專利名稱：：一種抗重金屬汞離子抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗重金屬汞離子抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近年來，重金屬污染事件層出不窮、愈演愈烈，人類賴以生存的空氣、土壤、蔬菜和動物均受到了重金屬等毒物的污染。環(huán)境污染和飼料藥物添加劑的濫用，造成畜禽產(chǎn)品重金屬殘留不同程度超標(biāo)(逄瑞玥.我國畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全存在的問題及應(yīng)對策略.黑龍江糧食，2007，(4):20-22)。作物中積累的重金屬離子通過食物鏈的生物放大作用進(jìn)入人畜體內(nèi)，威脅人畜健康(郎明林，張玉秀，柴團(tuán)耀.基因工程改良植物重金屬抗性與富集能力的研究進(jìn)展.生物工程學(xué)報，2004，20(2)157-164)0汞是蓄積作用較強(qiáng)的元素，主要在動物體內(nèi)蓄積。湖泊、沼澤中的水生植物、水產(chǎn)品易蓄積大量的汞。后期，農(nóng)業(yè)上使用含汞殺螨劑以來，汞對土壤、自然水系和大氣的污染日益嚴(yán)重。汞污染在世界的某些地方，已成為大眾健康的公害(梅光泉.重金屬廢水的危害及治理.微量元素與健康研究，2004，21(4)54-56)?？焖凫`敏地檢測食物中的重金屬含量是保障食品安全的基礎(chǔ)，傳統(tǒng)檢測重金屬殘留的分析方法包括原子吸收光譜分析(AtomicAbsorptionSpectroscopy,AAS)和電感華禹合等離子發(fā)身寸光譜(InductivelyCoupledPlasmaAtomicEmissionSpectroscopy,ICP-AES)^^^njHW(BontideanI，LloydJR,HobmanJL,etal.Bacterialmetal-resistanceproteinsandtheiruseinbiosensorsforthedetectionofbioavailableheavymetals.JInorgBiochemy，2000，79(1-4)-.225-229.)0但昂貴的儀器、專業(yè)的分析人員及復(fù)雜的樣品前處理限制了這些方法的應(yīng)用。檢測必須在具備大型分析儀器的重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，無法用于現(xiàn)場檢測，而且受到費(fèi)用高、處理量有限和檢測時間長等限制(劉功良，王菊芳.重金屬離子的免疫檢測研究進(jìn)展.生物工程學(xué)報，2006，22(6):877-881)。傳統(tǒng)的重金屬檢測方法不適合蔬菜、水果等保鮮期短、利潤低和需大通量檢測的樣品。對重金屬的常規(guī)性檢測方法已經(jīng)有很多種，有些也已經(jīng)是非常成熟的技術(shù)，但因?yàn)橹亟饘匐x子存在的范圍很廣，根據(jù)檢測精度、方便程度和檢測成本，每種技術(shù)都有它們的局限性，同時還需合適的場所，因此都不利于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。建立更快速、更經(jīng)濟(jì)的免疫分析法檢測汞離子是生產(chǎn)及經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種抗重金屬汞離子抗體及其應(yīng)用本發(fā)明提供的抗重金屬汞離子抗體為雜交瘤細(xì)胞株H2H5CCTCCN2.C200948分泌的單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞株H2H5CCTCCNs.C200948也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍，已于2009年7月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為湖北省武漢市武漢大學(xué))，保藏登記號為CCTCCNa·C200948。雜交瘤細(xì)胞株H2H5CCTCCN2.C200948或其分泌的單克隆抗體在汞離子免疫檢測中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株H2H5CCTCCN2.C200948分泌的單克隆抗體為特異性單克隆抗體。其制備過程因Hg2+離子太小以至于不能引起免疫反應(yīng)，所以用螯合劑(二乙烯三胺五乙酸，DTPA)將金屬離子與載體蛋白(匙孔血藍(lán)蛋白，KLH)連接起來。成功合成、鑒定汞復(fù)合物抗原后，免疫BALB/c小鼠，通過細(xì)胞融合獲得了穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。