專利名稱：：檢測綿羊肺腺瘤病病毒的lamp引物及應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及用于檢測病毒的特異性引物，尤其涉及用于檢測綿羊肺腺瘤病病毒的LAMP引物，屬于綿羊肺腺瘤病病毒的檢測領域。
背景技術：
：綿羊月市腺瘤病(Ovinepulmonaryadenomatosis,ΟΡΑ)又名“驅趕病”(Jaagsiekte)，是引起綿羊肺臟腫瘤的一種接觸性傳染病。主要病征為患羊咳嗽、呼吸困難、消瘦、大量漿液性鼻漏、Π型肺泡上皮細胞和無纖毛細支氣管上皮細胞腫瘤性增生(馬學恩，主編.家畜病理學[Μ].4版.北京中國農業出版社，2007:385-386)。OPA與人的細支氣管-肺泡癌(bronchiolo-alveolarcarcinoma,BAC)在臨床癥狀、病理組織學特征及超微病變方面極為相似，為人類這一常見癌癥提供了動物模型。綿羊肺腺瘤病在綿羊感染率40%80%，發病率2%30%，出現明顯臨床癥狀的羊病死率為100%(劉淑英，馬學恩，李景鵬，等.綿羊肺腺瘤病毒中國匪株部分gag基因的克隆與序列分析[J].中國病毒學，2004，19(2):133136)。本病1825年首次發現于南非，1958年鄧普輝教授首次報道了中國屠宰羊群中的11個OPA病例，以后，新疆、內蒙古、青海等省區陸續有本病的報道。現在，多數養羊業發達的國家和地區都有該病的發生和流行，該病嚴重威脅和影響著世界各國養羊業的發展。綿羊肺腺瘤病病毒(Jaagsiekteretrovirus,JSRV)為β反轉錄病毒。基因組為線性單股正鏈RNA，全長7.4kb，編碼相互重疊的gag、pro、pol、env基因(DemartiniJ,BishopJ,AllenT,etal.JaagsiektesheepretrovirusproviralcloneJSRV(JS7),derivedfromtheJS7lungtumorcellline,inducesovinepulmonarycarcinomaandisintegratedintothesurfactantproteinAgene[J].JournalofVirology,2001,75(9)=239-246),JSRV感染羊后，形成整合有外源性前病毒DNA(exJSRV)的肺腫瘤細胞。有趣的是，在進化過程中健康羊基因組攜有1520拷貝，與JSRV密切相關的內源性病毒DNA(enJSRV)，隨宿主細胞(羊生殖細胞)基因組遺傳復制并發揮一定的生理功能(CarlsonJ,BishopJ,LyonΜ,etal.ChromosomaldistributionofendogenousJaagsiektesheepretrovirusproviralsequencesinthesheepgenome[J].JournalofVirology,2002,75(9):4239-4246)。健康羊體內，enJSRV表達的蛋白與JSRV病毒粒子的蛋白高度一致，能與JSRV的受體結合，競爭性阻斷JSRV的感染，并導致免疫耐受，使得感染羊無針對JSRV的循環性抗體。然而，患羊肺組織、淋巴網狀內皮系統及外周血單核細胞均有前病毒DNA及JSRV的轉錄產物。目前，中國對本病主要依賴于常規病理學診斷方法，在基因診斷方面本室已建立了特異性PCR及套式PCR實驗室診斷方法(羅軍榮，劉霄卉，余群英，等.綿羊肺腺瘤病特異性PCR及套式PCR診斷方法的建立[J],病毒學報，2009，25(2)125130.)，但這兩種方法需要一定的實驗室條件，不適宜進行臨床快速檢測。Notomi等開發了一種新穎的恒溫核酸擴增方法，即環介導等溫擴增法(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)(NotomiT，OkayamaH，MasubuchiH,etal.