專利名稱：免疫磁珠分選人關節(jié)軟骨cd105+/cd166+間充質(zhì)干細胞的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種細胞分選方法，特別涉及免疫磁珠分選人關節(jié)軟骨CD105+/ CD166+間充質(zhì)干細胞的方法。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在維持組織損傷與修復的動態(tài)平 衡中起著至關重要的作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，正常人及原發(fā)性骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA) 患者的關節(jié)軟骨內(nèi)均存在間充質(zhì)干細胞。因此，建立適宜的分選方法并于適宜的分選時機 從正常人及原發(fā)性骨關節(jié)炎患者的關節(jié)軟骨細胞內(nèi)高效、簡便地分選出大量高純度、高活 性的間充質(zhì)干細胞，對滿足后續(xù)細胞生物學特性研究和醫(yī)學臨床細胞移植治療的需要具有 重要意義。免疫磁性細胞分選技術(shù)已有20余年的歷史，其中針對某一特異性干細胞表面標 志物的陽性分選(positive isolation)較其陰性分選(negative isolation)能得到更 高的目標細胞富集率。目前常用的免疫磁珠技術(shù)分選干細胞多為單陽性標志物分選或單 陽性+單陰性標志物分選。由于組織中干細胞的數(shù)量很少，各種表面標志物的陽性率不 一，雙陽性分選相對比較困難。目前研究認為，人類成體間充質(zhì)干細胞的表面標志物包括 CD13、CD29、CD44、CD49、CD51、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD102、CD105、CD106、CDwl 19、 CD120a、CD 120b, CD123、CD124、CD126、CD127、CD140a 和 CD166，而某一組織中的成體間 充質(zhì)干細胞并非所有上述標志物均同時陽性。因此，通常選擇其中一個或兩個標志物進 行成體間充質(zhì)干細胞的篩選及其多向分化能力的檢測，以確定其干細胞特性。CD105是 TGF-β III型受體，最早被稱為SH-2，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子- β (transforming growth factor-β, TGF-β)與其受體的結(jié)合而參與細胞信號傳導。⑶166又稱為白細胞活化黏附 因子(activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM)，是淋巴細胞抗原 CD6 的配 基，主要在白細胞和胸腺上皮細胞上表達。⑶105和⑶166作為間充質(zhì)干細胞的表面標志物 之一于近年研究中得到廣泛承認，并有研究認為⑶105和⑶166共表達可作為骨髓基質(zhì)干 細胞的表面標志物。Alsalameh 等(Arthritis Rheum, 2004, 50 1522-1532)和劉軍等(中 國組織工程研究與臨床康復，2008，12 (47) =9239-9242)分別采用CD105和CD166共表達作 為表面標志物進行關節(jié)軟骨間充質(zhì)干細胞分選及其多向誘導分化鑒定均獲得成功。但Alsalameh等和劉軍等采用的分選方法均為目前常用的免疫磁珠間斷分選法 即單標志分離_培養(yǎng)_單標志分離法，該方法存在分選效能較低、所需時間較長、操作較為 繁瑣等缺點。此外，用免疫磁性細胞分選技術(shù)高效分選目標細胞應選擇適宜的時機。但自 2003年Barbero等首次發(fā)現(xiàn)正常人及原發(fā)性骨關節(jié)炎患者的關節(jié)軟骨中含有能夠多向分 化的間充質(zhì)干細胞以來，從最早利用細胞克隆技術(shù)到近來使用免疫磁珠技術(shù)、流式細胞術(shù) 等分選關節(jié)軟骨間充質(zhì)干細胞，均未明確高效獲取純凈、足量關節(jié)軟骨間充質(zhì)干細胞的適 宜分選時機。
