專利名稱：基于過氧化氫的井岡霉素優化發酵方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物工程與技術領域的方法，具體是一種基于過氧化氫的井 岡霉素優化發酵方法。
背景技術：
在1970年日本武田株式會社農藥研發部門的Iwasa等人通過篩選對瘟枯病病原 菌絲核菌的抑制作用獲得了能夠產生抗水稻紋枯病代謝物的鏈霉菌菌株，經鑒定為吸水 Ι β^ τβ^ Ψ (Streptomyces hygroscopicus var. Iimoneus T—7545) 。ι^Ι^ Ι 了有效霉素的Α，B組分，并且較為系統的研究了該菌株的生長特性，并初步探索了生產抗 生素的條件。我國上海農藥所在1973年在井R山地區篩選到吸水鏈霉菌的一個亞種，研 究表明該菌能夠產生一種與有效霉素理化性質類似的新型抗生素，取名吸水鏈霉菌井岡 變種，并于1975年成功的開發了農藥制劑，我國獨立研發的這種抗生素被稱為井網霉素 (Jinggangmycin)。隨后的研究證明井網霉素與有效霉素具有相同的組分和化學性質。有效霉素并非一個單一組分，1988年報道了有效霉素Α，B, C，D，Ε，F等組分的結 構，隨后又報道了 G和H，他們都是在相同的骨架結構上進行的一系列衍生，其中A組分的抗 菌活性最強，Α，B兩個組分占全部同系物的79%以上。井R霉素自發現以來，國內外對井R霉素的菌種選育，培養基優化，發酵條件調 控，分離純化以及制劑研究等方面都做了大量的卓有成效的研究。隨后經過20多年的不斷 選育和優化，工業產量不斷提高。通過菌種選育可以大幅度的提高抗生素的產量，井R霉素 產生菌同樣也表現出了巨大的增產潛力。從1973年產有效霉素出發菌的數百單位的產量， 經過一年的篩選便達到了 1萬個單位。30年來通過各種方法不斷進行的選育，目前的有效 霉素高產菌株發酵穩定在2萬單位效價左右。發酵培養基也是影響抗生物生產的重要因 素，在國內利用吸水鏈霉菌井網變種生產有效霉素的研究與實踐中，科研人員逐步探索出 了一系列經過優化的高產培養基。發酵溫度會直接或間接影響培養細胞的生理生化，從而 最終影響發酵目標產物的生產量。我們研究發現在高溫發酵條件下會在發酵前期帶來快速 的蛋白合成，快速的糖消耗，快速的PH上升，而這三者恰好與最快速的有效霉素產生階段 相互重合。這說明高溫發酵對細胞的整個代謝造成了全局性的影響，其中包括對有效霉素 合成的巨大提高。細胞在收到氧化壓力刺激下，會產生大量的活性氧，活性氧可作為信號分子進一 步激活下游基因的轉錄，從而調節了細胞的多個過程。在植物細胞中已報道通過各種方法 刺激活性氧的產生，活性氧作為信號分子促進了代謝產物的大量合成。微生物細胞也可通 過以下壓力相應的sigma因子調節相應的基因表達，從而促進次級代謝產物的合成。而在 氧化壓力下，細胞還可以改變其代謝流的流向，使代謝流由糖酵解途徑流向戊糖磷酸途徑。 而井R霉素合成的前體7-磷酸景天庚酮糖正是戊糖磷酸途徑中的中間代謝物。因此，我們 通過外源添加過氧化氫策略的優化提高了井R霉素的產量。經過對現有技術的檢索發現，在野油菜黃單孢菌中次氯酸的添加誘導了活性氧的產生對黃原膠的產量起到了促進作用，黃原膠產率有210%的提高，總產量也有20%以上 的提高。目前該技術尚未見其應用到井R霉素發酵生產過程。吸水鏈霉菌5008是一株有 潛力的井R霉素生產菌株，但目前其產量還較低，發酵周期較長。經過42攝氏度的高溫發 酵，雖然其產量有一定提高，但高溫必然帶來大的能量消耗。如何在較低溫度下進一步提高 井岡霉素發酵產量以及縮短其發酵周期是一個亟待解決的問題。
