專利名稱：一種檢測茶樹次生代謝相關基因表達信息的cDNA芯片的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種茶樹基因檢測技術，尤其涉及一種檢測茶樹次生代謝相關基因表 達信息的cDNA芯片。
背景技術：
利用已知基因信息在待測樣品中特異地檢測目的基因的表達信息，是分子生物學 領域中常用的檢測手段，如常用的Southern雜交、Northern雜交以及PCR技術。但是，隨 著分子生物學的發展，這些技術不能在同一條件下對成千上萬個基因同時進行分析，因此 具有一定的局限性。通過原位合成(in sitil Synthesis)探針或合成目的基因片段后采 用交聯的方式，可以將成千上萬個基因固定在載體上，再利用雜交方式檢測基因表達信息 的方法已成為一種趨勢，隨著這種方法的不斷發展，出現了生物芯片技術。生物芯片的實 質就是在面積不大的基片上有序地點陣排列了一系列固定于一定位置地可尋址的生物識 別分子(Lipshutz RJ et al.，Bio Techniques 19 (1995), 442-447 ；Fodor SP et al.， Nature 364 (1993),555-556 ；Fodor SP et al.，Science 251 (1991),767-773 ；Pease AC et al. , Proceedings of National Academy of Science, USA 91 (1994)，5022—5026)。 由于最初的生物芯片主要是用于DNA序列測定、基因表達譜鑒定(Lockhart DJ et al., Nature Biotechnology 14 (1996)，1675-1680)、基因突變體的檢測和分析(Feriotto G et al. , Human Mutation 13 (1999),390-400 ；Hacia JG et al. , Nature Genetics 21 (suppl 1) (1999),42-47；Hacia JG et al.，Nature Genetics 22 (1999)，164—167 ；Nilsson P et al. ,Bio Techniques 26 (1999)，308-316)，所以又稱為DNA芯片或生物芯片。目前，這一技 術已擴展至免疫反應、受體結合等非核酸領域，因此生物芯片已超出了原來的范圍。如今生 物芯片主要包括cDNA微陣列、寡核苷酸微陣列、動電微陣列、蛋白質芯片和免疫芯片等，還 出現了組織芯片、細胞芯片、多肽芯片、質譜芯片和電芯片等新的品種和技術。目前DNA芯 片因具有強有力性、靈活性、敏感性和相對簡單等特點而被應用在許多領域，如醫學臨床診 斷、藥物開發、環境監測、食品衛生監督以及司法鑒定等；在科研領域，生物芯片主要用于檢 測生物體在不同發育階段、組織器官、及在各種生物及非生物脅迫下基因的表達情況，鑒定 特異表達基因的信息，從而為研究提供信息和方向。植物次生代謝產物是指植物中一大類并非生長發育所必需的小分子有機化合 物，包括生物堿、萜類、酚類等化合物，這些化合物在植物體內均有自己獨特的代謝途徑， 并且由初生代謝派生而來。它們在已知的光合作用、呼吸、同化物運輸以及生長分化等過 程中沒有明顯的或直接的作用。但是隨著研究的不斷深入，表明植物次生代謝物的形成 與植物的抗性、花色和信號傳導等生命現象有關，是植物主要的防御機制之一，在處理植 物與生態環境關系上充當著重要的角色。茶樹是我國重要的特色木本經濟植物之一。茶 葉中富含茶多酚、生物堿、氨基酸、維生素等多種次生代謝產物，其中茶多酚是茶葉中的 最重要的功能性成分之一，約占干重的15% _35%，主要由表沒食子兒茶素沒食子酸酯 (Epi-gallo-catechin-gallate,EGCG)、表沒食子兒荼素(Epi-gallo-catechin，EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(Epi-catechin_gallate，ECG)、表兒茶素(Epi-catechin，EC)和(+)兒茶 素(+Catechin，+C)等5種兒茶素和其他一些黃酮類物質組成，其研究范圍已經涉及茶學、 食品科學和醫藥學等許多領域，并在基礎研究和應用方面都有很大的進展。因此將已知的 一批茶樹次生代謝相關基因的cDNA片段組合在一起，點制成基因芯片，利用其進行基因表 達分析，將有助于育種材料的快速鑒定，以及克隆基因家族新成員、基因定位克隆、作為序 列標簽位點進行染色體的基因定位和基因圖譜制作、遺傳突變位點的鑒定、分析基因在不 同組織中的表達特異性和建立DNA物理圖譜和對細胞和有機體的整體研究等。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種檢測茶樹次生代謝相關基因表達 信息的cDNA芯片。