專利名稱：可溶性表達Not I的工程菌及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種工程菌，尤其涉及一種高效可溶性表達Not I的工程菌及其構建 方法，本發明還涉及該工程菌在制備Not I酶的應用，屬于表達限制性內切酶Not I的工程 菌構建領域。
背景技術：
限制性內切酶是當代基因工程研究不可缺少的重要工具，它的純度直接影響基因 克隆，核苷酸序列分析以及酶學性質研究等實驗結果。自60年代末期，人們提出第一個限 制性內切酶之后，越來越多的限制性內切酶被發現、提純及應用。Not I是一種罕見的限制 性內切酶，它可識別八個堿基的核苷酸序列(5' -GC/GGCCGC-3')，在低鹽的情況下它還 可識別(5' -AC/GGCCGT-3')。由于其識別位點每65kb的隨機堿基序列中才出現一次， 故可被用于基因組大片段的產生以及DNA甲基化定位圖譜的繪制。Not I的識別位點中富 含G:C序列，故其在真核生物基因組的GpC島上出現頻率較高。GpC島通常位于基因轉錄 起始區域，并且是DNA甲基化的熱點區域，因此它可在很大程度上影響基因的表達。Not I 對甲基化相當敏感，甲基化其識別位點的2或6位胞嘧啶上C5的任何一位都會阻止DNA 被切割。基于其低頻率性和甲基化敏感性，Not I通常可被用于在地標基因組掃描技術 (Restriction Landmark Genomic Scanning,RLGS)中引進放射性標記物，這一技術已在腫 瘤細胞中異常甲基化的研究中得到了廣泛應用。Not I發現于1985年，作為一種罕見的限制性內切酶，其識別序列在E. coli K12 中僅出現了 23次。盡管Not I位點存在頻率低，但即使是在可嚴格控制的表達系統中， 其識別位點也必須進行修飾以使宿主菌得以生存，正是基于這一原因的存在，Richard D.等在其關于Not I的研究中提到，Not I限制性內切酶的成功克隆存在相當大的困難。 J. A. McClarin等人，在1986年發表的應用X-射線晶體學技術測定限制性內切酶-DNA復合 物分子結構的研究中指出，II型限制性內切酶是以同型二聚體的形式與靶DNA序列發生作 用的。在常規分子生物學實驗中Not I是一種十分常用的限制性核酸內切酶，但在商業 化生產中仍存在重組菌株蛋白產量低、純化工藝復雜等原因。之前報道的Not I純化流程 涉及到了磷酸纖維素陰離子交換柱、肝素瓊脂糖親和層析柱、DEAE-瓊脂糖柱、PEI柱四步 上柱洗脫過程，最后再將Not I在其存儲緩沖液中透析過夜，整個純化流程約需3-4d，工藝 繁瑣且蛋白損失嚴重。
發明內容
本發明的目的之一是提供一株高效可溶性表達Not I的工程菌；本發明的目的之二是提供一種構建上述高效可溶性表達Not I的工程菌的方法；本發明的目的之三是將上述工程菌應用于表達Not I的表達和純化，并對所述表 達和純化方法進行優化；
本發明上述目的是通過以下技術方案來實現的一株高效可溶性表達Not I的工程菌，包括甲基化酶Eag I M基因、限制性內切 酶 Not I 基因和大腸桿菌(E. coli)ER2566(mcrC- mrr)。其中，所述甲基化酶Eag I M基因的堿基為SEQ ID NO. 1所示，所編碼的氨基酸為 SEQ ID NO. 2所示；所述限制性內切酶Not I基因的堿基為SEQ ID N0. 3所示，所編碼的氨 基酸為SEQ ID N0. 4所示；其中，所述大腸桿菌(E. coli)ER2566(mcrC-mrr)是大腸桿菌Ε. coli的突變株，其 缺失了甲基化抵制系統。本發明還提供一種構建高效可溶性表達Not I工程菌的方法，包括(1)將甲基化 酶Eag I M基因與原核表達載體可操作性的相連接，得到重組質粒；將重組質粒轉化大腸桿 菌(E. c0li)ER2566(mcrC-mrr)，構建得到中間菌；(2)將限制性內切酶Not I基因與原核表 達載體可操作性的相連接，得到重組質粒；(3)將步驟(2)所得到的重組質粒轉化步驟(1) 所得到的中間菌，篩選，鑒定，即得。其中，步驟(1)中所述的原核表達載體優選為PBR322 ；步驟(2)中所述的原核表 達載體優選為PACYC184 ；大腸桿菌(E.coli)ER2566 (mcrC-mrr)、pBR322 和 pACYC184 都可通過商業途徑購
