胰島素在制備促進頜骨組織愈合的藥物中的用途的制作方法

專利名稱：胰島素在制備促進頜骨組織愈合的藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及胰島素的一種藥用用途。具體而言，本發明涉及胰島素可以作為促進動物頌骨組織愈合的藥物。本發明首先將胰島素作用于頌骨組織的體外培養細胞，促進了頌骨成骨細胞的增殖；其次，本發明將胰島素局部給藥作用于頌骨組織，胰島素增強了大鼠拔牙窩頌骨組織愈合的能力。
背景技術：
胰島素由51個氨基酸組成A，B兩條肽鏈，A鏈含21個氨基酸，B鏈含30個氨基酸，兩條肽鏈之間借兩個二硫鍵聯結，A鏈的第6與第11位氨基酸之間也有一個二硫鍵 [Lu H, Kraut D, Gerstenfeld L et al. Diabetes interferes with the bone formation by affecting the expression of transcription factors that regulate osteoblast differentiation. Endocrinology. 2003, 144(1) :346-52.Yuksel, E. ， ffeinfeld. A. B.， Cleek. R. et al. Increased free fat-graft survival with the long-term, local delivery of insulin, insulin-like growth factor—I, and basic fibroblast growth factor by PLGA/PEG microspheres. Plast. Reconstr.Surg 2000,105(5) :1712-1720.]。 人胰島素分子量為5. 7KD，等電點為pH5. 6。在酸性環境(pH2. 5-3. 5)較穩定，在堿性溶液中易被破壞，可形成鋅、鈷等胰島素結晶。又由于其分子中酸性氨基酸較多，可與堿性蛋白如魚精蛋白等結合，形成分子量大、溶解量低的魚精蛋白鋅胰島素。此種制劑注入皮下或肌肉吸收較慢，作用時間長，為長效胰島素。從胰島分泌的胰島素，經門脈進入肝臟，40% -50% 在肝內分解，其余進入體循環分布于全身。從靜脈注射胰島素，90%在20min內從血液中消失，絕大部分被組織吸收或被肝臟滅活。胰島素的生理作用主要為促進合成代謝，主要靶器官是肝臟、脂肪組織、骨骼肌[Krakauer JC, McKenna MJ, Buderer NF, et al. Bone loss and bone turnover in diabetes. Diabetes. 1995,44(7) :775-782. Bouillon R, Bex M, Van Herck E et al. Influence of age, sex, and insulin on osteoblast function osteoblast dysfunction in diabetes mellitus. Clin Endocrinol Metab. 1995,80 (4) 1194-1202. Rosen CJ, Ackert-Bicknell CL, Adamo ML et al. Congenic mice with low serum IGF-I have increased body fat,reduced bone mineral density,and an altered osteoblast differentiation program. Bone. 2004. 35 (5) 1046-1058.]。胰島素使進食后吸收的葡萄糖大量轉化成糖原貯存，抑制糖原異生。在對蛋白質代謝調節方面，胰島素主要對蛋白質合成和貯存起作用，它通過與受體結合能促進氨基酸轉運入細胞，并作用于核糖體，增加核糖核酸和脫氧核糖核酸生成，從而進一步增加蛋白質合成Devlin， H.J. Hoyland, J. F. Newall et al.Trabecular bone formation in the healing of the rodent molar tooth extraction socket. Bone Miner Res.1997,12(12) :2061-2067.]。姨島素雖然是目前治療糖尿病的主要藥物，但是它分子量大，半衰期短，脂溶性差，不易透過生物膜，易被胃腸道的酶所降解，所以迄今為止胰島素最為廣泛的使用途徑是以注射用藥為主。