本發明的目的是由以下技術方案完成的，一種檢測茶樹次生代謝相關基因表達 信息的cDNA芯片，該芯片是在適合的載體面上點制組合有如下GenBank登錄號的DNA片 段CV013596，CV013616, CV013618, CV013628, CV013652, CV013653, CVO13694, CV013706, CV013713, CV013739, CV013758, CV013771, CV013829, CV013899, CV013912, CV013930, CV013949, CV013953, CV013960, CV013988, CVO14001, CV014012, CV014025, CV014079, CV014083, CV014105, CV014108, CV014139, CV014153, CV014221, CV014238, CV014256, CV014313, CV014338, CV014351, CV014366, CV014373, CV014412, CV014419, CV014437, CVO14441, CV014448, CV014451, CV014457, CV014468, CV014476, CV014500, CVO14501, CV014509, CV014511, CV014540, CV014542, CV014559, CV014590, CV014623, CV014653, CV014657, CV014658, CV014662, CV014783, CV067017, CV067030, CV067033, CV067105, CV067144, CV067153, AB018685, AY169404, AY641730, AY641731, AY830416, AY641729, DQ904328, DQ904329, D26594, D26595, D26596, DQ120521, DQ194356, DQ194358, EF205148, EF205149, EF205150,FJ169499。上述用于檢測茶樹次生代謝相關基因表達信息cDNA芯片的制備方法，包括如下 步驟1)構建茶樹幼嫩葉片和幼根的cDNA文庫；2)從步驟1)中構建的cDNA文庫中挑選非冗余序列制作探針，所述探針為84條具 有下述 GenBank 登錄號的 DNA 序列CV013596，CV013616, CV013618, CV013628, CV013652,
CV013653,CV013694,CV013706,CV013713,CV013899,CV013912,CV013930,CVO13949,CV014012,CV014025,CV014079,CV014083,CV014221,CV014238,CV014256,CV014313,CV014412,CV014419,CV014437,CV014441,CV014476,CV014500,CVO14501,CV014509,CV014590,CV014623,CV014653,CV014657,CV067030,CV067033,CV067105,CV067144,
CV013739, CV013758, CV013771, CV013829, CV013953, CV013960, CV013988, CVO14001, CV014105, CV014108, CV014139, CV014153, CV014338, CV014351, CV014366, CV014373, CVO14448, CV014451, CV014457, CVO14468, CV014511, CVO14540, CV014542, CV014559, CV014658, CV014662, CV014783, CV067017, CV067153, AB018685, AY169404, AY641730,
AY641731, AY830416, AY641729, DQ904328, DQ904329, D26594, D26595, D26596, DQ120521, DQ194356, DQ194358, EF205148, EF205149, EF205150, FJ169499。
3)利用通用引物M13擴增目的片段，純化后將探針濃度調整為200ng/ μ L ；4)取5 μ L步驟3)的純化產物，加5 μ L點樣液，并將混合液移至384孔板中；5)將步驟4)的探針溶液點在適合的載體上，點制在載體上的樣品還包括若干個 與已知基因沒有相似性的基因間序列作為外標，干燥后得到用于檢測茶樹次生代謝相關基 因表達信息的cDNA芯片。本發明提供了一種檢測茶樹次生代謝相關基因表達信息的cDNA芯片。該基因芯 片以茶樹次生代謝相關基因的cDNA片段作為探針，包含有84個茶樹次生代謝相關基因的 cDNA序列、5個茶樹看家基因序列作為內參、8個和已知基因均沒有相似性的酵母基因間序 列作為外標及1個50% DMSO的陰性對照，且每個探針設置了 3個重復，便于對雜交結果進 行統計學分析，提高了檢測結果的準確性。本發明的有益是由于本發明的基因cDNA芯片具備高通量的優勢，可通過定量監 測一批基因的表達水平，闡述基因功能。