專利名稱：一種提高種子抗氧化能力及種質改良的方法
技術領域：
本發明涉及擬南芥種子儲藏蛋白基因2S albumin isoform 3 (At2S3)的啟動子與三個抗氧化基因重組提高種子抗氧化能力等種質改良中的應用，屬于分子生物學和生物技術領域。
背景技術：
作物種子是最基本的農業生產資料，是農業增產的內因，是各項技術措施的載體。 禾谷類如玉米種子，種胚大、呼吸旺盛、易發熱。胚部含脂肪多，易氧化酸敗。而且胚部帶菌量大，容易霉變。油料作物大豆種子吸濕性強，易喪失生活力，破損粒易生霉變質，導熱性差，大量蛋白質在高溫高濕條件下很容易老化變性。因此，種子貯藏是種子生產經營活動的重要環節，同時也是救災備荒的重要措施。如果管理不善，會使害蟲危害嚴重，導致種子的生活力降低，嚴重的會使種子霉爛，使農業生產受到很大損失。種子特異啟動子可以控制下游基因在植物種子中表達，避免外源基因在轉基因植株中非特異表達所造成的能量和物質浪費，從而減少對其他重要農藝性狀的不良影響。因此，利用種子特異啟動子控制外源基因在種子中特異表達具有重要的理論和經濟價值。本發明人從擬南芥中分離到種子貯藏蛋白2S albumin isoform 3的基因At2S3 的啟動子序列。進一步構建啟動子驅動的GUS報告基因、錳-超氧化物歧化酶基因MSD1， 過氧化氫酶基因CATl和維生素E生物合成中的關鍵酶尿黑酸植基轉移酶基因HPTl三個抗氧化基因的植物表達載體，轉化擬南芥。轉基因擬南芥在種子相關器官(包括成熟種子、果夾和幼苗子葉)中高效表達GUS基因和三個抗氧化酶基因。篩選抗氧化酶基因表達均最高的株系，分別進行雜交，篩選、獲得三價轉基因種子。三價轉基因種子內Y-維生素E(生育酚)含量比野生型提高45% ；在含10 μ M百草枯(MV)的培養基上萌發率比野生型提高 47%。該啟動子可用于植物的種子基因工程，改良種子的抗氧化脅迫能力和品質。
發明內容
本發明分離擬南芥種子特異基因At2S3的啟動子，連接到植物表達載體上，利用膿桿菌介導的花序浸染法轉化擬南芥，獲得的轉基因種子VE含量和抗氧化脅迫能力大大提尚。從擬南芥中通過PCR方法克隆得到At2S3啟動子，插入到表達載體pBI121中⑶S 基因的上游，轉化擬南芥。對轉基因植株進行GUS染色和熒光活性測定，證明該啟動子在種子相關器官中高效特異表達。從擬南芥葉片中提取總RNA，反轉錄成cDNA，通過PCR方法克隆得到編碼錳-超氧化物歧化酶基因MSDl，過氧化氫酶基因CATl和VE生物合成途徑中的尿黑酸植基轉移酶基因HPTl三個抗氧化酶基因。分別將三段基因序列插入到At2S3啟動子下游，轉化擬南芥。 對轉基因株系分別測定SOD和CAT酶活、Ve含量。選擇SOD和CAT活性最高的株系進行雜交，得到雙價轉基因植株，再Ve含量含量最高的At2S3 HPTl轉基因植物進行異花授粉，獲得三價轉基因植株。將單價、雙價和三價轉基因植株的種子進行氧化脅迫(MV)處理。與野生型相比，單價MSD轉基因植株、雙價和三價轉基因植株的抗氧化脅迫能力明顯增強。根據上述技術，從擬南芥中分離的At2S3啟動子驅動抗氧化基因單獨和整合過量表達能提高種子的抗氧化脅迫能力，有望延長種子的貯藏期。如果連接耐鹽或者抗旱基因可以提高種子出苗時的耐鹽和抗旱能力；如果連接種子品質相關基因則可以提高種子的品質改良，具有重要的經濟效益和社會效益。
圖1是野生型和轉基因種子內的生育酚含量。(a)野生型和轉基因株系(H3為例)的種子內生育酚組成及含量的高效液相色譜圖。(b)野生型和相應轉基因株系的種子內的生育酚含量。α、β、γ和δ是四種同分異構體。柱狀圖上方的不同字母表示在P <0.05時差異顯著。圖2是百草枯(MV)處理時野生型和轉基因擬南芥的種子萌發狀況(a)、(b)分別是在含10 μ M MV的MS培養基上所有基因型的種子萌發5天后的照片和每天的萌發率統計結果。胚根伸長> Imm時定義為種子萌發。標尺=1mm。圖中所示的At2S3: :MSD、At2S3: :CAT利At2S3: :HPT的值均是各基因型五個株系的平均值。圖3是百草枯(MV)處理時野生型和轉基因擬南芥的幼苗發育狀況(a)、(b)分別是在含1 μ M MV的MS培養基上所有基因型的種子萌發5天后的照片和幼苗成活率統計結果。幼苗成活率定義為長出綠色子葉的幼苗占所有萌發的種子的比例。標尺=1mm。圖中所示的At2S3: :MSD、At2S3: :CAT和At2S3: :HPT的值均是各基因型五個株系的平均值。圖4是NBT染色法檢測幼苗體內O2 ‘_含量(a)對正常生長5天的幼苗進行NBT染色。(b)用0. 5 μ M MV處理5日齡幼苗后進行NBT染色。CK是沒有進行NBT染色的對照。標尺=1mm。(五)具體發明實施方式實施例1 :At2S3啟動子的種子特異表達分析1.提取擬南芥葉片基因組DNA，利用特異引物通過PCR克隆獲得At2S3啟動子全長序列，1760bp。