酸的發酵方法，具體地說，涉及利用味精發酵 廢棄菌體谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)來生產有機酸的方法。
背景技術：
谷氨酸棒桿菌是目前味精行業中L-谷氨酸發酵的一種非常重要的生產菌種，谷 氨酸棒桿菌發酵生產谷氨酸是一個好氧過程，產生大量的生物質菌體。目前的工藝中，發 酵結束后產生的大量生物質(廢棄的菌體)被用于生產菌體蛋白飼料用于畜牧業，或者用 于提取核苷酸等低價值產品，資源利用率低下。一般味精發酵一噸廢棄菌體中可回收核苷 8-10公斤(150元/公斤)，其余再作為蛋白飼料(2000元/噸)，且該過程需要對菌體進行 生化處理，消耗一定的物能，也會增加對環境的污染，所以如何更加合理的處理味精發酵的 廢棄菌體是味精產業中資源高效利用的關鍵問題。近幾年，日本科學家研究發現，谷氨酸棒 桿菌在厭氧條件下培養具有良好的有機酸生產潛力，積累大量的乳酸、丁二酸和乙酸。谷氨 酸棒桿菌生長迅速、培養條件簡單、耐受性強、發酵條件成熟，同時由于其厭氧代謝途徑中 部分酶的缺失，使得其在厭氧條件下副產物較少，成為最具潛力的生產有機酸的工業菌種。 但是該過程中的厭氧發酵需要高產量的菌體積累，所消耗的大量物能使得該應用還不能滿 足工業生產的經濟要求，如果能夠將味精生產的廢棄菌體資源化利用，來作為谷氨酸棒桿 菌厭氧發酵有機酸的菌體積累，則可有效解決有機酸發酵的高成本問題，使其具備產業化 的價值。丁二酸又稱琥珀酸，是一種二元有機酸，它是一種重要的C4平臺化合物，可作為 合成復雜有機化合物的中間體，廣泛應用于合成塑料、橡膠和染料、制藥、食品加工和其它 工業中，其市場需求量與日俱增。傳統的化學合成丁二酸法因為使用化石原料、環境污染等 原因受到較大限制，而微生物發酵法由于效率高、污染小等優點，正在被廣泛深入的研究。 但目前用于發酵生產丁二酸的菌株主要是從特征性厭氧環境(瘤胃、腸胃等)中篩選出的 菌株或基因工程菌，由于在理想狀態下丁二酸產率伴隨著菌體濃度而增加，為了保持一個 相對穩定丁二酸高產率，必須使發酵菌體達到一個高濃度的細胞密度，這個過程在實際生 產中要耗費大量的培養時間與物能消耗，所以如何能夠降低菌體富集的成本成了有機酸發 酵產業化需要解決的關鍵問題。D-乳酸作為一個重要的手性中間體，已被用于多種手性物質的合成。近年來高光 學純度的D-乳酸因為在提高聚乳酸材料性能方面的實際應用而得到了更多的關注。微生 物發酵法是目前制備D-乳酸的最主要方法之一，現有的生產工藝都是利用細菌將碳水化 合物經厭氧發酵而成，生產差異主要在菌種，而這個過程中提高D-乳酸生產效率的關鍵仍 是菌體的高密度培養。目前國內外研究較多的D-乳酸生產菌主要集中在乳桿菌屬和芽孢 乳桿菌屬，這兩類菌都是專性或兼性厭氧菌，大規模高產量的D-乳酸生產依賴于菌體富集 的發酵耗能，使得D-乳酸生產的關鍵問題同樣集中在獲得大量的發酵菌體，這同樣也關系 到聚乳酸產品的生產成本的降低，使得作為環保塑料的聚乳酸有機會取代傳統塑料。
除谷氨酸以外，谷氨酸棒桿菌在其它氨基酸及其衍生物(如L-賴氨酸、L-蘇氨酸、 L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-谷氨酰胺等)工業生產中一直占據中堅地位。這些氨基酸的 理化性質與谷氨酸相似，在生產工藝上可以借鑒味精生產成熟的路線，因而其廢棄菌體的 處理也成為了發酵產業資源化高效利用的關鍵問題。
發明內容
本發明所要解決的問題是提供一種利用生產味精發酵廢液中的菌體回收再次發 酵來生產有機酸的方法，方法簡便，設備要求不高，易于自動化控制，具有廣泛的社會和經 濟效益。為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下收集味精發酵廢棄菌體谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，厭氧發酵 培養基重懸該菌泥，然后轉入發酵罐中，向發酵罐中的厭氧發酵培養基中通入CO2氣體維 持罐內正壓(一般可控制通氣量在0. 2 0. 5v/vm)，30°C下，攪拌培養24 40小時，并維 持厭氧發酵液的pH在5. 5 7. 0，發酵生產有機酸；其中，所述的厭氧發酵培養基包括如 下組分葡萄糖 40 80g/L，K2HPO4 · 3H20 0. 5g/L，KH2PO4 0. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L， FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L,生物素 0. 