采用本發明的基因芯片技術可從整體水平研究次 生代謝相關基因的表達譜，是一種高通量的進行功能基因表達分析的研究手段，具有許多 商用價值和科研價值1、可同時檢測除去對照點以外的84條茶樹次生代謝相關基因的表達情況；2、可用于作物種質資源的鑒定評價；3、也可用于對農作物的雜種優勢進行早期預測，篩選出最佳的優勢雜交種；4、應用該生物芯片還可用于查找藥物的毒性和副作用，進行毒理學研究，利于對 新型除草劑和新型農藥的篩選；5、該生物芯片可用于植物的育種和植物新品種的產生；6、該生物芯片還可用于從整體上研究整個信使核糖核酸(mRNA)的表達，這對生 物體基因調節的整體性研究具有重要的科研和實踐指導價值；7、應用該生物芯片還可以運用突變體研究植物中胞間和胞內信號傳導，為發現植 物中的基因功能和生理代謝途徑提供重要的理論依據；8、該生物芯片能夠作為一種商品，廣泛應用于農業、林業科學研究和實際生產中。
圖1茶樹次生代謝相關基因cDNA芯片矩陣分布示意圖；圖2芯片矩陣點制示意圖。
具體實施例方式下面根據附圖和實施例詳細描述本發明，本發明的目的和效果將變得更加明顯。實施例1，茶樹葉片cDNA文庫的構建一、茶樹葉片總RNA的提取春天取生長健壯的茶樹嫩葉lOOmg，迅速加液氮冷凍研磨成細粉末狀，加入 1000 μ L Trizol試劑(購自Gibco BRL)繼續研磨后，又再加入1000 μ L Trizol試劑，混 勻分裝到兩個經焦炭酸二乙酯處理的1. 5mL離心管中，冰上放置5分鐘，各加入200 μ L的 氯仿，顛倒混勻，4°C 12000轉/分鐘離心10分鐘，取500 μ L上清液，加入等體積的異丙醇， 上下輕輕顛倒10次，室溫放置10分鐘，4°C 12000轉/分鐘離心10分鐘，去上清，沉淀中加入ImL 75%乙醇輕輕清洗，倒去乙醇，干燥后加入20 μ L經焦炭酸二乙酯處理過的雙蒸水 溶解沉淀。甲醛凝膠變性電泳檢測RNA質量后，放于_70°C冰箱中長期保存，備用。二、mRNA的分離和純化1、生物素標記的Oligo (dT)探針與mRNA的退火在經焦炭酸二乙酯處理不含RNA酶的1. 5mL離心管中加入0. 5mg總RNA，溶解于 500 μ L焦炭酸二乙酯處理水中，65°C水浴保溫10分鐘，加入3 μ L的Oligo (dT)探針，13 μ L ^ 20 X SSC(1L 20XSSC含175. 3g氯化鈉和88. 2g檸檬酸鈉，ρΗ 7.0)輕輕混勻，室溫放置 約10-20分鐘至冷卻。2、親和素順磁磁珠的沖洗將一管親和素順磁磁珠(購白Promega Corporation)輕輕懸浮后放入磁性分離 架中，使親和素順磁磁珠集中到管的一側，小心除去上清，用300yL 0.5XSSC清洗親和素 順磁磁珠三次，每次用磁性分離架集中磁珠，去除上清液，將清洗過的親和素順磁磁珠溶于 100 μ L 的 0. 5 X SSC 中備用。3、雜交體的生成和漂洗將已退火的生物素標記探針，加入到溶于100 μ L的0. 5 X SSC的親和素順磁磁珠 中，輕輕混勻，室溫放置10分鐘，每隔1-2分鐘輕混勻一次，用磁性分離架捕獲磁珠親和素 順磁磁珠，小心去除上清，用300 μ L的0. 1 X SSC洗滌親和素順磁磁珠，磁性分離架集中后 去除上清液，共重復4次。4、洗脫 mRNA將漂洗過的親和素順磁磁珠重新懸浮于100μ L的焦炭酸二乙酯水中，用磁性分 離架捕獲磁珠，將洗脫的水相吸至一新管中，重復清洗親和素順磁磁珠，共得到250 μ L的 mRNA。5、mRNA的沉淀和溶解加入0. 1 X體積的醋酸鈉(ρΗ 5. 2)和1 X體積的異丙醇沉淀mRNA，-20°C過夜。 12000轉/分鐘離心10分鐘，去上清。加入ImL的75 %的乙醇懸浮后，離心片刻，去上清， 干燥，復溶于30 μ L的焦炭酸二乙酯處理的水中。3. 5yL mRNA加入16. 5 μ L上樣緩沖液 (按7 33配)混勻后在95°C變性2分鐘，拿出后立即放入冰上，防止退火，甲醛凝膠變性 電泳時，電泳槽置于冰上，保證低溫。電壓不超過5v/cm。三、cDNA第一鏈合成在0. 5mL的離心管中，分別加入3 μ L的茶樹mRNA，IyL 10 μ M 5，PCR第一鏈合 成引物(5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3，)，1 μ L 10 μ M 3，PCR 弓|物 (5，-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)‘ ) (N = A，G，C 或者 T ；N^1 = A, G, C)。 混勻，稍離心，72°C溫育2分鐘，冰上冷卻2分鐘，離心把組分收集到底部，每管中加入2μ L 5 X第一鏈合成緩沖液，1 μ L二硫蘇糖醇(20mM)，1 μ L dNTP混合物(IOmM)，1 μ L反轉錄酶， 至總體積為10yL。經渦旋、瞬間離心混勻，在PTC-220 PCR儀中42°C溫育1小時后，取出 放于冰上，終止第一鏈的合成。放于-20C冰箱中可保存3個月，備用。 四、cDNA第二鏈的合成 先把PCR儀加熱到95°C。在一個0. 