2.將At2S3啟動子插入到表達載體pBI121的⑶S基因上游，轉化農桿菌GV3101。3.農桿菌侵染液的配制將生長到靜止生長期(0D600 = 0. 8)的農桿菌，5000rpm 離心5min，上清保留做菌種，沉淀用5 %蔗糖溶液懸浮，侵染前再加0. 3-0. 5%。Silwet L-77。4.擬南芥的侵染將擬南芥花序整體浸入侵染液中，輕微振蕩6-Ssec，隨后迅速取出；全部擬南芥花序侵染完畢后，用塑料薄膜封閉保濕；將擬南芥轉至黑暗中保持12小時，轉至長日照條件下生長；對侵染過的擬南芥進行日常管理直至擬南芥種子成熟。5.轉基因擬南芥種子的篩選首先用70%乙醇+吐溫20消毒5min，然后用2. 6% 次氯酸鈉浸泡lOmin，隨后用無菌水沖洗5次，將消毒后的種子播撒到MS培養基上(含卡那霉素50mg/L)，于4°C放置3天，然后轉移到長日照條件下培養，從中可篩選到轉基因擬南芥植株。
6.轉基因擬南芥的⑶S組織化學染色分析將材料置于⑶S染色液(0. IM磷酸鈉緩沖液；IOmMEDTA ；0. 5mM 鐵氰化鉀；0. 5mM 亞鐵氰化鉀；ImM X-gluc ；0. 1% Triton X-100) 中，37°C染色，時間不超過12h ；用70%乙醇脫色，直至綠色褪去；鏡檢照相。7.轉基因擬南芥GUS表達的定量分析用GUS提取緩沖液提取材料中的蛋白質， 與⑶S反應液反應15min，然后加入終止液終止反應，在激發光365nm、發射光455nm條件下測各樣品的熒光。8.⑶S組織化學染色和熒光測定結果證明，At2S3啟動子能在種子相關器官中特異、高效表達。實施例2 :At2S3啟動子驅動抗氧化基因表達載體的構建1.提取擬南芥葉片總RNA，反轉錄成cDNA，用特異引物通過PCR分別擴增獲得 MSDl (700bp)、CATl (1504bp)和 HPTl (1197bp)片段。2.將得到的片段分別插入到At2S3啟動子下游，構建表達載體。3.構建好的表達載體轉化農桿菌GV3101。實施例3 轉基因擬南芥的獲得及抗氧化脅迫能力分析1.含不同載體的農桿菌分別侵染野生型擬南芥花序。2.對收獲的轉有不同載體的擬南芥種子分別進行篩選。3.得到的轉基因植株種子繼續在含卡那霉素的培養基上篩選，直到獲得純合體。4. RT-PCR和酶活性測定分別分析抗氧化基因在轉錄水平和酶活性水平的表達情況，然后從轉化At2S3: :MSD1和At2S3: :CAT1的植株中選擇表達水平最高的兩株 At2S3: :MSD1 (M7)和At2S3: :CAT1 (C9)，對其進行異花授粉，獲得雙價轉基因株系M7/C9。5.通過高效液相色譜測定轉化At2S3: :HPT1的各株系種子內VE含量，選擇其中含量最高的一株H3，與雙價轉基因株系M7/C9雜交，獲得三價轉基因株系M7/C9/H3。6.對轉基因植株的種子進行抗氧化脅迫能力測定在培養基中加入不同濃度的 MV,統計種子萌發率或幼苗成花率；通過NBT染色法分析正常條件下以及經MV處理后的幼苗體內02一含量。
權利要求
1.一種提高種子抗氧化能力及種質改良的方法，其特征在于At2S3啟動子能啟動GUS 報告基因在種子相關器官中高效特異表達，包括成熟種子、果夾和幼苗子葉。
2.一種提高種子抗氧化能力及種質改良的方法，其特征在于At2S3啟動子能驅動抗氧化基因錳-超氧化物歧化酶基因MSDl，過氧化氫酶基因CATl和維生素E生物合成中的關鍵酶尿黑酸植基轉移酶基因HPTl基因在種子中高效表達，顯著提高種子的維生素E含量和抗氧化脅迫能力。
3.一種提高種子抗氧化能力及種質改良的方法，其特征在于At2S3啟動子能驅動品質和抗逆基因在種子中表達，改良種子品質及種子萌發時的抗逆性。
全文摘要
本發明涉及一種提高種子抗氧化能力及種質改良的方法。應用種子特異啟動子At2S3與三個抗氧化基因的重組，提高種子抗氧化能力。At2S3基因的上游1760bp的啟動子序列分別融合GUS報告基因、錳-超氧化物歧化酶基因MSD1、過氧化氫酶基因CAT1和維生素E生物合成中的關鍵酶尿黑酸植基轉移酶基因HPT1，轉化擬南芥并進行株系雜交。結果表明GUS報告基因在種子中特異、高效表達；單價MSD1(M7)、雙價MSD1/CAT1(M7/C9)和三價MSD1/CAT1/HPT1(M7/C9/H3)轉基因擬南芥株系在10μM百草枯氧化脅迫處理時的種子萌發率及1μM百草枯氧化脅迫處理時的幼苗成活率均明顯高于野生型。因此，該啟動子是一個種子特異高效啟動子，與三個抗氧化基因的重組，對于種子貯藏期延長、種子品質和抗逆性狀改良，具有重要的經濟效益和社會效益。
文檔編號C12N15/113GK102250896SQ201010268450
公開日2011年11月23日 申請日期2010年8月30日 優先權日2010年8月30日
發明者吳長艾, 楊國棟, 鄭成超, 郗冬梅, 黃金光 申請人:山東農業大學