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于建立一種免疫磁珠分選人關節(jié)軟骨⑶105+/⑶166+ 間充質(zhì)干細胞的方法，具有高效、省時、簡便等優(yōu)點，可以容易地獲得高純度的人關節(jié)軟骨 間充質(zhì)干細胞，且細胞活性良好，能夠滿足后續(xù)細胞生物學特性研究和醫(yī)學臨床細胞移植 治療的需要。為達到上述目的，本發(fā)明的免疫磁珠分選人關節(jié)軟骨⑶105+/⑶166+間充質(zhì)干細 胞的方法，包括以下步驟①取正常人或原發(fā)性骨關節(jié)炎患者的關節(jié)軟骨細胞懸液，加入熒光素標記⑶166 抗體，混勻后于溫度2 6°C避光孵育35 55分鐘，再于2 6°C離心，棄上清液，用磷酸 鹽緩沖液即PBS洗滌并重懸，獲得⑶166+細胞-一抗復合物懸液；②向步驟①所得⑶166+細胞-一抗復合物懸液中加入抗熒光素免疫磁珠，混勻后 于2 6°C孵育20 40分鐘，再于2 6°C離心，棄上清液，用PBS洗滌并重懸，獲得⑶166+ 細胞-一抗-二抗-磁珠復合物懸液；③將LD分離柱置磁場中，用PBS洗柱后，加入步驟②所得⑶166+細胞-一抗-二 抗_磁珠復合物懸液，棄流出液，并用PBS洗柱；④從磁場中取出經(jīng)步驟③處理后的LD分離柱，用PBS沖洗，收集沖洗液，于2 6°C離心，棄上清液，用PBS洗滌并重懸，獲得純化的⑶166+細胞-一抗-二抗-磁珠復合 物懸液；⑤向步驟④所得純化的⑶166+細胞-一抗-二抗-磁珠復合物懸液中加入分離 試劑，于2 6°C孵育5 15分鐘中止抗原抗體反應，使⑶166+細胞與抗體和磁珠完全解 離，再于2 6°C離心，棄上清液，用PBS洗滌并重懸后，加入終止試劑并充分混勻，使分離試 劑喪失活性，獲得⑶166+細胞懸液；⑥向步驟⑤所得⑶166+細胞懸液中加入熒光素標記⑶105抗體，于2 6°C避光 孵育20 40分鐘，再于2 6°C離心，棄上清液，用PBS洗滌并重懸，獲得⑶105+/⑶166+ 細胞_ 一抗復合物懸液；⑦將步驟⑥所得⑶105+/⑶166+細胞-一抗復合物懸液重復步驟② ⑤的操作并 用MS分離柱替代LD分離柱，即得⑶105+/⑶166+間充質(zhì)干細胞懸液。進一步，所述關節(jié)軟骨細胞為原代或第4代培養(yǎng)關節(jié)軟骨細胞。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明從分選周期、分選后的細胞活度、⑶105+/⑶166+ 細胞百分比及收獲率四個方面，比較了本發(fā)明的免疫磁珠連續(xù)分選法與現(xiàn)有的免疫磁珠間 斷分選法從原發(fā)性骨關節(jié)炎患者第4代培養(yǎng)關節(jié)軟骨細胞中分選CD166+/CD105+細胞的 效能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的免疫磁珠連續(xù)分選法優(yōu)于現(xiàn)有的免疫磁珠間斷分選法，其具有高 效、省時、簡便等優(yōu)點，可以容易地獲得高純度的關節(jié)軟骨間充質(zhì)干細胞，且細胞活性良好， 能夠滿足后續(xù)細胞生物學特性研究和醫(yī)學臨床細胞移植治療的需要。此外，本發(fā)明還觀測 了原發(fā)性骨關節(jié)炎患者關節(jié)軟骨組織分離細胞及其原代和傳代培養(yǎng)細胞中CD105+/CD166+ 細胞百分比的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)關節(jié)軟骨組織分離細胞及其原代、第2代和第4代培養(yǎng)細胞 中的⑶105+/⑶166+細胞百分比逐步明顯提高，而第4代以后培養(yǎng)細胞中的⑶105+/⑶166+ 細胞百分比無顯著變化，由此明確了分選關節(jié)軟骨間充質(zhì)干細胞的適宜時機。
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進 一步的詳細描述，其中圖1為流式細胞術(shù)檢測原代培養(yǎng)關節(jié)軟骨細胞的體積分布(A)及⑶105+/⑶166+ 細胞百分比(B)；圖2為流式細胞術(shù)檢測第4代培養(yǎng)關節(jié)軟骨細胞的體積分布(A)及CD105+/CD 166+細胞百分比(B)；圖3為流式細胞術(shù)檢測第4代培養(yǎng)關節(jié)軟骨細胞分選后細胞的體積分布(A)及 CD105+/CD166+細胞百分比(B)；圖4為倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)第4天的第4代培養(yǎng)關節(jié)軟骨細胞(A)及其分選出的 CD105+/CD166+ 細胞(B)。