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA[J].NucleicAcidsRes,2000,28(12):e63)，該方法具有特異性強、靈敏度高、擴增高效、快速、步驟簡單、鑒定簡便等優點，迄今已建立了針對多種病原性細菌、病毒、真菌、寄生蟲等的LAMP檢測方法(ImaiM，NinomiyaA,MinekawaH，etal.DevelopmentofH5-RT-LAMP(loop-mediatedisothermalamplification)systemforrapiddiagnosisofH5avianinfluenzavirusinfection[J]·Vaccine，2006，24(44/46)6679-6682；CurtisKA，RudolDL，OwenSM.RapiddetectionofHIV-Ibyreverse—transcription，loop-mediatedisothermalamplification(RT-LAMP)[J].JVirolMethods，2008，151(2)2642-2670；PoonLLM，WongBWY,ChanKH，etal.Evaluationofreal-timereversetranscriptasePCRandreal-timeloop-mediatedamplificationassaysforsevereacuterespiratorysyndromecoron-avirusdetection[J].JClinMicrobiol，2005，43(7):3457-3459；PhamHM，NakajimaC，OhashiK，etal.Loop-media-tedisothermalamplificationforrapiddetectionofNewcastlediseasevirus[J].JClinMicrobiol，2005，43(4)1646-1650)，在耐藥性基因檢測家畜早期胚胎性別判定等方面也有相關報道。環介導等溫擴增反應(LAMP)是針對靶基因的6個特異部位設定4種引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶基因高效擴增。能從僅相差1個核苷酸的基因標本中找出相應靶序列進行擴增，根據擴增與否即可判斷目的基因是否存在。LAMP的產物是由多重復靶序列的莖環狀DNA和花椰菜狀DNA所組成的混合物，在瓊脂糖凝膠電泳上會呈現出LAMP所特有的階梯狀條帶。另外，在反應過程中，從產生的肉眼可見的反應副產物焦磷酸鎂白色沉淀(MoriY,KitaoΜ,TomitaN,etal.Real2timeturbidimetryofLAMPreactionforquantifyingtemplateDNA[J].JBiochemBiophysMethods,2004,59(2):145_147)或在反應產物中加入熒光染料SYBRGreenI顯色(橙色為陰性，綠色為陽性)即可判斷LAMP反應是否發生。因此，LAMP可以實現反應及產物檢測一步完成，大大縮減檢測過程的時間。環介導等溫擴增反應的關鍵是需要針對檢測的對象設計特異性的引物。
發明內容本發明目的是提供用于檢測綿羊肺腺瘤病病毒的環介導等溫擴增反應(LAMP)引物；本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的檢測綿羊肺腺瘤病病毒的環介導等溫擴增反應(LAMP)引物，由一對內引物和一對外引物組成，其中，內引物對由引物SEQIDNO.1和SEQIDN0.2組成；外引物對由引物SEQIDN0.3和SEQIDN0.4組成。enJSRV與exJSRV的LTR主要差異存在于U3區，平均同源性僅為78%，而兩者在R區和U5區的同源性高達90%(MarceloD,Aurora0，DanielaS,etal.APCRtechniqueforthedetectionofJaggsiektesheepretrovirusinthebloodsuitableforthescreeningofovinepulmonaryadenocarcinomainfieldconditions[J].ResearchinVeterinaryScience，2005，79(3):259_264)，本發明所設計的特異性引物均位于U3區，成功排除了enJSRV的干擾，保證了診斷的特異性。本發明根據所設計的2對特異性引物，建立JSRV的LAMP檢測方法，對反應體系中的MgSO4BetaineBstDNAPoLymerasedNTP引物濃度等分別進行了優化，并進行敏感性和特異性試驗。結果表明所建立的反應體系在恒溫水浴鍋中作用60min即可得到其特有的階梯狀條帶，而且對內源性綿羊肺腺瘤病毒(enJSRV)的擴增結果為陰性，該方法對JSRV前病毒DNA的最小檢測限為10拷貝，靈敏性高于一步PCR方法。LAMP和特異性PCR及套式PCR方法檢測臨床樣品的符合率分別為92%和100%。