采用胰島素治療可緩解糖尿病對口腔局部種植體愈合的不利影響，減輕種植體周圍因糖尿病而發生的病理變化[Boney,C. Μ.，Moats_Staats，B. Μ· ,Stiles et al. Expression of insulin-like growth factor-1(IGF-I) and IGF-binding proteins during adipogenesis. Endocrinology. 1994,135 :1863-1868. Bouxsein ML, Rosen CJ, Turner CH et al. Generation of a new congenic mouse strain to test the relationships among serum insulin-like growth factor I,bone mineral density,and skeletal morphology in vivo. Bone Miner Res. 2002，17 (4) :570_579.]，增強種植體骨愈合能力成為糖尿病患者牙種植治療的關鍵。糖尿病是一種常見的內分泌代謝病，是以胰島素絕對或相對不足所致的血糖及尿糖增高為主要特征并導致糖、蛋白質和脂肪代謝障礙的全身慢性代謝異常綜合癥。目前中國糖尿病患者已經達到5000萬，占世界糖尿病人群總數的1/5，患病率在印度之后居世界第二，并且以每天至少三千人的速度增加，每年增加超過一百二十萬 。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是糖尿病的主要類型，占所有糖尿病患者的90%以上。隨著經濟的發展、社會老齡化，T2DM患病率逐年增高。從世界范圍來看，T2DM已成為嚴重威脅人類健康的慢性病之一。中華醫學會糖尿病學分會于2007年6月至2008年5月在全國的14 個省市進行的最新糖尿病的流行病學調查結果顯示，城鎮糖尿病的患病率已達11. 28%。骨整合的發生是牙科種植體成功的基礎，然而高血糖會抑制成骨細胞的分化，還可以對骨基質及其成分產生有害作用，同時影響細胞外基質的粘連、生長、聚集導致糖尿病患者種植體周圍出現骨形成障礙。控制血糖最常用最有效的藥物就是胰島素，其生理作用主要為促進合成代謝，胰島素與細胞結合的程度取決于細胞上的受體數目和其親和力。受體的數目在正常生理條件下是恒定的，但由于細胞生理狀態不同(如生長速度，分化程度， 細胞周期等)和外界環境變化的影響，也會發生一定的改變。胰島素、胰島素樣生長因子 1 (IGF-D、胰島素樣生長因子2 (IGF-2)及其相應受體IR，IGF-IR和胰島素樣生長因子2受體(IGF-2R)都是屬于IGFs系統。研究表明，該系統可能對胚胎、神經、骨骼肌和骨骼的發育、細胞增殖和轉化等具有極其重要的作用。頌骨組織是面部重要的骨組織。頌骨組織的而整合發生是牙科種植體成功的基礎之一。為此，尋找一種更簡便易行的藥物促進和骨組織愈合具有重要的意義。目前，胰島素用于牙囊組織已經用些報道，但是胰島素直接給藥頌骨組織的研究還沒有。本發明另辟蹊徑，胰島素僅僅局部給藥頌骨組織，發現了胰島素可以有效的促進頌骨組織成骨細胞愈合。 這為胰島素的應用開辟了一個新途徑。胰島素作用于糖尿病病人可能會產生胰島素抵抗， 而局部用藥于頌骨組織可以避免胰島素抵抗的作用，從而促進2型糖尿病病人牙科種植體成功率。此外，由于胰島素可以體循環分布于全身，從而促進促進合成代謝；本發明采用局部給藥，降低了胰島素給藥給予正常人所帶來的負面效果，提高了胰島素在促進頌骨組織成骨細胞增殖的效率。

發明內容
本發明首先提供了胰島素的一種藥用用途。本發明所述胰島素在制備促進頌骨組織成骨細胞增殖、促進頌骨組織愈合的藥物中的用途，包括用細胞生物學實驗檢測胰島素促進體外頌骨組織成骨細胞的增殖；胰島素局部作用于活體動物的頌骨組織，促進頌骨組織的愈合。
本發明所指的胰島素的藥用用途針對的是動物頌骨組織。本發明所述的動物頌骨組織是指頌骨組織在體外培養的成骨細胞以及在動物活體的頌骨組織。本發明提高了胰島素的效用。本發明采用胰島素直接作用于頌骨組織，而不是通過靜脈注射等其他途徑。首先，本發明避免了胰島素的長期注射而帶來的副作用，并為2型糖尿病患者的頌骨組織愈合帶來了很大的促進作用。其次，本發明采用局部給藥，有效的提高了胰島素在頌骨組織愈合過程中的效率。