發明內容
本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種基于過氧化氫的井R霉素優化發 酵方法，通過過氧化氫添加時間和濃度的優化，使井R霉素發酵產量提高40%左右，同時發 酵周期也縮短一天，提高了設備利用率，降低了能耗。此方法應用到調節基因突變的菌株 中，也可提高突變株的井R霉素產量。本發明為提高井R霉素產量提供了一種簡便有效的 方法，為在工業生產中的應用提供基礎。本發明是通過以下技術方案實現的，本發明通過在吸水鏈霉菌井R變種孢子的發 酵培養階段滴加過氧化氫溶液實現產量優化。所述的吸水鏈霉菌井R變種孢子是指取吸水鏈霉菌井R變種孢子的懸液劃線平 板在37攝氏度環境下培養5天；所述的孢子懸液為零下20攝氏度保存的吸水鏈霉菌井R變種孢子懸液所述的發酵培養階段是指將吸水鏈霉菌井R變種孢子接種于發酵培養液中并在 30攝氏度、220轉速度下旋轉培養24小時后發酵培養5天；所述的接種是指以種子液發酵培養液為1 10 (ν/ν)的比例接種培養，所述的滴加過氧化氫溶液是指將質量百分比為30%的過氧化氫稀釋到ImM并過 濾除菌后在發酵培養過程的8-24小時時間段內滴加至濃度達到50微摩爾/升。經上述方法優化發酵得到的井R霉素產量提高達30%以上，并且井R霉素的最高 濃度提前到了第四天，與對照組相比提前了一天。
圖1為過氧化氫添加時間對井岡霉素產量的影響示意圖。圖2為過氧化氫添加濃度對井R霉素產量的影響示意圖。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施 例。實施例1實驗材料采用的菌種吸水鏈霉菌井岡變種(Sti^ptomyces hygroscopicus var jingganggensis5008)(菌種保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌種編號 CGMCC4. 1026)實驗步驟
(1)菌種活化與平板培養取凍存的甘油孢子懸液用接種環在黃豆餅粉甘露醇固體 培養基平板上劃線，接種后37°C活化5天，待孢子鋪滿整個平板后備用。培養基配方為每升 培養基中含黃豆餅粉20g、甘露醇20g以及瓊脂粉20g。(2)種子培養將活化后的菌種用接種環挑出一環接種到種子培養基中，30°C，220rpm培養24小 時。種子培養成份為玉米粉3%、黃豆餅粉1. 1%、酵母粉0. 5%、氯化鈉0. 2%、磷酸二氫鉀 0. 08%，裝液量 50mL。(3)發酵培養將30°C培養24小時的種子取5mL接種到裝有50mL的發酵培養基的250mL的搖 瓶中，于37°C培養220rpm培養5天。發酵培養基成分為玉米粉9%、黃豆餅粉4%、酵母粉 1%、氯化鈉0. 1%、磷酸二氫鉀0. 1%。在培養基配制前將不銹鋼彈簧卷曲呈環狀，置于搖 瓶底部。(4)過氧化氫添加時間的優化將30%的過氧化氫稀釋到ImM，過濾除菌。分別在 發酵0，8和24小時添加1. 25mL到發酵搖瓶中使其終濃度為50微摩爾。(5)樣品處理及檢測方法將取好的ImL發酵液SOOOrpm離心5分鐘，上清液用于 殘糖和井R霉素產量的分析，殘糖用濃硫酸_苯酚法測定，井R霉素產量用HPLC方法測定， 取0. 5mL樣品加入ImL氯仿充分振蕩使蛋白沉淀，12000rpm離心5分鐘，吸取上層水相，稀 釋5倍，用一次性濾膜過濾后用C18反相柱檢測，測定條件為流動相為0. 005摩爾的pH7. 0 的磷酸鹽緩沖液與甲醇比例98. 