該方法為綿羊肺腺瘤病的臨床檢測和基層檢疫提供了一種簡便、實用的方法，可望在綿羊肺腺瘤病的流行病學調查及防控方面起重要作用。本發明對JSRV檢測的反應條件進行了優化，建立了JSRVLAMP檢測方法。研究結果表明，本發明所建立的LAMP檢測方法具有較高的特異性及良好的靈敏度(用700ng健康羊基因組DNA和系列稀釋的陽性質粒pJSRV-Lamp)混勻，模擬病毒實際感染的狀態進行敏感性分析，可檢出不少于10拷貝數的模板)。對自然病例的13份肺組織、10份肺門淋巴結進行LAMP檢測，均顯示陽性，與臨床、病理組織學診斷及套式PCR方法檢測結果符合率為100%；對自然病例的4份腎組織和3份潛伏期羔羊外周血單個核細胞進行檢測，僅兩例外周血單個核細胞呈陽性反應。目前，本病活體羊的檢測只能以血液為樣本。因此，對于懷疑處于潛伏期的羊，宜以群為單位，以外周血單個核細胞為樣本進行LAMP檢測，以檢測結果判斷群體的感染狀態，是活體群體普查OPA的一種有效的手段。本發明所建立的LAMP檢測方法基本克服了目前在臨床和實驗室診斷JSRV方面存在的一些不足，操作簡便，可在等溫條件下進行擴增，無需復雜儀器設備，成本低，為臨床檢測提供了一個快速簡便的新方法，可以廣泛用于JSRV的早期診斷及預防控制方面。圖ILAMP引物對應于LTR的位置。圖2標準LTR序列的擴增；M=DNAMarkerDL2000；1:H20對照；2陰性對照；3=PCR產物。圖3JSRVLAMP檢測；M:DNAMarkerDL2000；1=LAMP產物；2=H2O對照；3陰性對眧。圖4LAMP擴增產物的酶切鑒定；M:DNAMarkerDL2000；1=H2O對照；2=LAMP擴增產物；3=LAMP擴增產物的酶切結果。圖5特異性PCR及LAMP敏感性的比較；M:DNAMarkerDL2000；1-91XIO8'7'6'5'4'3'2,1'0拷貝陽性質粒+700ng綿羊基因組DNA；10:ddH20+700ng綿羊基因組DNA。圖6病料LAMP產物的顯色結果；Al_4臨床新鮮的肺門淋巴節樣品；A6_9臨床新鮮的肺樣品；B1-6陳舊肺門淋巴節樣品；C1-9陳舊肺組織樣品；D1-3外周血單核細胞(PBMC)；E1-4；臨床腎組織樣品；“_”陰性對照。具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。試驗例一、試驗材料與試驗方法1樣品的來源及處理陽性標準病料肺腫瘤組織采自內蒙古羊場自然感染JSRV的病例，經病理解剖、病理組織學診斷和電鏡觀察鑒定確診為綿羊肺腺瘤病；臨床樣本肺腫瘤組織、肺門淋巴結、腎組織來源于自然感染羊、外周血單核細胞來源于潛伏期的人工氣管內接毒羔羊，病料均置-80°C，由內蒙古農業大學獸醫學院綿羊肺腺瘤病課題組保存。健康對照羊肺臟、肺門淋巴結、腎取自哈爾濱種羊場，-80°C凍存。2常用試劑Tissue/BloodDNA提取試劑盒、質粒小提試劑盒購于omega公司；pMD18_T、ExTaqDNA聚合酶、dNTPMixture、MarkerDL2000等均購自寶生物工程(大連)有限公司。甜菜堿(Betaine)為Sigma公司產品；BstDNA聚合酶大片段為北京紐英倫生物技術有限公司產品；熒光染料SYBRGREENI為杰特偉公司產品。3引物設計應用軟件ClustalX(1.8)對enJSRV與exJSRV進行序列對比，發現兩者的差異主要存在于LTR的U3區及編碼跨膜蛋白的TM區，但因TM區為高變區，故本研究針對LTR，利用PrimerExplorerV4軟件在序列保守區域設計LAMP引物，序列如下。F35'-TACCTAAGCTCCCTGTCC-3’，B35’-GGATCAGACCAAAACGGC-3’，FIP:5’-CCTGGTATTTCTGTGAAGCAGTTTTTATTTTTAAAAGCTCTTAAGGCTCG-3，，BIP:5’-CGGTGGGTGTAGCTTATAATGAATTTTTGATACTCTGCTTTATTACAATGC-3，。4基因組DNA的提取健康羊肺組織及肺腫瘤組織、肺門淋巴結、腎組織總DNA的提取將30mg肺組織在液氮中充分磨碎后，按omegaTissueDNA提取試劑盒的步驟提取組織總DNA；外周血單個核細胞總DNA按omegaBloodDNA提取試劑盒的步驟操作。獲得的DNA經0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用紫外分光光度計檢測DNA濃度及純度后，立即使用或保存于-80°C備用。