5mL的離心管中加入2 μ L第一鏈cDNA，80 μ L 無離子水，IOyL 10XPCR緩沖液，2μ L 50 X dNTP mix,2y L 10 μ M 5，PCR第二鏈合成引物(5‘-AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGT_3，)，2yL 3，PCI^|*(5，-ATTCTAGAGG CCGAGGCGGCCGACA TG-d (T) 30^^-3' ) (N = A，G，C 或者 T ；N^1 = A，G，C)，2 μ L 50 X 聚合酶混合物至總體積為 100 μ L，輕輕振動混勻，稍離心，將物質收集到底部，必要時加2滴礦物油以覆蓋液面。放進 經預熱到95°C的PCR儀中，PCR反應程序如下95°C變性20秒，接著95°C 5秒，68°C 6分 鐘共24個循環，PCR結束后，取5yL用1. 瓊脂糖凝膠電泳檢測。其余放于-20°C冰箱 可保存3個月。五、Sfi I酶切獲得可連接的cDNA1、在一個0. 5mL的離心管中加入79 μ L cDNA10 μ L IOXSfi I 緩沖液10 μ L Sfi I 內切酶(20 單位 / μ L)IyL IOOX牛血清白蛋白充分混勻2、50°C水浴保溫2小時，取出后放于-20V冰箱中3、分離時再加入2μ L 二甲苯青，充分混勻六、建庫用cDNA分離1、將約100 μ L經Sfi I酶切的cDNA和二甲苯青的混合物加到CHROMA SPIN-400 柱(Clontech Laboratories, Inc.)膠頂部中心表面。2、用100 μ L的柱子緩沖液清洗含有cDNA的管，再輕倒入膠表面。3、讓緩沖液流光，當停止時，繼續下一步，讓染料層進入膠內幾毫米。4、將放有16個管子的架子放在柱子下面，第一個管子正在柱子下的出口。5、加600 μ L的柱子緩沖液，立即開始收集，每管35 μ L (約1滴)，收集后的管子立 即加蓋，當都收集完后，蓋上柱子的蓋子。6、在進行實驗前，檢查每個管子的組分，在1. 的瓊脂糖/EB膠上電泳，每管用 3 μ L連續在點樣孔加樣，用Ikb DNA Marker作分子量標記，150V電泳10分鐘。收集最亮 的3-4個組分到一個新1. 5mL的管中。7、加入 1/10 體積醋酸鈉(3M ；pH4. 8)，1. 3 μ L 糖原(20mg/mL)和 2. 5 體積的 95% 乙醇，_20°C過夜。9、室溫14000轉/分鐘離心20分鐘，小心去上清。10、輕離心，去剩余的上清，干燥約10分鐘后溶于7μ L的無離子水。七、cDNA與載體連接1、按下列組分準備一個連接反應對照(μ L)樣品(μ L)cDNA1.01.0λ TripIEx2 載體(500ng/ μ L)1.01.0IOX連接酶緩沖液0.50.5ATP(IOmM)0.50.5T4 DNA 連接酶(400 單位 / μ L)0. 50.5無離子水1. 51. 5總體積5. 05. 0 2、輕輕混勻，避免產生氣泡，瞬間離心使組分沉到底部，16°C連接過夜
3、對于每一個連接，做一個包裝反應。八、包裝反應1、在每一個連接產物中加入25 μ L的包裝蛋白。2、30°C溫育 90 分鐘。3、取出放于4°C冰箱中可保存2周。經過擴增的文庫可以在4°C穩定保存6_7個 月，或在7%二甲基亞砜中-70°C至少保存1年以上。九、測定滴度從平板中挑取分離良好的單克隆接種到含15mL LB/硫酸鎂/麥芽糖培養基的 50mL試管中，140轉/分鐘震蕩37°C培養過夜直至OD值達到2. 0，5000轉/分鐘離心5分 鐘，去上清液，用7. 5mL IOmM硫酸鎂重新懸浮沉淀。將包裝產物用噬菌體緩沖液稀釋5_20 倍，在200 μ L過夜培養的XL-IBlue受體菌中加入1 μ L稀釋的噬菌體，讓噬菌體在37°C吸 收10-15分鐘，再加入2mL溶解的LB/硫酸鎂頂層瓊脂。快速顛倒混勻并倒入經37°C預熱 的LB/硫酸鎂平板，快速搖動平板使均勻分布，室溫冷卻10分鐘讓頂層瓊脂變硬，倒置平板 在37°C培養6-17小時，統計菌斑并根據公式文庫滴度(pfu/mL)=(噬菌斑數X稀釋倍 數)/受體菌的體積，計算未擴增文庫滴度6. 8X 105pfu/mL，總克隆數為3. 5 X IO5個。十、文庫重組率的測定本文庫可以利用X-Gal顯色原理測定重組率，在測定滴度時加入IOOmM的IPTG及 IOOmM的X-Gal，過夜培養后，通過藍斑(未重組克隆)、白斑(重組克隆)的數量計算重組 率為 98. 05%。i^一、cDNA插入片段的PCR鑒定從LB平板上隨機挑取15-20個獨立的噬菌斑，分別加到含有200 μ L噬菌體緩 沖液的離心管中，37 °C放置1小時后，保存于4°C，利用XTripEX2噬菌體5’ PCR引物 (5，-CTCCGAGATCTGGACGAGCT-3，)和 3，PCR 弓|物(5，-GGGATATCACTCAG CATAAT-3，)對構 建的文庫進行PCR鑒定。PCR結果表明插入片段大多分布在0. 5-2. Okb之間，絕大部分在 1. 0-1. 5kb 左右。實施例2，茶樹幼根cDNA文庫的構建一、幼根總RNA的提取將茶樹龍井43的儲存種子播種于一定濕度的石英砂中，室溫25°C培養室中培養， 待長出幼苗后，取其幼根lOOmg，迅速加液氮冷凍研磨成細粉末狀，加入1000 μ L Trizol試 劑繼續研磨后，再加入1000 μ L Trizol試劑，混勻分裝到兩個經DEPC (焦炭酸二乙酯)處 理的1. 