用極限稀釋法亞克隆，通過ELISA篩選，最終獲得了穩(wěn)定分泌抗汞離子抗體的細(xì)胞株(H2H5)。小鼠腹腔注射1X107H2H5細(xì)胞株制備腹水，腹水抗體效價在151200以上。經(jīng)鑒定雜交瘤為IgGl亞類，輕鏈為kappa型且分泌抗體穩(wěn)定性較好。雜交瘤細(xì)胞株H2H5CCTCCNo.C200948分泌的單克隆抗體為汞離子殘留免疫學(xué)檢測方法的建立提供了技術(shù)基礎(chǔ)，對提高風(fēng)險評估工作的效率和質(zhì)量，保障食品安全有重要現(xiàn)實(shí)意義。本發(fā)明的金屬汞離子螯合物的單克隆抗體的獲得，為汞離子殘留免疫學(xué)檢測方法的建立打下了基礎(chǔ)。可以利用上述單克隆抗體，研究和建立重金屬的免疫學(xué)檢測方法。并利用其快速、廉價、靈敏和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，發(fā)展便于現(xiàn)場檢測的便攜方法，從而適用于農(nóng)畜產(chǎn)品的抽樣檢測及進(jìn)出口通關(guān)的快速檢驗(yàn)。對提高風(fēng)險評估工作的效率和質(zhì)量，保障食品安全有重要現(xiàn)實(shí)意義。圖1為小鼠五免后的差異率；圖2為陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選圖3為H2H5第二次克隆后細(xì)胞上清抗體效價圖4為雜交瘤H2H5染色體核型的鑒定圖5為H2H5腹水型單克隆抗體的檢測圖6為和H2H5分泌抗體亞型圖7為H2H5分泌抗體的穩(wěn)定性具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、分泌抗重金屬汞離子抗體的雜交瘤的制備及鑒定一、分泌抗重金屬汞離子抗體的雜交瘤的制備1、抗原的制備與鑒定Hg-DTPA-KLH稱取5.65mg二乙烯三胺五乙酸(DTPA)加入ImLpH9.73的HEPES緩沖液中形成A液，轉(zhuǎn)入反應(yīng)器，再加入濃度為3.46mol/L的Hg(NO3)2IOμL，室溫下反應(yīng)30min后同時加入0.4mLpH9.73的HEPES緩沖液和1.7mL濃度為5.9g/L的匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)，調(diào)節(jié)pH至9.0，室溫下攪拌反應(yīng)12h。偶聯(lián)反應(yīng)后，用預(yù)處理的CentriconYM-30超濾管對蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行分離純化，除去沒有參與反應(yīng)的Hg2+、螯合劑DTPA和Hg-DTPA復(fù)合物。Hg-DTPA-OVA的合成方法同上，用雞卵白蛋白(OVA(ovalbumin)替代匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)，DTPA-OVA的合成方法同上用超純水代替金屬離子即可。超濾后用BCA試劑盒測定復(fù)合物蛋白濃度(RobertC.BlakeII，Andrey4R.Pavlov,MehrabanKhosraviani,etal.Blake.NovelMonoclonalAntibodieswithSpecificityforChelatedUranium(VI)!IsolationandBindingProperties.BioconjugateChem，2004，15(5):1125_1136)。參照國標(biāo)GB/T17141-1997，用石墨爐原子吸收光譜法檢測超濾后的上清，濾過液及HEPES液中Hg2+濃度(KhosravianiΜ,PavlovAR,FlowersGC,etal.Detectionofheavymetalsbyimmunoassay!optimizationandvalidationofarapid,portableassayforioniccadmium.EnvironSciTtechnoy,1998,32(1)137-142)。結(jié)果表明，超濾后用BCA試劑盒測定蛋白濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，據(jù)公式y(tǒng)=0.0008X+0.0065(R2=0.9995)y表示0D57(1，χ表示蛋白濃度(mg/L)計算出上清中完全抗原Hg-DTPA-KLH蛋白濃度為4.615g/L，濾過液中蛋白濃度為0.Olg/L。用石墨爐原子吸收光譜法檢測Hg2+結(jié)果Hg-DTPA-KLH，DTPA-KLH，HEPES溶液中汞離子的溶度分別為208mg/Kg，Omg/Kg,Omg/Kg。