專利名稱：一種根圍金黃桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物技術領域，特別是涉及一種能產生纖維素酶的新的細菌-根圍 金黃桿菌及其應用。
背景技術：
自從在蝸牛消化道中發現纖維素酶以來，纖維素的微生物降解問題引起了業界足 夠的關注。現在纖維素酶的應用已擴展到食品發酵、醫藥、紡織、日用化工、造紙、工業洗滌、 煙草、石油開采、廢水處理及飼料等各個領域，其應用前景十分廣闊。隨著能源問題日益突出，各國逐漸把對纖維素的降解研究作為一項重要的研究課 題。而纖維素的酶降解是利用纖維素的一個有效途徑。目前主要對真菌纖維素酶的研究已 經非常成熟，且真菌纖維素酶的活性比較高，例如里氏木霉、綠色木霉、康氏木霉等。對細菌 纖維素酶方面的研究近幾年也有很多報道，但普遍認為細菌纖維素酶活性比真菌纖維素酶 的活性低。而細菌作為世界分布最廣的生物具有非常大的開發價值空間，對于篩選一系列 產纖維素酶細菌菌群，得到高產而且具較好穩定性纖維素酶新的菌群也是一個研究熱點。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種能夠產纖維素酶的新的細菌——根圍金黃桿菌 (Chryseoba cterium rhizosphaerae)GIMN1. 005，該菌于 2009 年 10 月 20 日保藏于中國典 型培養物保藏中心(CCTCC)Jiyi 中國武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCC NO :M209230。本發明的根圍金黃桿菌是從越南采集的根際土壤中分離培養獲得的。該菌培養 條件為培養基采用營養瓊脂培養基(NA)，具體配方為蛋白胨10. 0g，酵母膏5g，氯化鈉 5g，瓊脂 20. 0g,7jC 1000ml ；pH6. 8 7. 0。培養溫度:30°C。其形態特征該根圍金黃桿菌在平板上培養24h后的菌落呈金黃色，圓形或不規 則形，表面光滑半透明，邊緣整齊；革蘭氏染色為陰性，菌體桿狀，具有周身纖毛，不運動，無 莢膜，不形成芽孢。本發明根圍金黃桿菌(Chryseobacteriumrhizosphaerae) GIMN1. 005 的分子分類 地位的確定。常規方法提取根圍金黃桿菌的16SrDNA，其序列如SEQ ID NO :1所示，該序 列與GenBank數據庫中的已知序列進行BLAST比較分析，并從數據庫獲得相關種屬的 16SrDNA序列，構建系統發育樹，見于圖2。經比較分析發現，本發明的根圍金黃桿菌與菌 株(Chryseobacterium aquifrigidense KCTC 12894τ)親緣關系最近，根圍金黃桿菌的 16SrDNA 基因序列只與 Chryseobacterium aquifrigidense KCTC 12894τ 有 98. 6% 的同 源性，但通過DNA-DNA雜交顯示，根圍金黃桿菌與金黃桿菌模式菌株Chryseobacterium soli KACC12502T, C. jejuense KACC12501T, and C. taiwanense KACC12985T 分別只有 20. 3士0. 8%, 28. 6士0. 6%和 18. 1 士0. 的同源性。將本發明的根圍金黃桿菌與其同源性最高的金黃桿菌菌株進行微生物學特性分析，具體結果見于表1。表1根圍金黃桿菌與其同源性最高的金黃桿菌菌株微生物學特性比較 注+，陽性；-，陰性；+/_，弱陽性；NA，無可取數據由表1可以看出，本發明的根圍金黃桿菌，其接觸酶試驗為陽性；能水解明膠、淀粉和酪蛋白；吲哚為陰性；不利用檸檬酸鹽，在L-海藻糖、D-甘露醇、甘露糖、麥芽糖中產 酸，不能利用纖維二糖、蔗糖、松三糖、棉子糖、木糖、蜜二糖、鳥氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、 賴氨酸脫羧酶，在糖類中生長不產氣；ONPG為陽性，尿素為陰性。生長溫度范圍5-37°C， 以及生長PH值范圍為5. 0-9.0，其甲基萘醌主要類型為MK-6。與其同源性最高的菌株 C. aquifrigidense KCTC 12894τ在生理生化特征、G+Cmol%,以及細胞壁脂肪酸種類和含 量等各方面都存在差異。C.aquifrigidense KCTC 12894τ的生理生化特征是在麥康凱瓊脂 上不生長，不產H2S,不利用海藻糖，生長范圍為15-35°C，pH范圍為6. 0-9. 0，硝酸鹽還原為 陽性，G+Cmol %為35. 6mol % ；而根圍金黃桿菌能在麥康凱瓊脂上生長，產H2S，利用海藻糖， 生長范圍為5-37°C, pH范圍為5. 0-9. 0，硝酸鹽還原為陰性，G+Cmol%為42. Imol%0除此 以外，C. aquifrigidense KCTC 12894τ的脂肪酸主要種類和含量分別為iso-C15:(1 (45. 