圖1各濃度胰島素組在不同時間對成骨細胞增殖的作用(MTT法)，*與對照組相比P < 0. 05。其中LA為不含胰島素的L-DMEM(含5. 5mM葡萄糖)，LB為含IOl胰島素的 L-DMEM ；LC為含1(Γ6Μ胰島素的L-DMEM ；LD為含1(Γ7Μ胰島素的L-DMEM。圖2各濃度胰島素組在不同時間對成骨細胞增殖的作用(MTT法)*與對照組相比，P < 0. 05。其中其中HA為不含胰島素的H-DMEM(含16. 5mM葡萄糖)，HB為含1(Γ5Μ胰島素的H-DMEM ；HC為含1(Γ6Μ胰島素的H-DMEM ；HD為含10〃Μ胰島素的H-DMEM。圖3兩種大鼠血糖值比較，*ρ < 0. 05。Wistar大鼠與GK大鼠血糖測定經統計學分析存在顯著差異，而且一直保持穩定狀態。圖4GK大鼠尾部血糖在不同時期快速測定結果。G2組在拔牙術前和術后快速測大鼠尾部血糖，血糖變化不明顯，沒有統計學差異。圖5Α圖為Wistar大鼠拔牙4周時χ線檢查結果；B圖為Wistar大鼠未拔牙側4 周X線檢查結果。圖6IRmRNA在不同組間拔牙窩愈合7d_28d的變化，*p < 0. 05，**p < 0. 01與對照組比。WN組頂mRNA水平表現為持續下降；GN組則表現為IRmRNA水平在14d達到高峰后開始下降為先升高后降低的趨勢Gl組也表現為先升高后降低趨勢，21d時達到高峰，隨后在28d時降到7d時水平G2組與WN組表現一致，在7-28d過程中持續下降。圖7IGF-lRmRNA在不同組間拔牙窩愈合7d_28d的變化，*p < 0. 05，**p < 0. 01 與對照組比。GN、G1組的IGF-IR mRNA水平較低，而且在此過程中改變無明顯統計學差異； G2組在7d，14d，21d明顯高于其它兩組，并在21d時達到峰值；WN組14d，21d顯著高于GN、 Gl 組(ρ < 0. 01)。
具體實施例方式實施例1胰島素對體外培養正常大鼠下頌骨成骨細胞增殖的影響本實施例以SPF級Wistar大鼠為材料，雌雄不限，體重180-220g，6_8周齡。實驗方法與步驟1)酶消與組織塊相結合的方法培養成年大鼠下頌骨成骨細胞。取Wistar大鼠，斷頸處死后，在75%的酒精中浸泡5min ；在無菌超凈臺中使大鼠仰臥，用碘伏棉簽消毒大鼠頸部及口腔，于頸部剪開大鼠皮膚，逐層剝離，暴露下頌骨；無菌取出帶有肌肉和筋膜的下頌骨，置于75%酒精中洗5-10seC，5. 25% NaClO中浸泡lmin， PBS(含100IU/ml青霉素、100IU/ml鏈霉素)反復沖洗3次；拔除牙齒，徹底刮除肌肉、筋膜和牙周組織；將下頌骨用咬骨鉗剪碎成約2mmX2mm的骨片，PBS緩沖液反復沖洗至骨碎塊呈白色；將骨片置入小培養瓶中，加0. 125%胰蛋白酶在水浴振蕩器中37C、150rpm消化 8min,消化6次后終止；收集第2至6次的消化液經200目不銹鋼篩網過濾并離心，去除上清后用含20%胎牛血清的L-DMEM(DMEM培養基為DMEM粉13. 4g，加NaHC032g，雙蒸去離子水1L，調PH值至7. 0，過濾除菌，分裝4°C保存。內含100IU/ml青霉素、100IU/ml鏈霉素) 重懸細胞；將細胞接種于培養瓶中在37°C、5% CO2、飽和濕度條件下于恒溫孵箱中靜置培養 40min ；差速貼壁除去成纖維細胞，純化成骨細胞后繼續培養經酶消化后剩下的組織塊，再次剪碎至ImmX 1mm，鋪于培養瓶中倒置培養，4h后翻瓶。待細胞長滿傳代。傳代時，差速貼壁40min反復純化成骨細胞。酶消化法和組織塊培養法的細胞均于4 換全液，以后每隔4 換半液或1/3換液。倒置顯微鏡下下嚴密觀察細胞生長狀況，待細胞長滿瓶底80%后用0. 125%胰酶(含0. 02%EDTA)消化傳代培養。 取生長良好的第4代細胞用于實驗及細胞功能鑒定。2)頌骨組織成骨細胞鑒定將第4代成骨細胞接種在蓋玻片上，培養3w后用95%乙醇固定15min，用Gomori 鈣-鈷法進行ALP染色。步驟如下固定好的蓋玻片經蒸餾水漂洗后，置入孵育液(3% β-甘油磷酸鈉5ml，2%戊巴比妥鈉5ml，2%硝酸鈣10ml，2%硫酸鎂5ml，蒸餾水25ml。) 中；37°C孵育2h，自來水沖洗3次；2%硝酸鈷中孵育lmin，自來水沖洗；自然干燥，封固。取第4代培養細胞接種于孔底鋪有蓋玻片的6孔板中，改用含10%新生牛血清的 L-DMEM培養液(其中含有50ug/ml維生素C和lOmmol/L β -甘油磷酸鈉)中培養，每3d換液一次，于第21d，鏡下見有較多不透明的礦化結節時取出蓋玻片，按茜素紅S染鈣法進行染色。步驟如下培養皿用PBS洗2次，95%酒精原位固定IOmin 茜素紅酒精配制，PH8. 3)染色5min ；50%酒精去除非特異性著色；自然干燥。