2mg/L,維生素 Bl 200 μ g/L, NaHC0342g/L, 初始PH7.0 ；所述的有機酸為丁二酸、乳酸和乙酸。其中，使用碳酸鹽、氨水和堿液中的任意 一種或幾種的組合維持厭氧發酵液的pH在5. 5 7. 0。有益效果本發明與現有技術相比具有如下優勢。1、對本發明制得的產品進行分析，結果，谷氨酸棒桿菌在厭氧條件下，能顯著的 積累丁二酸、乳酸、乙酸，有機酸生產強度最高可達2. ASg*!/1*!^,綜合質量產率最高可達 1. 05g/g(glucose)，因此其產業化的經濟效益是明顯的。2、利用本發明的方法，味精好氧發酵階段結束時產生大量的菌體，直接利用其生 產有機酸，省去了厭氧過程之前需要富集菌體的過程，有效的利用了生物質資源，降低了生 產成本。發酵有機酸后的廢棄菌體，仍可利用現有工藝再生產蛋白飼料添加劑、核酸等，同 樣可滿足實現工業生產在經濟上的要求。3、利用本發明的方法，在厭氧產酸階段，厭氧環境降低了整個過程中的能量消耗， 同時每產生一分子丁二酸相對應的將固定一分子的CO2，對于控制碳排放具有極其重要的
眉、O4、本發明的生產工藝較原有的單純發酵有機酸沒有增加新的輔料，因此不會造成 對環境的二次污染，同時減少了原有工藝中味精發酵廢棄菌體的后處理與有機酸發酵富集 菌體的過程，減少了對環境的污染，是環境友好的工藝方法。5、除L-谷氨酸以外，谷氨酸棒桿菌也廣泛的應用于多種氨基酸及其相關衍生物 的生產，其主要的產品包括L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酰胺等。 這些產品的廢棄菌體同樣可利用該方法實現有機酸的發酵，這為谷氨酸棒桿菌在工業生產 中的綜合開發利用，乃至微生物發酵工業中生物資源的充分利用提供了一種新的思路。
具體實施例方式實施例1
收集味精工業用谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC 10128) 發酵L-谷氨酸的廢棄菌體，最終獲得生物量10g-dry cell XT10 (OD600nm = 0. 25g-dry cell XL-1)。將菌泥用好氧結束時等體積的厭氧培養基充分懸浮，轉移至厭氧發酵罐中，之后 將CO2氣體以0. 2v/vm的通氣速率流入發酵罐的厭氧發酵培養基中，攪拌轉速為200rpm，溫 度控制在30°C，厭氧發酵24小時。厭氧發酵培養基葡萄糖40g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 5g/L，KH2PO4 0. 5g/L， MgSO4 · 7Η200· 5g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L,生物素 0. 2mg/L,維生素 Bl 200 μ g/L, NaHCO3 42g/L。初始 pH7. O。發酵結果，主要轉化產物為乳酸、乙酸和丁二酸，其產量分別為6. 72g/L、l. 34g/L、 30. 5g/L，有機酸生產強度1. eg*!/1*!^,綜合質量產率為0. 96g/g (glucose)。實施例2 收集味精工業用谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC 10128) 發酵L-谷氨酸的廢棄菌體，最終獲得生物量10g-dry cell XT10 (OD600nm = 0. 25g-dry cell XL-1)。將菌泥用好氧結束時等體積的厭氧培養基充分懸浮，轉移至厭氧發酵罐中，之后 將CO2氣體以0. 2v/vm的通氣速率流入發酵罐的厭氧發酵培養基中，攪拌轉速為200rpm，溫 度控制在30°C，厭氧發酵32小時。厭氧發酵培養基葡萄糖80g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 5g/L，KH2PO4 0. 5g/L， MgSO4 · 7Η200· 5g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L,生物素 0. 2mg/L,維生素 Bl 200 μ g/L, NaHCO3 42g/L。初始 pH7. 0。發酵結果，主要轉化產物為乳酸、乙酸和丁二酸，其產量分別為56.82g/L、3. 15g/ L、19. 28g/L，有機酸生產強度2. ASg*!/1*!^,綜合質量產率為0. 99g/g (glucose)。實施例3 收集味精工業用谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC 10129) 發酵L-谷氨酸的廢棄菌體，最終獲得生物量10g-dry cell XT10 (OD600nm = 0. 