5mL離心管中，冰上放置5min，各加入200 μ L的氯仿，顛倒混勻，4°C 12000rpm離 心lOmin，取500 μ L上清液，加入等體積異丙醇，上下輕輕顛倒10次，室溫放置lOmin，4°C 12000rpm離心lOmin，去上清，沉淀中加入ImL 75 %乙醇輕輕清洗，倒去乙醇，干燥后加入 20 μ L經DEPC處理過的ddH20溶解沉淀。甲醛凝膠變性電泳檢測RNA質量后于_70°C冰箱 中長期保存，備用。二、mRNA的分離和純化采用實施例1，“茶樹葉片cDNA文庫的構建”中的“mRNA的分離和純化”所描述的 流程、方法分離和純化幼根mRNA。三、cDNA第一鏈合成
在RNase-free 的 0. 2ml PCR 管中，加入 3 μ L 上面提取的 mRNA，1 μ L 帶有 Xho I 酶切位點的引物(5 ‘ -GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ‘)， 8 μ L的RNase-free ddH20。混勻后，70°C反應lOmin，冰上冷卻2min，離心把組分收集到底 部，按順序加入以下試劑4μ L 5Χfirst strand buffer2 μ L 0. IM DTT1 μ L dNTP (IOmM)混勻后稍離心，42°C放置2min，反應完成，趁熱加入IyL Superscipt II_RT，42°C 反應50min，然后70°C水浴15min滅活反轉錄酶。四、cDNA第二鏈的合成第一鏈反應完成后，取2yL 第一鏈 cDNA，140 μ L ddH20, 20 μ L IOXDNA Polymerase I buffer,6y L IOmM dNTP,1 μ L RNase H(2U/μ L)，10 μ M DNA Polymerase Ι(10υ/μ L)，總體系為200 μ L0混勻后，16°C反應2. 5hr，70°C滅活lOmin，反應完成后，得到 200 μ L cDNA第二鏈反應體系，將此體系置于冰上，取2 μ L 二鏈產物，同保存的一鏈產物一 起電泳鑒定。同時上Ikb ladder，確定雙鏈的大小范圍。五、雙鏈cDNA末端補平1.在第二鏈反應體系中，順序加入下列試劑6μ L dNTP(IOmM)2 μ L T4 DNA Polymerase (8. 7U/ μ L)2μ L BSA(10mg/ml)2.稍微離心混勻反應物，37°C反應至少30min，然后75°C滅活IOmin ；3.加入等體積酚/氯仿/異戊醇，劇烈振蕩后，常溫下13000g離心5min ；4.離心后，吸取上清于另一 1. 5ml離心管中，加入等體積氯仿，上下顛倒幾次混勻 后，常溫下13000g離心5min ；5.吸取上清至新離心管中，加入1/10體積的3M NaAc (PH5. 2)和2. 5倍體積的預 冷的無水乙醇，混勻，_20°C放置過夜以沉淀雙鏈cDNA ；6.將過夜的沉淀物在4°C，13000g離心60min以充分沉淀雙鏈cDNA ；7.離心完畢，棄上清，加入Iml 70%乙醇洗滌沉淀，常溫下13000g離心5min ；8.離心完畢，棄上清，干燥沉淀至無乙醇氣味。六、EcoR I adaptor 力口接1.往雙鏈 cDNA 沉淀中加入 9yL EcoR I adaptor (400ng/μ L)，4 °C 至少放置 30min以充分溶解cDNA沉淀；2.溶解完成后，順序加入下列試劑1. 2μ L IOXLigase Buffer1 μ L ATP(IOmM)1 μ L T4 DNA Ligase (4U/μ L)3.混勻后，8°C過夜連接；七、雙鏈cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切1.連接反應完成后，將反應體系在70°C水浴15min，滅活T4 DNA Ligase ；0116]
0117]
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0120] 0121] 0122]
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0128] 接。
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存備用<
0140]
0141]
0142]
2.稍微離心使反應物集中至管底，室溫下放置5min，然后加入下列試劑 IyL IOXLigase Buffer
1 μ L ATP(IOmM) 6 μ L dd H2O
1μ L T4 PNK (1OU/μ L)
3.37°C反應 30min 后，70°C滅活 15min ；
4.稍微離心使反應物集中至管底，室溫放置5min后，加入下列試劑 4μ L Xho IOXBuffer
2μ L BSA
5 μ L ddH20
8μ L Xho KlOU/μ L)
5.37°C反應 1. 5hr，然后 65°C滅活 IOmin ；