將第4代成骨細胞接種在蓋玻片上，培養3w后用95%乙醇固定15min，用Van Gieson法進行I型膠原染色，步驟如下鐵蘇木素滴染5min，PBS沖洗3次；自來水振蕩返藍IOmin ；苦味酸酸性品紅染色5min ；95 %乙醇快速分化；乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片；光學顯微鏡下觀察并攝像。3)細胞爬片的免疫組化染色制作細胞爬片將對照組和糖尿病組第5代細胞以2 X IOVml接種到玻片上，培養 5d后，固定細胞。PBS(0. OlM PBS含0.05%吐溫)洗5min，放入濕盒；滴加0.3% Triton X-100，置于37°C孵箱孵育15min ；將爬片上的Triton X-100甩干，PBS振洗，5minX 3次；滴加3% H2O2 (0. Iml 30^H2O2與IOml純100%甲醇充分混勻，現用現配，37°C孵箱孵育20min ； PBS振洗，5minX3次；滴加適量稀釋的抗體，頂α 1與IGF-IRα 1均以1 100稀釋，4°C 過夜。37°C復溫lh，PBS振洗，5minX3次；滴加SP試劑盒中試劑一液，置于37°C孵箱孵育 IOmin ；PBS振洗，5minX3次；滴加SP試劑盒中試劑二液，置于37°C孵箱孵育IOmin ；PBS振洗，5minX 3次；滴加DAB顯色液(Iml蒸餾水加入濃縮DAB液1滴，現用現配)，鏡下控制顯色；蒸餾水終止顯色；蘇木素復染anin，水洗，鹽酸溶液(70%酒精配制)分化數秒，流動自來水返藍20min ；乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片；染色強度的判斷標準陰性-細胞核或胞質中無著色；弱陽性-細胞核或胞質中出現淺黃色染色顆粒；陽性細胞核或胞質中出現棕黃色染色顆粒；強陽性-細胞核或胞質中出現深棕色染色顆粒。
4)選擇胰島素適宜濃度每組設12個樣本將密度為2 X IO4個/ml的細胞接種于96孔板中，細胞融合后換為無血清培養基，次日加入含5%胎牛血清。實驗分組5.5mM葡萄糖(5.5mMG)L-DMEM(生理糖濃度)、16. 5mMG(高糖)濃度H-DMEM的培養液配制的不同濃度(0，10_5M，10_6M，10_7M) 胰島素培養，依次編號為LA，LB, LC, LD ；HA, HB, HC, HD ；繼續培養7d，隔日更換藥物和培養基；在培養周期的最后4h，每孔加入20 μ 1的ΜΤΤ，繼續孵育至結束；加入DMS0，于490nm用酶標儀測吸光度(OD)值。MTT法檢測成骨細胞的增殖，確定藥物最適濃度。實驗結果與討論1)成骨細胞鑒定堿性磷酸酶染色細胞生長21d后，已完全鋪滿整個蓋玻片，ALP染色可見細胞質內有大量棕色顆粒或塊狀沉淀。礦化結節染色成骨細胞在維生素C，磷酸甘油鈉存在條件下，可使胞外基質礦化，并形成多量礦化結節，經茜素紅染色呈紅色塊狀沉淀。I型膠原染色成熟的成骨細胞能合成I型膠原，是成骨細胞標志物之一，膠原染色可見大面積粉紅色染色。IR和IGF-IR在成骨細胞上的表達。IR和IGF-IR在成骨細胞上均有表達，均勻分布于成骨細胞的胞漿中。2)糖濃度及胰島素對于成骨細胞增殖的影響分別給予5. 5mM葡萄糖(5. 5mMG) L-DMEM (生理糖濃度)、16. 5mMG (高糖)濃度 H-DMEM的培養液配制的不同濃度(0，10_5M，10_6M，10_7M)胰島素培養，依次編號為LA，LB, LC, LD ；HA, HB, HC, HD。成骨細胞在5. 5mMG、16. 5mMG兩種培養基中培養，見成骨細胞的增殖在L-DMEM中表現更為活躍，高糖環境抑制成骨細胞的增殖。圖1所示為在L-DMEM中不同濃度胰島素對于成骨細胞增殖的影響，IiT6M與ICT7M濃度的胰島素都促進成骨細胞的增殖。 圖2顯示在H-DMEM中胰島素濃度不同對于成骨細胞增殖的影響，成骨細胞在ICT6M胰島素濃度中增殖更為活躍。本實驗在兩種糖濃度下培養了頌骨組織成骨細胞，結果發現高糖環境抑制頌骨組織成骨細胞的增殖，而IO-6M濃度胰島素可促進頌骨組織成骨細胞的增殖。高血糖改變葡萄糖介導的胰島素的分泌，這被稱為葡萄糖毒性。