5 1. 5，流速lml/min，檢測波長210nm。(6)結果表明，不同時間添加過氧化氫后井R霉素產量均有提高，當在第8h添加 時效果最好，與對照相比有35%左右的提高。實施例2采用的菌種同實施例1菌種活化及種子培養同實施例1發酵培養同實施例1過氧化氫添加時間的優化將30%的過氧化氫分別稀釋到0. 4mM, ImM, 2mM,過濾 除菌。分別加1. 25mL到發酵8小時后的50mL的搖瓶中，使其終濃度為10、25以及50 μ Μ。樣品處理及檢測方法同實施例1結果表明當不同濃的過氧化氫添加后井R霉素產量與對照相比均有較大提高，當 過氧化氫添加濃度為25 μ M時效果最好井R霉素產量有37%左右的提高。實施例3采用的菌種吸水鏈霉菌井岡變種(Sti^ptomyces hygroscopicus var jingganggensis 5008)及其調節基因valPQ缺失及回補菌株。valPQ是井岡霉素合成基因 簇中的調節基因，當它缺失后井R霉素產量與對照相比會有所提高。本發明通過在該突變 株中添加過氧化氫，以期望進一步提高井R霉素的產量。菌種活化及種子培養同實施例1發酵培養同實施例1過氧化氫的添加將30%的過氧化氫稀釋到ImM，過濾除菌。在發酵8小時分別添 加1. 25mL到吸水鏈霉菌井R變種野生菌株及valPQ缺失突變及回補菌株中，使其終濃度為25微摩爾。樣品處理及檢測方法同實施例1 (結果見表1)。結果如表1所示在野生型菌株中井網霉素產量有近40%的提高，在valPQ缺失 突變株中井R霉素產量又會有21%的提高。表1 在吸水鏈霉菌井R變種5008野生型及valPQ缺失突變及回補突變菌株中添
加過氧化氫對井R霉素合成的影響。
權利要求
一種基于過氧化氫的井岡霉素優化發酵方法，其特征在于，通過在吸水鏈霉菌井岡變種孢子的發酵培養階段滴加過氧化氫溶液實現產量優化。
2.根據權利要求1所述的基于過氧化氫的井R霉素優化發酵方法，其特征是，所述的 吸水鏈霉菌井R變種孢子是指取吸水鏈霉菌井R變種孢子的懸液劃線平板在37攝氏度 環境下培養5天。
3.根據權利要求2所述的基于過氧化氫的井R霉素優化發酵方法，其特征是，所述的 孢子懸液為零下20攝氏度保存的吸水鏈霉菌井R變種孢子懸液。
4.根據權利要求1所述的基于過氧化氫的井R霉素優化發酵方法，其特征是，所述的 發酵培養階段是指將吸水鏈霉菌井R變種孢子接種于發酵培養液中并在30攝氏度、220 轉速度下旋轉培養24小時后發酵培養5天。
5.根據權利要求1所述的基于過氧化氫的井R霉素優化發酵方法，其特征是，所述的 接種是指以種子液發酵培養液為1 ο (ν/ν)的比例接種培養。
6.根據權利要求1所述的基于過氧化氫的井R霉素優化發酵方法，其特征是，所述的 滴加過氧化氫溶液是指將質量百分比為30%的過氧化氫稀釋到ImM并過濾除菌后在發酵 培養過程的8-24小時時間段內滴加至濃度達到50微摩爾/升。
全文摘要
一種生物工程技術領域的基于過氧化氫的井岡霉素優化發酵方法，通過在吸水鏈霉菌井岡變種孢子的發酵培養階段滴加過氧化氫溶液實現產量優化。本發明通過過氧化氫添加時間和濃度的優化使井岡霉素發酵產量提高40％左右，同時發酵周期也縮短一天，提高了設備利用率，降低了能耗。
文檔編號C12P19/46GK101914600SQ201010264100
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月27日 優先權日2010年8月27日
發明者白林泉, 鄧子新, 鐘建江, 魏振華 申請人:上海交通大學