6.反應完成后將雙鏈cDNA回收，然后與同樣經XhoI酶切的pBluescript載體連 八、cDNA與載體連接
1.按下列組分準備一個連接反應對照(μ L) 樣品(μ L) cDNA 06. 5 ddH20 6. 5 0 IOXligase buffer 1.0 1.0 ATP(IOmM) 1.0 1.0 pBluescript vector 1.0 1.0
T4 DNA ligase (4U/μ L)1.01.0
總體積10.010.0
2.輕輕混勻，避免產生氣泡，瞬間離心使組分沉到底部，12°C連接過夜。
3.將連接產物在純化膜上純化一個半小時，然后吸到一個新的PCR管里，-20°C保
九、電轉化
1.從-80°C冰箱中取出制備好的感受態細胞，置于冰上解凍；
2.取1μ L純化后的連接產物于1. 5ml的離心管中，將其和0. ICM的電極杯一起置 于冰上預冷；
0143]3.將40 μ L解凍的感受態細胞轉移至此1.5ml的離心管中，小心混勻，冰上放置 Omin ；
0144]4.打開電轉儀，調節電壓為2. IKV ；
0145]5.將此混合物轉移至已預冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進入電極 杯的底部；
0146]6.將電極杯推入電轉化儀，按下pulse鍵，聽到蜂鳴后，向電擊杯中迅速加入 500 μ L的SOC液體培養基，重懸細胞后，轉移到1. 5ml的離心管中；
0147]7.將離心管置于37°C，220rpm復蘇1小時；
0148]8.取20 μ L轉化產物加160 μ L SOC涂板，放于37°C過夜培養；
9.其余菌液加1 1的30%甘油后，混勻_80°C保存。十、文庫重組率的測定利用X-Gal顯色原理測定重組率，在測定滴度時加入IOOmM的IPTG及IOOmM的 X-Gal過夜培養后，通過藍斑(未重組克隆)、白斑(重組克隆)的數量計算重組率。實施例3，茶樹葉片及幼根表達序列標簽測序以前面構建的茶樹葉片cDNA文庫和茶樹幼根cDNA文庫為測序EST的文庫來源， 采用自動測序儀Megabace 1000對龍井43新梢cDNA文庫的4320個克隆進行隨機測序 分析，獲得有效序列2963個，將所有有效序列進行去重復和拼接后獲得新梢表達序列標 簽1692個；對幼根cDNA文庫的5115個克隆進行隨機測序分析，獲得有效序列4833個，大 部分序列長度在300bp-700bp之間，平均長度474bp，將所有有效序列進行去重復和拼接 后獲得幼根表達序列標簽3482個。將得到的所有非冗余序列與GenBank的蛋白質數據庫 進行BlastX比對分析，結果與已知防衛病、蟲等生物脅迫及干旱、寒冷等非生物脅迫相關 基因200多個、還含有大量與已知擬境相關轉錄因子和信號轉導基因、以及在能量代謝、基 礎代謝中起作用的關鍵基因。最后從所有非冗余序列中選取84條茶樹次生代謝相關基因 的的DNA序列用作芯片探針，它們對應的GenBank登錄號如下所示CV013596，CV013616， CV013618, CV013628, CV013652, CV013653, CV013694, CV013706, CV013713, CV013739, CV013758, CV013771, CV013829, CV013899, CV013912, CV013930, CVO13949, CV013953, CV013960, CV013988, CV014001, CV014012, CV014025, CV014079, CV014083, CV014105, CV014108, CV014139, CV014153, CV014221, CV014238, CV014256, CV014313, CV014338, CV014351, CV014366, CV014373, CVO14412, CV014419, CV014437, CV014441, CV014448, CV014451, CV014457, CVO14468, CVO14476, CV014500, CVO14501, CV014509, CV014511, CVO14540, CV014542, CV014559, CV014590, CV014623, CV014653, CV014657, CVO14658, CV014662, CV014783, CV067017, CV067030, CV067033, CV067105, CV067144, CV067153, AB018685, AY169404, AY641730, AY641731, AY830416, AY641729, DQ904328, DQ904329, D26594, D26595, D26596, DQ120521, DQ194356, DQ194358, EF205148, EF205149, EF205150, FJ1694990實施例4，芯片的制備一、探針的制備將84個茶樹次生代謝相關基因和5個茶樹看家基因所對應的克隆挑選出來，重新 排列后，搖菌并提取質粒，以此為模板PCR擴增目的片段，將PCR擴增得到的兩部分序列用 乙醇沉淀法進行純化，測定濃度后，定量到250ng/μ L。