具體實施例方式
以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中采用的關節(jié)軟骨標本為中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī) 院關節(jié)外科中心施行原發(fā)性骨關節(jié)炎人工全膝關節(jié)置換術(shù)中切除、Markin病理分級1 2 級的全層關節(jié)軟骨標本5例，患者年齡50 65歲，平均年齡61. 0 士 6. 3歲，其中男3例，女 2例。標本獲取得到醫(yī)院倫理委員會批準，并經(jīng)患者本人知情同意。優(yōu)選實施例中采用的主要試劑及材料為透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶(Sigma公司)， II型膠原酶(Gibco公司)，胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone公司)，小鼠抗人⑶105 抗體、小鼠抗人CD166抗體(Ancell公司)，CD105-PE抗體、CD166-FITC抗體(Serotec 公司)，Dynabeads Pan Mouse IgG 二 石茲 _ (Invitrogen 公司)，CD105MicroBeads> Anti-FITC-Multisort 試劑盒[包括抗 FITC 磁珠(Anti-FITC MultiSort MicroBeads)、分 離試齊[J (MultiSort Release Reagent)禾口終止試齊[J (MultiSort Stop Reagent) ]、LD 分離 柱、MS分離柱(MiIitenyi公司)。優(yōu)選實施例中采用的主要儀器為miniMACS分選架(Militenyi公司)，CKX31型 倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)，YJ-1450凈化工作臺(蘇州凈化設備公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱 (Thermo公司)，低溫離心機(Beckman公司),EPICS AL TRA II型流式細胞儀(Beckman公 司)。優(yōu)選實施例中采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均值士標準差 ( ±》表示，計數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用t檢驗，檢驗水準α為雙側(cè)0.05，以P <0. 05為有統(tǒng)計學差異。一、人關節(jié)軟骨⑶105+/⑶166+間充質(zhì)干細胞適宜分選時機的確定按照文獻方法(周強等.三步酶消化法高效分離兔原代關節(jié)軟骨細胞及體外培 養(yǎng)觀察.中華外科雜志，2005，43 (8) 522-526)分離原發(fā)性骨關節(jié)炎患者的關節(jié)軟骨細胞 并進行體外培養(yǎng)。主要方法如下取關節(jié)軟骨標本，切剪成約Imm3碎塊，依次用濃度為Ig/ L的胰蛋白酶溶液、lg/L的透明質(zhì)酸酶溶液、2g/L的II型膠原酶溶液于37°C搖床中消化1 小時、1小時、3小時，最后用300目濾網(wǎng)過濾，洗滌，得關節(jié)軟骨組織分離細胞；所得關節(jié)軟骨組織分離細胞經(jīng)計數(shù)后，按3X IOVcm2接種于DMEM/F12培養(yǎng)基(含有體積分數(shù)為10% 的胎牛血清、濃度為100IU/ml的青霉素和100μ g/ml的鏈霉素)中，置溫度為37°0、0)2氣 體體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，接種72小時后首次換液，培養(yǎng)細胞至80%融合時(第 5天)，以質(zhì)量分數(shù)為0. 