買得到。本發明的另一個目的是提供一種制備Not I的方法，包括培養所構建的工程菌， 誘導蛋白表達；收集、純化所表達的蛋白，即得。其中，本發明通過大量的試驗發現，當溫度為20°C，IPTG終濃度為0. 35mmol/L，轉 速為55r/min條件下誘導10小時的誘導表達條件，可顯著提高Not I的可溶性及產量。所述的蛋白純化方法優選采用AKTApurifier 100蛋白純化系統進行純化，包 括DEAE Sephrose FF離子交換層析、Phenyl HP疏水層析和Superdex 7510/300GL分子篩
層析三步純化；本發明對三步純化的各工藝條件進行了優化和篩選，具體如下對于離子交換層 析，優選的，所采用的結合緩沖液包括20mmol/L Tris-HCl, pH7. 5 ；所述洗脫緩沖液包括: 20mmol/L Tris-HCl,lmol/LNaCl, ρΗ7·5。對于疏水層析，優選的，所述結合緩沖液包括50mmol/L Na3PO4,1. 5mol/ L(NH4)2SO4, pH7. 5 ；洗脫緩沖液包括50mmol/L Na3PO4, pH7. 5。對于分子篩層析，優選的，所述平衡緩沖液包括10mmol/L Tris-HCl, 100mmol/L NaCl，10mmol/L MgCl2, ρΗ7· 5。本發明在分離和鑒定了 Not I基因后，通過重組體的改建，獲得高效可溶性表達工 程菌，通過對重組工程菌進行誘導條件摸索及蛋白純化工藝的優化，制備出高純度Not I限 制性內切酶，并對純化后的該酶進行酶切活性檢測。本發明所制備的Not I是通過以pBMN質粒為底物檢測其生物活性。Not I酶 切條件包括25yg Not Ι，50μ1 Not I酶切反應液，1. 0 μ gpBMN質粒，37 °C作用1小 時。Not I 酶切反應液，包括:10mmol/LTris-HCl (ρΗ7· 5)，10mmol/L MgCl2, 7mmol/L 巰基 乙醇，10(kimol/LNaCl。Not I酶切終止反應液，包括50%甘油，0. 05%溴酚藍，0. 2mmol/L EDTA (ρΗ8· 0)。
本發明檢測了所制備的Not I酶的主要特性該酶分子量為43kDa，酶的最適反應 溫度為371，最佳？!1為7.5。但James C.等報道，在自然狀態的物種中所分離得到的Not I蛋白為85kDa，且目前商品化的Not I也為85kDa，而本發明所獲得的Not I蛋白分子量約 為 43kDa。構建本發明工程菌的關鍵在于第一，甲基化限制基因(Methylation requiring restriction, mrr)是大腸桿菌細胞防御系統中重要的基因之一，它能嚴格限制存在甲基 化的外源DNA的介入。許多菌株(E.coli)包括實驗室常用的一些菌株都有抵制具有甲 基化作用的外源基因轉入的作用，故在克隆過程中經過仔細考慮選擇了 E. coli的突變株 ER2566(mcrC-mrr)其甲基化抵制系統是缺失的，可用于限制酶和甲基化酶的克隆、表達。 第二，由于PBR322和PACYC184分屬于不同的不親合群，故彼此可以在同一個宿主菌中穩 定共存，且PACYC184較pBR322拷貝數低，因此表達甲基化酶重組質粒pBR322-Eag I M轉 入宿主細胞后才能表達足夠量的Eag I M甲基化酶使宿主基因組及其中的重組載體免受 后轉入質粒pACYC184-Not I所表達的限制性內切酶Not I的切割；另外，在本研究的進行 中也曾嘗試應用Not I M甲基化酶來進行甲基化修飾性保護，但由于其甲基化修飾作用不 足，使得Not I克隆、表達未成功，Eag I M的識別位點為(5' -CGGCCG-3')為Not I識 別位點(5' -GCGGCCGC-3')的子集，它可將Not I識別位點高效率甲基化修飾以提供強 有力的保護作用，故可應用于Not I的克隆、表達。