這5個茶樹看家基因具有SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 3所示的基因序列。二、外標基因片段的制備選取了酵母基因間的8段序列，經過序列同源性的BLAST比對，這8段核酸序列 和NCBI上所有已知的核酸序列都沒有同源性。把這8段序列以酵母基因組DNA為模板經 過PCR擴增出來，然后把此8段核酸序列克隆到以下帶有PolyA的pSP64Poly (A)質粒載體 中，通過體外轉錄的方法制備外標核酸序列對應的PolyA-RNA。把此PolyA-RNA按照不同 比例的數量摻入到實驗樣品的RNA中去，一同進行標記、雜交。在芯片上也點有外標核酸 DNA序列，因此雜交后，在芯片上外標DNA序列對應的點就會有雜交信號，并且通過調節摻入PolyA-RNA的量而得到外標的不同雜交信號。三、芯片的點制將純化定量后的探針轉入384孔板中，加入等體積的點樣液，隨后將其點制在一 張75X25mm、經過修飾的三維氨基基片上。點陣設計為4小圍欄分布方式，如圖1所示。所 有矩陣的設計完全相同。每個矩陣的排列方式為18x18，每點重復3次。其中第一排1 15個序列點為內參，第一排16 18個序列點為陽性對照序列點，第二排1 3個序列點為 陰性對照序列點，第二排4 18個序列點和第三排1 9個序列點為外標，其余為茶樹次 生代謝相關基因的cDNA片段，如圖2所示。點樣后每張芯片可以完成四對樣品的檢測，保 存在無菌干燥處。經檢測該芯片上的探針量足夠，點直徑的CV值小于10%。實施例5，茶樹次生代謝相關基因表達的分析檢測一、茶樹總RNA的提取和mRNA純化取待分析的不同生長發育階段或不同器官的茶樹幼嫩材料100_500mg(材料多少 視RNA含量而定)，采用實施例1，“cDNA文庫的構建”中的“RNA的提取”所描述的流程、方 法提取總RNA用于以下的步驟。二、對樣品RNA進行熒光標記以Total RNA為起始，含有T7啟動子序列的T7 Oligo (dT) Primer為引物，使用 CbcScript酶合成第一鏈cDNA，用RNase H將雜合鏈中的RNA切成短片段，DNA聚合酶以RNA 短片段為引物延伸，合成第二鏈cDNA，并純化雙鏈cDNA。以cDNA為模板，利用T7 Enzyme Mix 合成 cRNA ；然后用 RNA Clean-up Kit 純化。取 2yg cRNA，用 CbcScript II 酶，隨機引 物進行反轉錄，反轉錄產物用PCR NucleoSpinExtract II Kit純化。取上述反轉錄產物， 以隨機引物進行KLENOW酶標記，標記產物用PCR NucleoSpinExtract II Kit純化，純化后 抽干。三、雜交與清洗標記的DNA溶于80 μ 1雜交液中，于42°C雜交過夜。雜交結束后，先在42°C左右 含0.2% SDS，2XSSC的液體中洗5min，而后在0. 2XSSC中室溫洗5min。玻片甩干后用 GenePix 4000B雙通道激光掃描儀進行掃描。四、數據采集及分析采用GenePix Pro 4. O生物芯片圖像分析軟件對掃描的芯片圖像進行分析，把圖 像信號轉化為數字信號；采用Lowess方法對芯片數據進行歸一化，校正由于熒光Cy3和 Cy5的標記效率和理化性質的不同及其它系統誤差所造成的兩種熒光信號強度的差異；并 刪除了熒光信號弱的基因以及芯片上的陰性對照、內標、外標等冗余的數據。根據歸一化后 的結果得到每張芯片中基因的ratio值，再將兩張熒光交換芯片的ratio值整合，ratio = (ratiOl*ratiO2)~0.5，用SAM軟件進行分析，最后以上調或下調1.5倍標準篩選差異表達 基因。
1權利要求
一種檢測茶樹次生代謝相關基因表達信息的cDNA芯片，其特征在于該cDNA芯片由84個茶樹次生代謝相關基因的cDNA片段組成，它們在GenBank上的登錄號如下CV013596，CV013616，CV013618，CV013628，CV013652，CV013653，CV013694，CV013706，CV013713，CV013739，CV013758，CV013771，CV013829，CV013899，CV013912，CV013930，CV013949，CV013953，CV013960，CV013988，CV014001，CV014012，CV014025，CV014079，CV014083，CV014105，CV014108，CV014139，CV014153，CV014221，CV014238，CV014256，CV014313，CV014338，CV014351，CV014366，CV014373，CV014412，CV014419，CV014437，CV014441，CV014448，CV014451，CV014457，CV014468，CV014476，CV014500，CV014501，CV014509，CV014511，CV014540，CV014542，CV014559，CV014590，CV014623，CV014653，CV014657，CV014658，CV014662，CV014783，CV067017，CV067030，CV067033，CV067105，CV067144，CV067153，AB018685，AY169404，AY641730，AY641731，AY830416，AY641729，DQ904328，DQ904329，D26594，D26595，D26596，DQ120521，DQ194356，DQ194358，EF205148，EF205149，EF205150，FJ169499。