高濃度的葡萄糖能通過很多途徑影響胰島素，葡萄糖通過調節包括IGF-IR和IR基因在內的許多基因，并且是在轉錄和翻譯兩個水平上調節來影響胰島素的作用；還可通過抑制蛋白激酶C介導的絲氨酸磷酸化和酪氨酸磷酸酶激活的結果來降低 IR 的活性[Berti L, Mosthaf L, Kroder G et al. Glucose-induced translocation of protein kinase C isoforms in rat-1 fibroblasts is paralleled by inhibition of the insulin receptor tyrosine kinase. J Biol Chem. 1994,269(5) 3381-6. Miiller HK, Kellerer M, Ermel B et al. Prevention by protein kinase C inhibitors of glucose-induced insulin-receptor tyrosine kinase resistance in rat fat cells.Diabetes. 1991,40(11) : 1440-1448.]。實施例2胰島素凝膠對頌骨組織局部給藥，促進GK大鼠拔牙窩愈合作用本實施例以Goto-Kakizaki (GK)大鼠為材料，Goto-Kakizaki (GK)大鼠是 1975 年Goto等人在日本仙臺，從211個Wistar大鼠中經口服糖耐量實驗(OGTT)選出1 8個輕度糖耐量減退鼠，經10代左右反復選擇高血糖鼠交配，形成與人類2型糖尿病近似的自發性非肥胖2型糖尿病鼠種，簡稱GK大鼠。該鼠種主要表現為葡萄糖刺激的胰島素分泌受損，β “細胞分泌受損，空腹高血糖，肝糖原生成增多，長期患病后，出現各種并發癥。2型糖尿病可以分為胰島素絕對不足和胰島素相對不足，臨床上需要補充外源性胰島素進行治療。1980年及1988年世界衛生組織WHO關于糖尿病的診斷標準如下有糖尿病癥狀，具備下列任何一項即可診斷為糖尿病a、空腹血糖> 7. 8mmol/l ；b、一日中任何時間血糖彡11. lmmol/1 ；c、空腹血糖(7. 8mmol/l，但口服75 %葡萄糖耐量試驗二小時血糖 ^ 11. lmmol/1。在以往的少數研究中表明，糖尿病患者局部應用某些藥物可以促進傷口愈合，這些藥物包括蛋白酶抑制劑和血漿纖維素等。GK大鼠鼠種主要表現為葡萄糖刺激的胰島素分泌受損，β “細胞分泌受損，空腹高血糖，肝糖原生成增多，長期患病后，出現各種并發癥。局部應用胰島素對糖尿病拔牙窩愈合的作用以及IR和IGF-IR兩種受體在此過程中如何表達和變化尚未明確。本研究以Wistar大鼠為對照，拔除GK大鼠左側下頌切牙后拔牙窩內局部給予胰島素凝膠，觀察拔牙窩愈合過程中胰島素局部應用對IR和IGF-IR的影響及拔牙窩愈合情況，以達到實驗目的。實驗方法與過程Dffistar大鼠和GK大鼠下頌骨拔牙窩模型的建立隨機分組=Wistar大鼠拔牙組(WN) ；GK大鼠拔牙組(GN)、GK大鼠注射殼聚糖凝膠組(Gl)、GK大鼠拔注射載有胰島素的殼聚糖凝膠組(G2)，每組3只。稱取體重，尾部血糖測量及標記，將大鼠大腿內側腹腔注射戊巴比妥液(0. 5ml/100g體重)；固定、消毒、 鋪巾。下頌左側切牙分離牙齦，在牙槽骨唇側做梯形切口，翻開唇舌側粘骨膜瓣；去除少部分的唇側骨板，減少唇側的骨阻力；舌側利用牙齦分離器將牙與牙槽骨輕輕分離使持針器能夾住大鼠下頌切牙即可；牙槽窩處理刮除牙槽窩內牙周組織，生理鹽水適當沖洗后按照不同分組進行拔牙窩局部注射胰島素凝膠；關閉創口 將拔牙后一側的粘骨膜與對側粘骨膜盡量對位嚴密縫合。術后同術前測量大鼠尾血血糖；待大鼠完全清醒后放回鼠籠；肌肉注射注射用青霉素鈉20萬單位溶液(0. lml/100g)；將阿莫西林膠囊溶于飲水瓶中三天(0.25mg/d)。SPSS13.0統計軟件進行分析，實驗數據用^士 s表示，組間差異比較采用 One-Way ANOVO分析LSD法，P < 0. 05認為差異具有顯著性。2)胰島素凝膠對頌骨組織局部給藥，促進GK大鼠拔牙窩愈合作用分別配制β-甘油磷酸鈉溶液與殼聚糖醋酸溶液后，冷卻至室溫后使用。將兩種溶液冰浴后，吸取殼聚糖醋酸溶液到容器中，快速攪拌同時逐滴加入β “甘油磷酸鈉溶液， 并持續攪拌，獲得殼聚糖/ β “甘油磷酸鈉水凝膠。再加入適量的胰島素，制備對頌骨組織局部給藥的胰島素凝膠。①取材及固定將實驗一中的大鼠分別于術后第7d，14d，21d，28d取材。分組情況同前一部分實驗分組。下頌骨外固定分離下頌骨后，在正中聯合處分開，清理干凈附麗的肌肉、筋膜、牙周膜后，以下頌第一磨牙近中為界，將下頌骨分為前后兩部分，前部迅速放入液氮組織中凍存，后部放入4%多聚甲醛中固定。影像學檢查X線檢查在正中聯合處分開后拍片觀察各組拔牙窩骨組織愈合及新骨形成情況。