上述綜合條件的具備方可使得工程菌 ER2566 [pBR322-Eag I Μ, pACYC-184-Not I]的構建得以成功，再經過誘導表達條件的優化 使得Not I蛋白的高效可溶性表達得以實現。本發明應用AlTApurifier 100蛋白純化系統，通過DEAES印hrose FF離子交換 層析、Phenyl HP疏水層析和Superdex 7510/300GL分子篩層析對蛋白進行提純，經純化工 藝摸索及條件優化，整個純化過程僅需7-8h，簡化了純化過程、大大縮短了提純時間，從而 保證了酶活性，有利于酶產量的提高。且在最后一步分離中應用Superdex 7510/300GL分 子篩層析技術不僅可使目的蛋白進一步純化，還可將蛋白置換到其穩定的緩沖液中，低溫 保存，避免了透析不充分及污染物對蛋白的降解，有利于酶產量及質量的提高。純化后Not I經酶活力分析產量達9.8 X 106U/g工程菌，明顯高于所報道的克隆菌株的產量。該Not I 高效可溶性表達工程菌的構建及純化工藝的優化升級是相當有價值的，它不僅方便常規分 子生物學研究中的應用，同時有利于大量獲得該蛋白并對其進行深入研究，純化流程的經 濟簡化也為商業化大量生產該酶提供了依據。
圖1最佳誘導劑濃度的摸索；1,3, 5 =IPTG濃度分別為0. 2mmol/L,0. 35mmol/L, 0. 5mmol/L 時細胞裂解上清，37°C 作用 3h ；2，4，6 :IPTG 濃度分別為 0. 2mmol/L,0. 35mmol/ L，0. 5mmol/L時細胞沉淀，37°C作用3h ；M 蛋白分子量標準。圖2最佳誘導時間的摸索；1，2 分別為未誘導細胞裂解后的上清和沉淀；3，5，7， 9，11 :20°C、55r/min，0. 35mmol/L IPTG 誘導 4h，7h，10h, 13h, 16h 后細胞裂解上清；4，6，8， 10 :20°C、55r/min，0. 35mmol/L IPTG 誘導 4h，7h，10h, 13h, 16h 后細胞裂解沉淀；M 蛋白分
子量標準。圖3DEAE Sephrose FF層析純化Not I的線性梯度洗脫結果；虛框部分為目的蛋白洗脫峰。圖4DEAE Sephrose FF層析純化Not I的步級梯度洗脫結果；虛框部分為目的蛋 白洗脫峰。圖5Phenyl HP層析純化Not I的線性梯度洗脫結果；虛框部分為目的蛋白洗脫 峰。圖6Phenyl HP層析純化Not I的步級梯度洗脫結果；虛框部分為目的蛋白洗脫 峰。圖7SuperdeX7510/300GL分子篩層析純化Not I結果；虛框部分為目的蛋白洗脫峰。圖8離子交換層析、疏水層析和分子篩層析三步純化方法比較；1 蛋白粗制樣品； 2 DEAE Sephrose FF 純化蛋白；3 :Phenyl HP 純化蛋白；4 :Superdex7510/300GL 純化蛋白。圖9Not I酶切活性檢測結果；M :DL2000 ； 1-4 :37 °C，濃度分別為0. 7 μ g/μ 1， 0· 5 μ g/ μ 1，0· 3 μ g/ μ 1 禾口 0· 1 μ g/ μ 1 的 Not I 對 pBMN 作用 Ih ；5 :pBMN 質粒。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例1本發明Not I高效可溶性表達工程菌的構建1、重組質粒pBR322_Eag I M的構建將甲基化酶Eag I M的核苷酸序列(兩端分別引Nhe I和SphI酶切位點)克隆 至pBR322載體(購自TaKaRa公司)上，構建重組質粒pBR322_Eag I Μ。2、電轉化此重組質粒經測序正確后于Bio-Rad Gene Pluser電轉儀3000V，25 μ F，200 Ω， 4. 