5% )， ISO-L17. lv9c (14. 4%) ？ iso—C17.Q3-OH (13. O% ) and summed feature 3 (comprising iso_C15:02—0H and/or C16llv7c ；8. 8% )，而根圍金黃桿菌為 iso-C17:(13_QH (22. 41% ), iso-C17:lw9c (19. 20% ) 和iso-C15:Q(18. 3%)。而且根圍金黃桿菌的16SrDNA基因序列只與C. aquifrigidense KCTC 1289#有98. 6%的同源性，綜合上述數據，可以證明它們不是同一個種。綜合16SrDNA序列分析、微生物學特性分析和DNA-DNA雜交結果(1987年國際系 統細菌學委員會ICSB規定，DNA同源性小于70%或雜交分子的熱解鏈溫度差小于或等于 2°C為細菌種的界線，Wayne et al，1987)，表明本發明的芽孢桿菌是一種新的細菌，命名為 根圍金黃桿菌(Chryseobacterium rhizosphaerae) GIMN1. 005，該菌于 2009 年 10 月 20 日 保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCC NO :M209230。經實驗發現，本發明的根圍金黃桿菌具有產生纖維素酶的能力。因此本發明的另外一個目的是提供根圍金黃桿菌(Chryseobacterium rhizosphaerae)GIMN1. 005在產纖維素酶上的應用。由于本發明的根圍金黃桿菌具有產生纖維素酶的能力，可用于生產纖維素酶，因 此對纖維素酶的生產和利用纖維素酶降解纖維素的研究和利用具有重要的價值。本發明的根圍金黃桿菌(Chryseobacterium rhizosphaerae)GIMN1. 005 已于 2009年10月20日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢市武漢大學， 保藏編號為 CCTCC NO :M209230。
圖1是本發明的根圍金黃桿菌的透射電子顯微鏡照片(A，6000倍；B 超薄切片 7000 倍)；圖2是本發明的根圍金黃桿菌及部分相關菌株依據16S rDNA序列構建的系統發育樹。
具體實施例方式以下是對本發明做進一步的說明，而不是對本發明的限制。實施例1 ―、卞艮Iimff胃(Chryseobacterium rhizosphaerae) GIMN 1.005 的^>畠。
從越南根際0-30cm土樣，取IOg土壤放入裝有90mL無菌水的三角瓶中(帶玻珠)， 在ISOrpm轉速下振蕩30分鐘，靜置10分鐘后取上層液稀釋10倍后取0. ImL均勻涂布在 NA瓊脂培養基板上，翻轉平板置于30°C培養箱中培養7天，即可獲得本發明所述的根圍金 黃桿菌(Chryseobacterium rhizosphaerae)GIMNL 005。所述的營養瓊脂培養基的配方為蛋白胨10. Og,酵母膏5g，氯化鈉5g，瓊脂 20. Og,水 IOOOml ；ρΗ6· 8 7. 0。本發明的根圍金黃桿菌(Chryseobacteriumrhizosphaerae) GIMN1. 005 具有下述 特征1、形態特征根圍金黃桿菌在電鏡下的形態見于圖1的A和B，該菌在平板上培養24h后的菌落 呈金黃色，圓形或不規則形，表面光滑半透明，邊緣整齊；革蘭氏染色為陰性，菌體桿狀，具 有周身纖毛，不運動，無莢膜，不形成芽孢。2、生理生化特征經生理生化測定，本發明的根圍金黃桿菌的接觸酶試驗為陽性；能水解明膠、淀粉 和酪蛋白；噴哚為陰性；不利用檸檬酸鹽，在L-海藻糖、D-甘露醇、甘露糖、麥芽糖中產酸， 不能利用纖維二糖、蔗糖、松三糖、棉子糖、木糖、蜜二糖、鳥氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、賴 氨酸脫羧酶，在糖類中生長不產氣；ONPG為陽性，尿素為陰性。生長溫度范圍5-37°C，以及 生長PH值范圍為5. 0-9.0。3、其他性質甲基萘醌的主要類型為MK-6，細胞壁脂肪酸種類和含量如表2。表2根圍金黃桿菌與其同源性高的金黃桿菌菌株的細胞壁脂肪酸種類和含量比 較 *表示有兩到三組脂肪酸不能用氣相液譜MIDI系統所分離。3包括isO-C15:(12-0H 和 / 或 C16:lv7。；4 包括 iso-C17: II 和 / 或 anteiso-C17:1B.二、根圍金黃桿菌16SrDNA的序列測定與分析1、PCR模板DNA的快速制備將根圍金黃桿菌劃線接種在NA培養基的平板上，30°C培養過夜。取單一菌落懸浮 于10 μ 1無菌蒸餾水中，于沸水中加熱5min，離心，取上清作為PCR模板DNA.2、16SrRNA 基因 PCR 擴增PCR引物由上海英駿公司合成。