②病理學檢查組織在多聚甲醛中室溫下固定72小時后，取出放入15% EDTA(pH = 7. 4)液中脫鈣處理，1個月左右待組織脫鈣完全后進行脫水，石蠟包埋，以5毫米厚度均勻切片，烘片機烘片干燥后4°C冰箱中保存備用。脫水及包埋步驟梯度乙醇(70%乙醇6011^11，80%乙醇601^11，90%乙醇60111士11， 95% 乙醇 I30min，95% 乙醇 II30min，100% 乙醇 I20min，100% 乙醇 II20min)逐級脫水；二甲苯透明(二甲苯I和二甲苯II各15min) ；62°C浸蠟> 汕，常規石蠟包埋；將標本按水平方向做近遠中向連續組織切片，片厚5um ；選有拔牙窩區域新骨生成的組織切片，置于載玻片上。石蠟組織切片脫蠟步驟二甲苯I和二甲苯II各脫蠟20min ；梯度乙醇(100% 乙醇anin，95%乙醇lmin，80%乙醇lmin，75%乙醇lmin，自來水沖洗5min，蒸餾水沖洗 2min)至水洗。組織切片進行三組實驗切片常規二甲苯、梯度酒精脫蠟至水；水洗后蘇木精染色3分鐘，水洗后鹽酸酒精內分化數秒；水洗后40°C水中返藍浸泡30秒；水洗后0. 5% 伊紅復染5分鐘；70%酒精、85%酒精、95%酒精、無水乙醇脫水；二甲苯透明；中性樹膠封固。免疫組織化學法檢測頂和IGF-IR在大鼠下頌骨切牙拔牙窩中的表達。步驟如下石蠟切片常規脫蠟至水；阻斷滅活內源性過氧化物酶3% H2&37°C孵育lOmin，PBS 沖洗3次X5min ；抗原修復0. 125%胰酶(pH = 7. 2)進行抗原修復20min，PBS沖洗3 次X5min ；正常血清工作液封閉，37°C孵育lOmin，傾去勿洗；滴加一抗(IR = 1 100 ； IGF-IR = 1 100)4°C冰箱孵育過夜，37°C復溫lh，PBS沖洗3次X5min (用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照)；滴加生物素標記二抗，37°C孵育20min，PBS沖洗3次X5min;滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37°C孵育20min，PBS沖洗3次X 5min ；DAB反應染色，顯色一般為室溫:3min，在顯微鏡下觀察顯色情況，顯色充分后自來水終止反應。自來水充分沖洗后，蘇木素復染，常規脫水，透明，干燥，封片。免疫組化結果判定陽性表達判斷標準是觀察圍繞在新生骨小梁周圍的成骨細胞上胞漿內是否有棕黃色物質沉積，將著色強度分為4級無色為陰性，淡黃色為弱陽性，棕黃色為陽性，棕褐色為強陽性。Goldner' s三色法染色方法脫蠟后的切片在Wieigert’ s鐵蘇木素液中染色 15min,蒸餾水漂洗1次，自來水沖洗2次；麗春紅-酸性品紅染色液中染色15min， 醋酸液漂洗2次；1 %磷鎢酸-桔黃G8min，1 %醋酸液漂洗2次；亮綠液染色15min，1 %醋酸液漂洗2次；70%乙醇漂洗1次，無水乙醇I、II漂洗2次；二甲苯透明；中性樹膠封固。③頌骨組織骨細胞的處理總RNA提取將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入lmlTrizol，用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過Trizol體積10% ；將勻漿樣品在室溫(15-30°C )放置 5min，使核酸蛋白復合物完全分離；每使用ImlTrizol加入0. 2ml氯仿，劇烈振蕩30s，室溫放置;3min;2-8°C 10000 X g離心15min。樣品分為3層；將上層水相移到新管中，用異丙醇沉淀水相中的RNA。每Iml Trizol加入0.6ml異丙醇，室溫放置IOmin ;2-8°C IOOOOXg離心15min，移去上清；用75%乙醇洗滌RNA沉淀。2_8°C不超過7500X g離心5min，棄上清； 室溫放置干燥RNA沉淀。加入30 μ 1 DEPC H2O溶解RNA。-70°C保存。RNA反轉錄為cDNA，之后進行熒光定量PCR監測實驗，熒光定量PCR的反應體系由 2X SYBR Real-Time PCR mix、特異引物、Taq酶、cDNA模板、dd H2O組成。熒光標記是5， 端FAM，3 ’端TAMRA選用GAPDH為內參蛋白。弓丨物的具體設計如下