5LAMP診斷方法的優化及建立5.1陽性質粒的構建以提取的陽性標準病料總DNA為模板，以外引物F3、B3進行PCR擴增，反應條件為反應總體系25μL，包括ExTaq酶(5U/μL)0.25μL，10X緩沖液(含Mg離子)2.5μL，dNTP(各215mmol/L)2yL，20pmol/yL的上游引物和下游引物各1μL，陽性標準病料總DNA模板3yL，ddH20補至25yL。PCR擴增參數為94°C預變性5min后進入以下循環，95°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，進行30個循環，最后于72°C延伸5min。此PCR產物，在的瓊脂糖凝膠(0.5yg/mLEB)上進行電泳，鑒定并純化。純化后的PCR產物，與PMD18-T載體16°C連接過夜。常規方法轉化感受態細胞DH5α，涂Amp抗性板并進行藍白斑篩選，37°C培養過夜，挑白色菌落作菌液PCR確定陽性克隆，按離心型質粒提取試劑盒操作6說明小提質粒。并送irwitrogen公司測序。對陽性質粒用紫外分光光度計檢測濃度及純度，計算拷貝數。5.2LAMP反應體系優化根據反應體系優化策略，依次對反應溫度、Mg2+濃度、甜菜堿濃度、引物濃度進行優化，具體梯度如下=Mg2+終濃度分別為2、4、6、8、10mmol/L；甜菜堿終濃度分別為0.2,0.4、0.6,0.8、1、1.2,1.4,1.6mol/L；dNTP混合液終濃度為l、2、3、4、5mmol/L；內外引物終濃度分別為內引物0.4,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8、2.0μmol/L；內、外引物比例分別為2、4、6、8、10；反應溫度分別為60、61、62、63、64、65°C。在25μL的反應體系中BstDNA聚合酶8U，模板2μL。所有體系在65°C分別反應60min，80°C加熱IOmin終止反應，取5μL反應產物上樣于瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以確定最佳的反應體系。5.3LAMP反應時間檢測優化后的反應體系在65°C分別反應30、45和60min，80°C加熱IOmin終止反應以確定最少反應時間。取5μL反應產物上樣于瓊脂糖凝膠電泳鑒定，剩余擴增產物加2μL的1000XSYBRGreenI進行可視化結果鑒定。5.4LAMP反應產物內切酶鑒定用01igo6.0軟件分析LAMP目的片段中的酶切位點，并篩選出單一的AflII(位點CTTAAG)，酶切產物為182bp和46bp。20μL反應體系中含AfIII10U，10X緩沖液2μL，0.1%BSA2μL，LAMP產物5μL，滅菌水補足至20μL，37°C反應2h，1%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定。5.5重復性試驗按照上述確定的反應條件，以陽性標準病料DNA為模板，重復試驗3次，以便對建立的方法條件進行穩定性分析。5.6特異性及敏感性測定鑒于病羊肺腫瘤組織DNA中整合的外源性前病毒exJSRV拷貝數的不穩定性，及受高拷貝數內源性DNAenJSRV的干擾，本實驗以含enJSRV的健康羊基因組DNA700ng為背景，分別與108’7’6’5’4’3’2’ι’°拷貝數的陽性質粒pJSRV-Lamp混勻作為模板進行LAMP反應。6臨床樣品的檢測提取4只自然發病羊的新鮮肺腫瘤組織及各羊只對應的肺門淋巴結、腎組織DNA；提取3例人工病例外周血單核細胞DNA；提取本課題組近五年來收集凍存的6例肺門淋巴結陳舊病料及9例肺組織陳舊病料DNA為模板，進行LAMP反應，反應產物用2μ1的1000XSYBRGreenI顯色(橙色為陰性，綠色為陽性)。或取5μ1擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳分析，EB染色，凝膠成像系統觀察是否呈梯狀條帶。二、試驗結果1陽性質粒的構建以陽性標準病料總DNA為模板，以外引物F3、B3進行PCR擴增，擴增產物經凝膠電泳顯示為1條約230bp的目的片段(圖2)，與預期大小一致。將PCR產物與pMDIS-T載體連接，獲得的陽性粒pJSRV-Lamp送上海生工進行雙向測序，結果表明pJSRV-Lamp對應區域序列完全一致，實際為228bp。