2.—種權利要求1所述cDNA芯片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)構建茶樹幼嫩葉片和幼根的cDNA文庫。2)從步驟1)中構建的cDNA文庫中挑選非冗余序列制作探針，所述探針為84條具有 下述 GenBank 登錄號的 DNA 序列CV013596，CV013616, CV013618, CV013628, CV013652,CV013653,CV013694,CV013706,CV013713,CV013899,CV013912,CV013930,CVO13949,CV014012,CV014025,CV014079,CV014083,CV014221,CV014238,CV014256,CV014313,CV014412,CV014419,CV014437,CV014441,CV014476,CV014500,CVO14501,CV014509,CV014590,CV014623,CV014653,CV014657,CV067030,CV067033,CV067105,CV067144,CV013739, CV013758, CV013771, CV013829, CV013953, CV013960, CV013988, CV014001, CV014105, CV014108, CV014139, CV014153, CV014338, CV014351, CV014366, CV014373, CVO14448, CV014451, CV014457, CVO14468, CV014511, CVO14540, CV014542, CV014559, CV014658, CV014662, CV014783, CV067017, CV067153, AB018685, AY169404, AY641730,AY641731, AY830416, AY641729, DQ904328, DQ904329, D26594, D26595, D26596, DQ120521, DQ194356, DQ194358, EF205148, EF205149, EF205150, FJ169499。3)利用通用引物M13擴增目的片段，純化后將探針濃度定量為250ng/yL。4)取5μ L步驟(3)的純化產物，加5 μ L點樣液，并將混合液移至384孔板中。5)將步驟(4)的探針溶液點在適合的載體上，點制在載體上的樣品還包括若干個與已 知基因沒有相似性的基因間序列作為外標，干燥后得到用于檢測茶樹次生代謝相關基因表 達信息的cDNA芯片。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中制備的探針還包括5 個茶樹看家基因作為內參，茶樹看家基因為具有序列表中SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 3所 示基因序列。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中，每個探針設3個重Μ. ο
5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中，適合的載體是固相 載體，其或為玻片，或為硅片，或為尼龍膜，或為硝酸纖維膜。
全文摘要
本發明公開了一種檢測茶樹次生代謝相關基因表達信息的cDNA芯片，它以茶樹次生代謝相關基因的cDNA片段作為探針，由84條在GenBank登錄的探針序列、5條序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.5所示茶樹看家基因序列、8個和已知基因均沒有相似性的酵母基因間序列及1個空白點樣液組成，每個探針設置3個重復。本發明不僅可用于批量檢測不同茶樹品種中茶樹次生代謝相關基因的表達情況，從而篩選出表現優異的茶樹品種，起到輔助育種的作用，還可用于構建特異茶樹品種不同生長階段、不同組織器官乃至特異細胞中的基因表達譜。應用該芯片可實現次生代謝相關基因的高通量檢測，且操作方便、安全，檢測結果可靠有效，可節省大量時間、人力、物力和財力，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK101942515SQ20101026949
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月27日 優先權日2010年8月27日
發明者姚明哲, 王新超, 金基強, 陳亮, 馬春雷 申請人:中國農業科學院茶葉研究所