GAPDHForward 5' -GAAGGTGGAGGTCGGAGTC-3‘GAPDH Reverse 5' -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3‘IR Forward 5' -AGGAGCCCAATGGTCTGA-3‘IR Reverse 5' -GAGACGCAGAGATGCAGC-3‘IGF-IR Forward 5' -CGATGTGTGAGA AGACCACCA-3‘SPSS13. 0統計軟件進行分析，實驗數據用^士 s表示，組間差異比較使用方差分析 (One-ffay AN0VA)、T 檢驗(One-Sample T Test、Paired-Sample T Test)。實驗結果與討論Dffistar大鼠和GK大鼠下頌骨拔牙窩模型的建立術后2士0. 5h內大鼠均清醒，清醒后能在鼠籠內自如活動并進食，從術后到7d， 14d,21d,28d, 12只Wistar大鼠狀態良好；36只GK大鼠全部在術后立即清醒并狀態良好， 直到取材(取材時間同Wistar組)。Wistar大鼠與GK大鼠體重比較，Wistar大鼠體重均重于GK大鼠，統計學分析兩者有顯著性差異P < 0. 05(表1)。表1兩種大鼠在術前術后的體重比較(χ士 S)
_術前體重(g)_術后體重(g)_
7d (n-9) 14d (n=9) 21d (n=9) 28d(n=9) Wistar 220.45±7.78 233.5±9.65 245.5±12 265.35±8.38 286.5±4.58* GK 200.65±6.65 210.55±6.37 222.68±7.78 237.25±6.07 247.5±2.05*p < 0. 05與對照組相比于術前、術后30min取WN組及G2組大鼠尾部血糖進行測定，比較局部給予胰島素后血糖變化。Wistar大鼠與GK大鼠血糖測定經統計學分析存在顯著差異，而且一直保持穩定狀態(圖幻。G2組在拔牙術前和術后快速測大鼠尾部血糖，血糖變化不明顯，沒有統計學差異。在兩種大鼠同樣飲食喂養條件下，GN、GU G2組大鼠直到取材時仍保持在高血糖，明顯高于WN組(圖4).在大鼠飼養過程中檢測血糖值Wiatar組和GK組有明顯統計學差異，GK大鼠一直保持在高血糖狀態，拔牙術前、術后對于拔牙窩注射載有胰島素的殼聚糖凝膠系統的實驗組(6 進行大鼠尾血血糖快速測定發現血糖變化不大，無統計學差異，說明胰島素在殼聚糖凝膠系統內，未直接通過拔牙窩入血迅速調節血糖，飼養和飲食條件與 Wistar相同，直到取材時間點時GK大鼠均保持在高血糖狀態，符合本實驗要求。2)胰島素凝膠對頌骨組織局部給藥，促進GK大鼠拔牙窩愈合作用給藥緩釋系統含有濃度為10_6Μ-1(ΓΜ的胰島素、重量百分比2. 5% -3. 0%的殼聚糖以及5.0% -6.0%的β-甘油磷酸鈉，其中ρΗ值為6.9-7.2。大體檢查術后7d大體觀察四組大鼠下頌切牙創口均一期愈合，黏膜完整，色澤正常，同一觀察期實驗組和對照組創口表面愈合未見明顯異常，愈合良好，未見感染；術后 28d觀察創口已經基本愈合。X線檢查結果X線觀察在兩種大鼠拔牙后觀山在χ線片上可以看到有牙槽窩的界限，Wistar組牙槽窩內明顯有新骨形成；GK組牙槽窩內整體未見明顯新骨形成，骨紋理同Wistar組相比紊亂(圖5)。
Wistar組拔牙7d時拔牙窩中充斥著血細胞和早期的肉芽組織，肉芽組織，其中包含血管，成纖維細胞及慢性炎癥細胞；拔牙后28d，新生骨小梁明顯，結構還比較紊亂，尚未改建。GK組拔牙后7d時，GN組炎癥細胞與WN組相比，炎癥細胞明顯增多，成纖維細胞排列紊亂；Gl組炎癥細胞在肉芽組織中浸潤更多，圖中箭頭處為C/GP ；G2組炎癥細胞與WN 組相比增多，但同Gl組相比有所減少，染色片中未見如Gl組C/GP結構，但圖中箭頭所示為異物巨細胞，表示其附近有C/GP。拔牙后28d，GN組中能見到立方形、多邊形的成骨細胞增多，靠近骨組織處成骨細胞明顯活躍，開始有新骨生成；Gl組中骨愈合不良，纖維性骨質為主，成纖維細胞、骨原細胞混雜，其間夾雜個別炎癥細胞；G2組中出現不規則骨基質和少許的新生骨小梁，圍繞新生骨小梁周圍的成骨細胞明顯活躍，立方形、多邊形的成骨細胞多見。Goldner' s三色法結果由于HE染色不能完全區分骨礦化的階段，一般采用 Goldner' S三色法，主要針對膠原纖維進行著色，而活躍的成骨細胞胞體呈立方形或矮柱形，胞質呈強嗜堿性。IR和IGF-IR的表達IR和IGF-IR受體均表達在成骨細胞的胞漿上，陽性表達的細胞可見胞漿內有棕黃色物質沉積。因為本切片是脫鈣處理的石蠟切片，脫鈣后的組織有細胞胞漿溶解所以出現少部分非特異染色，本實驗陽性表達的判斷標準是觀察圍繞在新生骨小梁周圍的成骨細胞上胞漿內是否有棕黃色物質沉積。