pJSRV-Lamp的序列與Genbank上exJSRV參考株(ACCESSIONNCOO1494)的對應區域同源性達90%，與Genbank上enJSRV參考株(ACCESSIONAF153615)的對應區域同源性僅為69%，說明擴增到的目的序列確實為外源性LTR。2LAMP檢測方法的優化經優化之后的LAMP反應體系(25μL)包括6mmol/LMgSO4、2mmol/LdNTPs、lmol/LBetaine、FIP/BIP各2μmol/L、F3/B3各0.2μmol/L、8UBstDNA聚合酶大片段、IOXThermopolbuffer以及適量的DNA模板；最佳反應溫度65°C，反應時間60min。擴增后產物加入SYBRGreenI染料陽性對照顯示綠色而以正常羊基因組作為陰性對照和以水作為空白對照的反應管為橙色(結果見圖3A)。電泳檢測結果陽性對照產生梯狀條帶而以正常羊基因組作為陰性對照和以水作為空白對照的泳道均無擴增產物(見圖3B)。3反應產物內切酶鑒定LAMP產物經AflII限制性內切酶酶切得到大小分別為182bp和46bp的兩個DNA片段，結果與預期大小一致(圖4)，證明LAMP產物正確。4重復性試驗用陽性標準病料DNA為模板，以上述優化好的條件進行LAMP擴增，重復試驗3次，并設pJSRV-Lamp為陽性對照，健康羊基因組DNA為陰性對照。在三次重復試驗中，陽性對照和陽性標準病料每次都可擴增出梯形條帶，而陰性對照擴增后未出現相應的條帶，說明了本實驗建立的LAMP檢測方法具有高度的穩定性和重復性。5特異性及敏感性測定以108’7’6’5’4’3’2’1’°拷貝數的陽性質粒pJSRV-Lamp分別與健康羊基因組DNA700ng混勻作為模板進行LAMP擴增，反應結束后進行凝膠電泳檢測，產物上樣量均為5μL。凝膠電泳結果如圖5。結果表明LAMP方法能以不少于10拷貝的模板擴增出特異性條帶，敏感性為特異性PCR的10倍。6臨床樣品的檢測用本發明人實驗室建立的特異性PCR(羅軍榮，劉霄卉，余群英，等.綿羊肺腺瘤病特異性PCR及套式PCR診斷方法的建立[J],病毒學報，2009，25(2):125130)及本發明建立的LAMP檢測方法，對4份新鮮綿羊肺腺瘤自然病例的肺門淋巴結、肺、腎病料和3份潛伏期羔羊外周血單核細胞進行檢測，并提取凍存的6例淋巴結陳舊病料及9例肺組織陳舊病料DNA進行檢測，同時設健康羊肺組織總DNA為模板的陰性對照。結果表明4份新鮮肺門淋巴結及新鮮肺腫瘤(見圖6A)，6例肺門淋巴結陳舊病料(見圖6B)及9例肺組織陳舊病料(見圖6C)檢測結果均為陽性，腎臟檢測結果為陰性(見圖6E)；而LAMP對3份外周血單核細胞檢測結果有2例陽性1例陰性，敏感性高于特異性PCR方法(見圖6D)。LAMP檢測方法與特異性PCR及套式PCR方法檢測符合率分別為92%和100%(見表1)。表1應用LAMP與特異性PCR及套式PCR檢測臨床樣品權利要求檢測綿羊肺腺瘤病病毒(Jaagsiekteretrovirus)的環介導等溫擴增反應引物，其特征在于由一對內引物和一對外引物組成，其中，內引物對由引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2組成；外引物對由引物SEQIDNO.3和SEQIDNO.4組成。2.權利要求1的環介導等溫擴增反應引物在制備檢測綿羊肺腺瘤病病毒試劑中的用途。全文摘要本發明公開了檢測綿羊肺腺瘤病病毒的環介導等溫擴增反應引物，該引物由一對內引物和一對外引物組成，其中，內引物對由引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2組成；外引物對由引物SEQIDNO.3和SEQIDNO.4組成。enJSRV與exJSRV的LTR主要差異存在于U3區，本發明所設計的特異性引物均位于U3區，成功排除了enJSRV的干擾，保證了診斷的特異性。根據所設計的2對特異性引物，本發明建立JSRV的LAMP檢測方法，并進行敏感性和特異性試驗。本發明所建立的檢測方法可以準確的檢測綿羊肺腺瘤病病毒，該方法特異性強、靈敏度高，為綿羊肺腺瘤病的臨床檢測和基層檢疫提供了一種簡便、實用的方法。文檔編號C12Q1/68GK101935713SQ201010274280公開日2011年1月5日申請日期2010年9月7日優先權日2010年9月7日發明者劉霄卉,周建華,羅軍榮,馬學恩申請人:內蒙古農業大學;中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所