6ms條件下電擊轉化感受態細胞ER2566(購自NewEngland Biolabs, Inc.)，涂布于含 100mg/L Ampicillin的LB平板上，37°C倒置過夜培養篩選陽性克隆。3、重組質粒pACYC184_Not I的構建將限制性內切酶Not I的核苷酸序列(兩端均引BamH I酶切位點)克隆至 PACYC184 載體(購自 New England Biolabs, Inc.)上，構建重組質粒 pACYC184_Not I。4、電轉化此重組質粒經測序正確后于Bio-Rad Gene Pluser電轉儀電擊轉化已被甲基化保 護的 ER2566[pBR322-Eag I Μ]，涂布于含 50mg/Lchloromycetin 和 100mg/L Ampicillin 的LB平板上，37°C倒置過夜培養，經篩選鑒定構建成表達限制性內切酶Not I的工程菌 ER2566[pBR322-EagI M，pACYC-184-Not I]。5、蛋白表達(1)活化挑取單菌落于 IOmlLB(50mg/L Chloromycetin和 100mg/L Ampicillin) 中，37°C振搖過夜；
(2) 二次活化1/100 接菌(1000ml 接種 IOml, 50mg/Lchloromyceti η 和 100mg/L Ampici 11 in)，37°C振搖 2-3 小時至 OD6tltl = 0. 3 ；(3)誘導設置兩組，分別按照以下誘導條件進行誘導試驗組溫度20°C，IPTG 終濃度0· 35mmol/L,轉速55r/min，振搖時間10小時；對照組溫度20°C，轉速55r/min，振搖時間10小時。(4)收菌:4°C，4000r/min,離心30分鐘，用lysis buffer沖懸，再離心，棄上清， 菌于-80°C凍存。重組蛋白Not I的最佳誘導劑濃度和最佳誘導時間的摸索，SDS-PAGE的電泳結果 分別見圖1和圖2。從實驗結果可見，采用試驗組的誘導條件可顯著提高蛋白的可溶性和表
達產量。試驗例1本發明三步法制備Not I及其酶切活性的檢測1、試驗材料供試樣品實施例1所構建的工程菌；試劑DEAES印hrose FF, Phenyl HP, Superdex75 10/300GL。2、試驗方法及結果(1)重組蛋白樣品制備①融菌將實施例1中所制備的菌冰上融化，加溶菌酶(1000ml菌=15ml lysis buffer, Iml lysis buffer中加入Img溶菌酶)和lysis buffer后，冰上放置60分 鐘。Lysis buffer，包括20mmol/L Tris-HCl，20ug/ml DNase I, lmmol/L MgCl2, lmmol/L PMSF, ρΗ7· 5。②超聲破碎1000ml菌大約35分鐘。③4°C，14000r/min離心10分鐘，收集上清。(2)離子交換層析純化Not I用結合緩沖液A(20mmol/L Tris_HCl，pH7. 5)平衡 DEAES印hrose FF 離子交換柱， 平衡好后上樣，用5個柱體積的結合緩沖液A洗去結合力弱的雜蛋白，之后用洗脫緩沖液 A(20mmol/L Tris-HCl，lmol/L NaCl,pH7. 5)進行線性梯度洗脫，利用收集器收集蛋白并用 SDS-PAGE鑒定。結果見圖3和4。(3)疏水層析純化Not I 在第一步純化的蛋白中加入2倍體積的緩沖液(50mmol/L Na3PO4, 2mol/ L (NH4) 2S04，pH7. 5)，4°C放置1小時，12000g離心5分鐘，收集上清。用結合緩沖液B (50mmol/ L Na3PO4,1. 5mol/L (NH4) 2S04，pH7. 5)平衡Phenyl HP疏水層析柱，平衡好后上樣，用5個柱 體積的結合緩沖液B洗去結合力弱的雜蛋白，之后用洗脫緩沖液B (50mmol/LNa3P04, pH7. 5) 進行線性梯度洗脫，利用收集器收集蛋白并用SDS-PAGE鑒定。結果見圖5和6。
