專利名稱：一種提高綿羊成熟卵母細胞玻璃化冷凍后發育能力的方法
技術領域：
本發明涉及動物胚胎生物技術領域，特別是涉及提高綿羊卵母細胞的發育的方 法，本申請稱之為 Electric-Chemical-Electric, ECE 法。
背景技術：
卵母細胞冷凍保存不僅對于瀕臨物種的保存具有重要意義，而且可以為基礎研究 提供了大量可利用的材料。近年來，玻璃化冷凍法保存卵母細胞獲得了優于傳統慢速冷凍 法的效果。許多報道利用玻璃化冷凍法保存了不同動物的卵母細胞，而且在一些報道中也 獲得健康的后代。但是，目前綿羊卵母細胞玻璃化冷凍的成功率仍然較低，相對于新鮮的卵 母細胞，玻璃化冷凍后的卵母細胞發育能力很低。有報道表明，玻璃化冷凍過程會對動物卵 母細胞造成多種損傷，例如細胞骨架的破壞、皮質顆粒的提前釋放以及透明帶超微結構的 變化。這些變化嚴重阻礙了正常的受精過程，使精子不能進入卵母細胞而受精，采用顯微注 射可以提高精子進入卵母細胞的比率，但是玻璃化冷凍后的卵母細胞發育能力很低，需要 額外的刺激才能啟動其正常發育，目前用于卵母細胞的激活多用化學激活方法，但是化學 激活后，很容易照成孤雌激活胚胎，不能形成正常的二倍體胚胎。
發明內容
針對上述領域的缺陷，本發明提供一種提高了玻璃化冷凍后綿羊卵母細胞的發育 能力的方法，其孤雌激活胚胎比率減少，而正常的二倍體胚胎比率大大提高，同時與常規的 體外受精方法相比，其卵裂率和囊胚率分別提高到13. 7%和6. 8%。一種提高綿羊成熟卵母細胞玻璃化冷凍后發育能力的方法，包括綿羊成熟卵母細 胞的顯微注射受精和受精卵的激活步驟，其特征在于所述受精卵的激活包括如下步驟 1.將顯微注射后的綿羊成熟卵母細胞在直流脈沖(2. 4kv/cm, IOus)下刺激1次；2.放入添 加了 5mMionomycin的SOF培養液中5分鐘；3.在SOF培養液中3小時；4.移入添加了 1. 9 mM6-dimethylaminopurine (6-DMAP)的 SOF 培養液中 1. 5 小時；5.用直流脈沖(2. 4kv/cm, IOus)再刺激1次。所述SOF 培養液成分如下107· 63nM NaCl+7.16mM KC1+1.19mM KE,P04+1. 51mMMgS04+l. 78mM CaCl2. 2H,(K25. OOmM NaH003+5. 35nM 乳酸鈉 +7. 27nM 丙酮酸鈉 +0. 20mM 谷氨酰胺 +20. O μ L/nL 必需氨 基酸混合液+10. O μ L/nL非必需氨基酸混合液+0. 34πΜ檸檬酸鈉+2. 77πΜ肌醇+100IU/nL青霉素 +100IU/nL 鏈霉素 +0. 2mg/nL 酚紅。所述綿羊成熟卵母細胞的顯微注射受精是利用顯微操作儀將單個綿羊精子直接 注射到玻璃化冷凍后的綿羊成熟卵母細胞。所述綿羊成熟卵母細胞的顯微注射受精包括如下步驟(1)用0. 2%透明質酸酶 將存活的綿羊成熟卵母細胞的顆粒細胞去除，(2)再將卵母細胞移入顯微操作液滴中，顯微 操作液滴是添加了 25mM Hepes和10%血清的SOF培養液，(3)在顯微鏡下將單個精子注射 到綿羊成熟卵母細胞中。
本發明受精卵的激活采用直流脈沖_化學激活_直流脈沖的方式進行激活，正常 的二倍體胚胎有明顯的提高，孤雌激活胚胎減少。同時經過本方法處理后，提高了玻璃化冷 凍后的綿羊卵母細胞單精子注射后的發育能力，與常規的體外受精方法相比，卵裂率和囊 胚率分別提高了 13. 7%和6.8%。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。1.主要儀器設備顯微操作儀、CO2培養箱、恒溫臺、視體顯微鏡、恒溫箱、超凈臺。2.玻璃化冷凍后的綿羊卵母細胞準備在顯微鏡下挑選存活的綿羊成熟卵母細胞，用0.2%透明質酸酶脫去顆粒細胞， 在體視顯微鏡下選擇存在第一極體的、胞質均勻一致的卵母細胞，置于含有10%血清的 HC03-199液中待用。3.顯微注射成熟卵母細胞的顯微注射是在顯微操作儀上進行。將10枚脫去顆粒細胞的成熟 卵母細胞放入操作液滴的一端，操作液滴由添加25mMfepeS和10%血清的SOF培養液組成， 用持卵針吸住一枚卵母細胞，調整極體的位置，使其第一極體位于時鐘12點的位置。