25g-dry cell XL-1)。將處理過的菌泥用好氧結束時等體積的厭氧培養基充分懸浮，轉移至厭氧發酵罐 中，之后將CO2氣體以0. 2v/vm的通氣速率流入發酵罐的厭氧發酵培養基中，攪拌轉速為 200rpm，溫度控制在30°C，厭氧發酵28小時。厭氧發酵培養基葡萄糖40g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 5g/L，KH2PO4 0. 5g/L， MgSO4 · 7Η200· 5g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L,生物素 0. 2mg/L,維生素 Bl 200 μ g/L, NaHCO3 42g/L。初始 pH7. 0。發酵結果，主要轉化產物為乳酸、乙酸和丁二酸，其產量分別為16. 84g/L、1. 26g/ L、20. 64g/L，有機酸生產強度1. SSg*!/1*!^,綜合質量產率為0. 97g/g (glucose)。實施例4 收集味精工業用谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC 10129) 發酵L-谷氨酸的廢棄菌體，最終獲得生物量10g-dry cell XT10 (OD600nm = 0. 25g-dry cell XL-1)。
將處理過的菌泥用好氧結束時等體積的厭氧培養基充分懸浮，轉移至厭氧發酵罐 中，之后將CO2氣體以0. 2v/vm的通氣速率流入發酵罐的厭氧發酵培養基中，攪拌轉速為 200rpm，溫度控制在30°C，厭氧發酵40小時。厭氧發酵培養基葡萄糖80g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 5g/L，KH2PO4 0. 5g/L， MgSO4 · 7Η200· 5g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L,生物素 0. 2mg/L,維生素 Bl 200 μ g/L, NaHCO3 42g/L。初始 pH7. 0。發酵結果，主要轉化產物為乳酸、乙酸和丁二酸，其產量分別為33. 98g/L、2. 26g/ L、47. 88g/L，有機酸生產強度2. Ig*!/1*!^,綜合質量產率為1. 05g/g (glucose)。注本發明實施例中所采用的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum ATCC10128)和谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 10129)均為常規使用的 菌種，可市售獲得。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
一種利用味精發酵廢棄菌體生產有機酸的方法，其特征在于收集味精發酵廢棄菌體谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，厭氧發酵培養基重懸該菌泥，然后轉入發酵罐中，向發酵罐中的厭氧發酵培養基中通入CO2氣體維持罐內正壓，30℃下，攪拌培養24～40小時，并維持厭氧發酵液的pH在5.5～7.0，發酵生產有機酸；其中，所述的厭氧發酵培養基包括如下組分葡萄糖40～80g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，MnSO4·H2O 6mg/L，生物素0.2mg/L，維生素B1 200μg/L，NaHCO3 42g/L，初始pH7.0；所述的有機酸為丁二酸、乳酸和乙酸。
2.根據權利要求1所述的利用味精發酵廢棄菌體生產有機酸的方法，其特征在于使用 碳酸鹽、氨水和堿液中的任意一種或幾種的組合維持厭氧發酵液的pH在5. 5 7. 0。
全文摘要
本發明公開了一種利用味精發酵廢棄菌體生產有機酸的方法，以味精生產中谷氨酸棒桿菌在好氧條件下發酵生產L-谷氨酸好氧過程結束后的廢棄菌體回收轉入厭氧條件生產有機酸。以厭氧培養基重懸菌泥，接種后將CO2氣體通入發酵罐的發酵培養基中，30℃，攪拌培養24～48小時，并維持發酵液的pH在5.5-7.0。對制得的產品進行分析結果，谷氨酸棒桿菌在厭氧條件下，能顯著的積累丁二酸、乳酸、乙酸。
文檔編號C12P7/56GK101942486SQ20101027482
公開日2011年1月12日 申請日期2010年9月7日 優先權日2010年9月7日
發明者嚴明, 劉兆星, 李艷, 歐陽平凱, 蔡萍, 許晟, 郝寧 申請人:南京工業大學