(4)分子篩層析純化Not I用PEG8000將上步含目的蛋白的部分濃縮，用平衡緩沖液C(10mmOl/L Tris-HCl， IOOmmol/L NaCl, 10mmol/L MgCl2, pH7. 5)平衡 Superdex75 10/300GL 分子篩層析柱，平衡 好后上樣，用收集器收集蛋白并用SDS-PAGE鑒定。結果見圖7。
離子交換層析、疏水層析和分子篩層析: 表INot I的三步純化方法比較結果步純化方法比較結果，見圖8和表I權利要求
可溶性表達Not I的工程菌，包括甲基化酶EagI M基因、限制性內切酶Not I基因和大腸桿菌(E.coli)ER2566(mcrC mrr)。
2.按照權利要求1所述的工程菌，其特征在于所述甲基化酶EagI M基因的堿基為 SEQ ID NO. 1 所示。
3.按照權利要求1所述的工程菌，其特征在于所述限制性內切酶NotI基因的堿基為 SEQ ID NO. 3 所示。
4.一種構建權利要求1-3任何一項所述工程菌的方法，包括(1)將甲基化酶Eag I M基因與原核表達載體可操作性的相連接，得到重組質粒；將重組質粒轉化大腸桿菌 (E. c0li)ER2566(mcrC-mrr)，構建得到中間菌；(2)將限制性內切酶Not I基因與原核表達 載體可操作性的相連接，得到重組質粒；(3)將步驟(2)所得到的重組質粒轉化步驟(1)所 得到的中間菌，篩選，鑒定，即得。
5.按照權利要求4所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述的原核表達載體為 PBR322 ；步驟(2)中所述的原核表達載體為pACYC184。
6.按照權利要求4所述的方法，其特征在于所述甲基化酶EagI M基因的堿基為SEQ ID NO. 1所示；所述限制性內切酶Not I基因的堿基為SEQ ID NO. 3所示。
7.權利要求1-3任何一項所述的工程菌在制備NotI酶中的應用。
8.按照權利要求7所述的應用，包括培養權利要求1-3任何一項所述的工程菌，誘導 蛋白表達；收集、純化所表達的蛋白，即得。
9.按照權利要求7或8所述的應用，其特征在于所述的誘導條件是溫度為20°C， IPTG終濃度為0. 35mmol/L，轉速為55r/min，誘導時間10小時。
10.按照權利要求7或8所述的應用，其特征在于所述的蛋白純化方選采用AKTA purifier 100蛋白純化系統進行純化，包括DEAE Sephrose FF離子交換層析、Phenyl HP 疏水層析和Superdex 75 10/300GL分子篩層析三步純化；優選的，對于離子交換層析，所采用的結合緩沖液包括20mmol/L Tris-HCl,pH7. 5 ；所 述洗脫緩沖液包括20mmol/LTris-HCl，lmol/L NaCl，pH7. 5 ；對于疏水層析，所述結合緩沖液包括50mmol/L Na3PO4,1. 5mol/L(NH4)2S04, pH7. 5 ；洗 脫緩沖液包括50mmol/L Na3PO4, pH7. 5 ；對于分子篩層析，所述平衡緩沖液包括IOmmol/L Tris-HCl，IOOmmol/L NaCl， IOmmol/L MgCl2, ρΗ7· 5。
全文摘要
本發明公開了可溶性表達Not I的工程菌及其構建方法和應用。本發明工程菌包括甲基化酶Eag I M基因、限制性內切酶Not I基因和大腸桿菌(E.coli)ER2566(mcrC-mrr)。本發明在分離和鑒定了Not I基因后，通過重組體的改建，獲得高效可溶性表達Not I的工程菌。本發明通過對重組工程菌進行誘導條件摸索及蛋白純化工藝的優化，制備出高純度的Not I限制性內切酶。
文檔編號C12N1/21GK101948795SQ20101027427
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月7日 優先權日2010年9月7日
發明者任桂萍, 葉賢龍, 張巧, 李德山 申請人:東北農業大學