25%的胰蛋白酶溶液消化，收集培養(yǎng)細胞，得原代培養(yǎng)關節(jié)軟骨細 胞；所得原代培養(yǎng)關節(jié)軟骨細胞經(jīng)計數(shù)后，按照上述原代細胞培養(yǎng)方法以細胞比為1 2連 續(xù)傳代培養(yǎng)至第6代，得傳代培養(yǎng)關節(jié)軟骨細胞。分別取上述關節(jié)軟骨組織分離細胞及其原代和傳代培養(yǎng)細胞各5 X IO5個，用PBS 洗滌2次后加入PBS 100 μ 1重懸，再加入CD105-PE抗體和CD166-FITC抗體(1 μ g/106個 細胞，稀釋度為1 50)，4°C冰箱避光孵育30分鐘，用PBS洗滌2次后，用質(zhì)量分數(shù)為4%的 多聚甲醛溶液固定15分鐘，再于流式細胞儀上檢測不同培養(yǎng)階段關節(jié)軟骨細胞中CD105+/ ⑶166+細胞的百分比。結(jié)果見表1和圖1 3。表1不同培養(yǎng)階段關節(jié)軟骨細胞中CD105+/⑶166+細胞的百分比
權(quán)利要求
免疫磁珠分選人關節(jié)軟骨CD105+/CD166+間充質(zhì)干細胞的方法，其特征在于包括以下步驟①取正常人或原發(fā)性骨關節(jié)炎患者的關節(jié)軟骨細胞懸液，加入熒光素標記CD166抗體，混勻后于溫度2～6℃避光孵育35～55分鐘，再于2～6℃離心，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液即PBS洗滌并重懸，獲得CD166+細胞 一抗復合物懸液；②向步驟①所得CD166+細胞 一抗復合物懸液中加入抗熒光素免疫磁珠，混勻后于2～6℃孵育20～40分鐘，再于2～6℃離心，棄上清液，用PBS洗滌并重懸，獲得CD166+細胞 一抗 二抗 磁珠復合物懸液；③將LD分離柱置磁場中，用PBS洗柱后，加入步驟②所得CD166+細胞 一抗 二抗 磁珠復合物懸液，棄流出液，并用PBS洗柱；④從磁場中取出經(jīng)步驟③處理后的LD分離柱，用PBS沖洗，收集沖洗液，于2～6℃離心，棄上清液，用PBS洗滌并重懸，獲得純化的CD166+細胞 一抗 二抗 磁珠復合物懸液；⑤向步驟④所得純化的CD166+細胞 一抗 二抗 磁珠復合物懸液中加入分離試劑，于2～6℃孵育5～15分鐘中止抗原抗體反應，使CD166+細胞與抗體和磁珠完全解離，再于2～6℃離心，棄上清液，用PBS洗滌并重懸后，加入終止試劑并充分混勻，使分離試劑喪失活性，獲得CD166+細胞懸液；⑥向步驟⑤所得CD166+細胞懸液中加入熒光素標記CD105抗體，于2～6℃避光孵育20～40分鐘，再于2～6℃離心，棄上清液，用PBS洗滌并重懸，獲得CD 105+/CD166+細胞 一抗復合物懸液；⑦將步驟⑥所得CD105+/CD166+細胞 一抗復合物懸液重復步驟②～⑤的操作并用MS分離柱替代LD分離柱，即得CD105+/CD166+間充質(zhì)干細胞懸液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述免疫磁珠分選人關節(jié)軟骨CD105+/CD166+間充質(zhì)干細胞的方 法，其特征在于所述關節(jié)軟骨細胞為原代或第4代培養(yǎng)關節(jié)軟骨細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細胞分選方法，特別涉及免疫磁珠分選人關節(jié)軟骨CD105+/CD166+間充質(zhì)干細胞的方法，該方法為雙標志免疫磁珠連續(xù)分選法，與目前常用的單標志分離-培養(yǎng)-單標志分離的免疫磁珠間斷分選法相比，具有高效、省時、簡便等優(yōu)點，可以容易地獲得高純度的人關節(jié)軟骨間充質(zhì)干細胞，且細胞活性良好，能夠滿足后續(xù)細胞生物學特性研究和醫(yī)學臨床細胞移植治療的需要；此外，本發(fā)明還明確了分選人關節(jié)軟骨CD105+/CD166+間充質(zhì)干細胞的適宜時機。
文檔編號C12N5/0775GK101948802SQ201010268449
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者劉軍, 常紅星, 戴剛, 李忠, 楊柳, 陳光興 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院