G2組28d時能見到少量新生骨組織上IR弱陽性表達，GN組28d則是IR陽性表達；WN組28d時新生的骨小梁周圍的成骨細胞上IGF-IR陽性表達，同時間組的GN組28d未見有新生骨小梁，IGF-IR弱陽性表達。Real-time qPCR結果在大鼠拔牙窩7_28d愈合過程IRmRNA水平上，WN組IR mRNA水平表現為持續下降；GN組則表現為IRmRNA水平在14d達到高峰后開始下降為先升高后降低的趨勢Gl組也表現為先升高后降低趨勢，21d時達到高峰，隨后在28d時降到7d 時水平G2組與WN組表現一致，在7-28d過程中持續下降(圖6)。其中GN組的IRmRNA水平最高(ρ <0.01)，G1、G2組與WN組相近均低于GN組。在大鼠拔牙窩7_28d愈合過程 IGF-IRmRNA水平上，GN、G1組的IGF-IR mRNA水平較低，而且在此過程中改變無明顯統計學差異；G2組在7d，14d，21d明顯高于其它兩組，并在21d時達到峰值；WN組14d，21d顯著高于 GN、G1 組(ρ < 0. 01)(圖 7)。本發明中發現在Wistar組拔牙7d時拔牙窩中充斥著血細胞和早期的肉芽組織， 其中包含血管，成纖維細胞及慢性炎癥細胞；拔牙后28d，新生骨小梁明顯，結構還比較紊亂，尚未改建。GK組28d除了 G2組的病理變化類似于WN組28d時變化外，其余組拔牙后 28d纖維性骨質為主，成纖維細胞、骨祖細胞混雜，其間夾雜個別炎癥細胞。Goldner’ s三色法結果證實了 HE結果中觀察到的所示新生骨小梁結構。因為本切片是脫鈣處理后石蠟切片，脫鈣組織有部分細胞胞漿溶解所以出現少部分非特異染色。免疫組化學觀察IR和 IGF-IR受體均表達在成骨細胞的胞漿上，IR在G2組28d時能見到弱陽性表達，GN組28d時則是陽性表達；IGF-IR在WN組28d時新生的骨小梁周圍的成骨細胞上陽性表達，GN組28d 時IGF-IR弱陽性表達。IGF-IR在成骨細胞上表達活躍的地方也是新生骨形成活躍的地方。 利用Real-time qPCR法分別檢測了大鼠拔牙窩7_28d愈合過程IRmRNA和IGF-IRmRNA的水平及變化，發現對于IRmRNA而言，G2組變化趨勢與WN組一致均為下降趨勢，同時GN組的水平最高，且存在先升高后降低的趨勢；在此過程中對于IGF-IRmRNA水平而言，G2組的水平顯著高于其他GN，Gl兩組，但是低于WN組其實GN、Gl組的IGF-IR mRNA水平較低，而且在此過程中改變無明顯統計學差異。胰島素緩釋的凝膠系統局部注射于大鼠拔牙窩內， 未即刻改變大鼠血糖；胰島素局部應用于拔牙窩改變了頂和IGF-IR水平，促進了糖尿病大鼠拔牙窩中新生骨形成。
權利要求
1.胰島素在制備促進頜骨組織愈合的藥物中的用途，所述藥物局部施用于動物活體組幺口
2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述動物活體組織是動物頌骨組織。
3.根據權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的動物頌骨組織是指頌骨組織在體外培養的成骨細胞以及在動物活體的頌骨組織。
4.根據權利要求1所述的胰島素促進頌骨組織成骨細胞增殖的用途，其特征在于，所述藥物是含有胰島素的胰島素局部給藥凝膠系統。
5.根據權利要求4所述的胰島素局部給藥凝膠系統，其特征在于，所述的緩釋系統含有濃度為10_6Μ-10_7Μ的胰島素、重量百分比2.5% -3.0%的殼聚糖以及5.0% -6.0%的 β -甘油磷酸鈉，PH值為6. 9-7. 2。
全文摘要
本發明公開了胰島素在制備促進頜骨組織愈合的藥物中的用途。在探索胰島素的藥用用途過程中，本發明采用了動物的頜骨組織作為實驗材料，具體實驗包括用細胞生物學實驗檢測胰島素促進體外頜骨組織成骨細胞的增殖；胰島素局部作用于動物活體的頜骨組織，促進頜骨組織的愈合。本發明不僅增加了胰島素的藥用用途，并且提高了胰島素在頜骨組織愈合方面的效用。本發明采用胰島素直接作用于頜骨組織，避免了胰島素的長期注射而帶來的副作用，為2型糖尿病患者的頜骨組織愈合帶來了很大的促進作用，并且本發明采用局部給藥，有效提高了胰島素促進正常人頜骨組織愈合的效率。
文檔編號C12N5/077GK102397534SQ20101027409
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月7日 優先權日2010年9月7日
發明者劉洪臣, 汪林, 王東勝 申請人:中國人民解放軍總醫院