用注 射針在精子操作滴中吸入1個精子，將注射針移入卵母細胞操作滴中，并將精子推到注射 針尖端，注射針從3點位置穿入卵母細胞深部，回吸少量卵母細胞質，再將精子注入卵母細 胞，將注射針輕輕從卵母細胞中撤出，注射后，將卵母細胞移入液滴的一邊直到顯微注射完 畢，將注射后的卵母細胞置于培養箱中保存lh。4.受精卵激活當所有卵母細胞注射完畢后進行激活處理。激活處理方法為1.將顯微注射 后的綿羊成熟卵母細胞在直流脈沖(2. 4kv/cm，IOus)下刺激一次；2.放入添加了 5mM ionomycin的SOF培養液中5分鐘；3.在SOF培養液中3小時；4.移入添加了 1. 9mM 6-dimethylaminopurine (6-DMAP)的 SOF 培養液中 1.5 小時；5.用直流脈沖(2. 4kv/cm, IOus)再刺激1次。5.胚胎發育激活后，胚胎進行培養，培養方法為將受精卵在添加了 10%血清的SOF培養液中 培養7天。每2天半換液。觀察胚胎發育情況，統計卵裂率和囊胚率。從2008年1月至2009年10月，經ECE法處理后，玻璃化冷凍后的綿羊卵母細胞 單精子注射后的胚胎發育能力大大提高，與常規的體外受精方法相比，卵裂率和囊胚率分 別提高到13.7%和6.8%。同時，比較了不同處理后的胚胎的染色體倍性，結果發現，利用 ECE法處理后，正常倍性胚胎的比例(71.5%)明顯高于普通的化學激活方法(45.4%)，且 與體外受精組沒有明顯差異，這說明，本方法有利于玻璃化冷凍后的綿羊卵母細胞單精子 注射后胚胎的正常發育，實驗結果如下表一玻璃化冷凍后的綿羊成熟卵母細胞在不同受精方法下的發育情況
權利要求
一種提高綿羊成熟卵母細胞玻璃化冷凍后發育能力的方法，包括綿羊成熟卵母細胞的顯微注射受精和受精卵的激活步驟，其特征在于所述受精卵的激活包括如下步驟1.將顯微注射后的綿羊成熟卵母細胞在2.4kv/cm，10us的直流脈沖下刺激1次；2.放入添加了5mMionomycin的SOF培養液中5分鐘；3.在SOF培養液中3小時；4.移入添加了1.9mM6 dimethylaminopurine 的SOF培養液中1.5小時；5.用2.4kv/cm，10us的直流脈沖再刺激1次。
2.根據權利要求1所述的方法，所述S0F培養液成分如下107.63mM NaCl+7. 16mM KC1+1. 19mM KH2P04+1. 51mM MgS04+l. 78mM CaCl2. 2H20+25. OOmM NaHC03+5. 35mM 乳酸鈉 +7. 27mM丙酮酸鈉+0. 20mM谷氨酰胺+20. 0 u L/mL必需氨基酸混合液+10. 0 u L/mL非必需 氨基酸混合液+0. 34mM檸檬酸鈉+2. 77mM肌醇+100IU/mL青霉素+ 100IU/mL鏈霉素+0. 2mg/ mL酚紅。
3.根據權利要求1所述的方法，所述綿羊成熟卵母細胞的顯微注射受精是利用顯微操 作儀將單個綿羊精子直接注射到玻璃化冷凍后的綿羊成熟卵母細胞。
4.根據權利要求3所述的方法，所述綿羊成熟卵母細胞的顯微注射受精包括如下步 驟(1)用0.2%透明質酸酶將存活的綿羊成熟卵母細胞的顆粒細胞去除，(2)再將卵母細 胞移入顯微操作液滴中，顯微操作液滴是添加了 25mM Hepes和10%血清的S0F培養液，(3) 在顯微鏡下將單個精子注射到綿羊成熟卵母細胞中。
全文摘要
本發明涉及“一種提高綿羊成熟卵母細胞玻璃化冷凍后發育能力的方法”，屬于生物技術領域，包括綿羊成熟卵母細胞的顯微注射受精和受精卵的激活步驟，本發明受精卵的激活采用直流脈沖-化學激活-直流脈沖的方式，實驗證明玻璃化冷凍后的綿羊卵母細胞單精子注射后采用本發明的激活方法，其胚胎發育能力大大提高，與常規的體外受精方法相比，卵裂率和囊胚率分別提高到13.7％和6.8％。同時，比較了不同處理后的胚胎的染色體倍性，結果發現，利用ECE法處理后，正常倍性胚胎的比例(71.5％)明顯高于普通的化學激活方法(45.4％)，且與體外受精組沒有明顯差異。
文檔編號C12N5/075GK101948799SQ20101027043
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月1日 優先權日2010年9月1日
發明者張家新 申請人:張家新