PrimerA :5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，PrimerB :5’ -AAGGAGGTGATCCACCCCCA-3’PCR 反應體系(總體積 50 μ 1) :10 倍緩沖液 5μ 1，dNTP (2 謹 ol/l) 4 μ 1， PrimerAdOpmo 1/1) 1 μ 1，PrimerB (IOpmo 1/1) 1 μ 1，Taq 酶(2U/1)0. 4μ 1，DNA 模板 1 μ 1, 滅菌 ddH20 37. 4 μ I0PCR 擴增條件-MV 5min ；94°C lmin，56°C lmin，72°C 2min，30 個循環；72°C 7min。3、序列測定PCR產物純化后，送上海英駿公司用3730全自動測序儀測序，其序列如SEQ ID N0:1所示。該序列與GenBank數據庫中的已知序列進行BLAST比較分析，并從數據庫 獲得相關種屬的16SrDNA序列，構建系統發育樹，見于圖2。經比較分析發現，本發明的 根圍金黃桿菌與菌株(Chryseobacterium aquifrigidense KCTC 12894τ)親緣關系最 近，根圍金黃桿菌的16SrDNA基因序列只與Chryseobacterium aquifrigidense KCTC12894τ有98. 6 %的同源性，但通過DNA-DNA雜交顯示，根圍金黃桿菌與金黃桿菌模式菌 株 Chryseobacterium soli KACC12502T, C. jejuense KACC12501T, and C. taiwanense KACC12985T 分別只有 20. 3士0. 8%,28. 6士0. 6%和 18. 1 士0. 的同源性。將本發明的根圍金黃桿菌與其同源性最高的金黃桿菌菌株進行微生物學特性分 析，具體結果見于表1。由表1可以看出，本發明的根圍金黃桿菌與其同源性最高的菌株 C. aquifrigidense KCTC12894T在在生理生化特征、G+Cmol %等方面都存在差異。 C. aquifrigidense KCTC 12894τ在麥康凱瓊脂上不生長，不產H2S,不利用海藻糖，生長范圍 為15-35°C，pH范圍為6. 0-9.0，硝酸鹽還原為陽性，G+Cmol %為35. 6mol% ；而根圍金黃桿 菌能在麥康凱瓊脂上生長，產H2S,利用海藻糖，生長范圍為5-37°C，pH范圍為5. 0-9. 0，硝 酸鹽還原為陰性，G+Cmol %為42. Imol %。綜合16SrDNA序列分析、微生物學特性分析和DNA-DNA雜交結果(1987年國際系 統細菌學委員會ICSB規定，DNA同源性小于70%或雜交分子的熱解鏈溫度差小于或等于 2°C為細菌種的界線，Wayne et al，1987)，本發明的芽孢桿菌是一種新的細菌，命名為根圍 金黃桿菌(Chryseobacterium rhizosphaerae) GIMN1. 005，該菌于 2009 年 10 月 20 日保藏 于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCC N0 M209230。三、根圍金黃桿菌產生的纖維素酶產生測定挑取本發明的根圍金黃桿菌的單菌落，接種至羧甲基纖維素(CMC)的選擇性平板 培養基，在30°C的培養箱中培養1-2天，lmg/mL的剛果紅溶液，10-15分鐘后，倒去剛果紅溶 液，加入物質的量濃度為lmol/L的NaCl溶液，15分鐘后倒掉NaCl溶液，觀察在平板上是否 出現透明圈。測試結果發現，平板上出現了透明圈，由此表明本發明的根圍金黃桿菌具有產生 纖維素酶的能力，可用于纖維素降解研究和利用。
權利要求
一種根圍金黃桿菌(Chryseobacterium rhizosphaerae)GIMN1.005，其保藏編號為CCTCCNOM209230。
2.權利要求1所述的根圍金黃桿菌在產纖維素酶上的應用。
全文摘要
本發明公開了一種根圍金黃桿菌及其應用。本發明分離得到了一種能夠產纖維素酶的新的細菌——根圍金黃桿菌(Chryseobacterium rhizosphaerae)GIMN1.005，該菌于2009年10月20日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCC NOM209230。因為本發明的根圍金黃桿菌能夠產生纖維素酶，可用于產纖維素酶的應用上，因此對纖維素酶的生產和利用纖維素酶降解纖維素的研究和利用具有重要的價值。
文檔編號C12N9/42GK101921723SQ20101026916
公開日2010年12月22日 申請日期2010年8月25日 優先權日2010年8月25日
發明者馮廣達, 朱紅惠, 王永紅, 羊宋貞, 陳美標, 黎志坤 申請人:廣東省微生物研究所