如果抗原未合成成功，游離的Hg2+或Hg-DTPA會隨著超濾而被過濾掉，超濾后的上清中不會含有Hg2+，而我們從超濾后的上清中檢測出了Hg2+且含量較高，證明抗原合成成功。2、小鼠的免疫及融合小鼠的選擇小鼠的免疫免疫BALB/c小鼠(購于中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心)五只，首免時，免疫抗原與等體積的弗氏完全佐劑充分混勻后乳化Ih2h(PalmariniΜ,MurgiaC,FanH.SplicedandprematurelypolyadenylatedJaagsiektesheepretrovirus(JSRV)-specificRNAsfrominfectedortransfectedcells.Virology,2002，294(1):180-188)，每只BABL/c小鼠皮下多點(diǎn)注射200μg抗原。三周后第二次免疫，相同劑量抗原與等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化后免疫，以后每隔兩周免疫一次，方法同第二次免疫。第三次免疫及以后每次免疫后7d，尾靜脈采血，分離血清，測定血清的效價和產(chǎn)生抗體的特異性。融合小鼠的選擇用間接ELISA法選擇融合小鼠，方法如下①包被用HBS(10mmol/L,pH7.4)分別稀釋Hg-DTPA-OVA和DTPA-0VA，并以相同的濃度5mg/L分別包被到96孔酶標(biāo)板上，50μL/孔，4°C過夜或37°C孵化2h；②封閉:PBST(1LPBST組分=NaCl8g,KCl0.2g,NaHPO412H203.63g,KH2PO4O.24g,Tween20500μL，pH7.3)洗滌5次，拍干，按100μL/孔加3%BSA,37°C封閉Ih；③一抗一抗=PBST洗滌5次，分別加入相同稀釋比的上述五次免疫后的小鼠血清，以未免疫BALB/c小鼠(購于中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心)的血清作陰性對照，50μL/孔，37°C孵化Ih;④酶標(biāo)二抗洗滌同步驟③，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG/IgM(混合物)15000稀釋后，50yL/孔，37°C孵育Ih；⑤顯色洗滌同上，加入顯色液TMB，50μL/孔，37°C孵育15min；⑥終止反應(yīng)按50μL/孔加IN鹽酸終止反應(yīng)；⑦酶標(biāo)儀上測OD450值，以空白孔調(diào)零。按公式計算差異率Differnce(OD450ofHg-DTPA-OVA-OD45tlofDTPA-0VA)/OD450ofDTPA-0VAX100%。結(jié)果如圖1所示，五免后檢測小鼠血清中抗體效價后，計算各小鼠的差異率的結(jié)果顯示1號小鼠差異率最高。幾只小鼠同時產(chǎn)生了抗DTPA和Hg-DTPA的抗體，但是1號小鼠抗Hg-DTPA的抗體水平最高且差異率最大，說明1號小鼠產(chǎn)生針對Hg2+的抗體特異性最強(qiáng)，所以選1號小鼠用于融合(圖1)。3、細(xì)胞融合、陽性融合孔的篩選及陽性融合細(xì)胞的克隆選擇步驟2所述的1號小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，融合前3d加強(qiáng)免疫小鼠。融合前Id制備飼養(yǎng)細(xì)胞(BABL/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞)，將細(xì)胞濃度調(diào)至1X105/mL,按0.ImL/孔加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，備用。取強(qiáng)免疫1號小鼠脾細(xì)胞及處于對數(shù)生長期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所)以61細(xì)胞數(shù)量比混合，用50%(質(zhì)量百分含量)PEG1450研究所贈送(美國sigma公司購買)溶液介導(dǎo)融合，將融合后的細(xì)胞加入到含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板中，0.ImL/孔，37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)(李鳳奎，王純耀主編.實(shí)驗(yàn)動物與動物實(shí)驗(yàn)方法學(xué).鄭州鄭州大學(xué)出版社.2007377)。待細(xì)胞長滿孔底的1/3后，用間接ELISA法檢測融合孔上清，方法同步驟2中的融合小鼠的選擇，一抗是細(xì)胞上清，用未融合孔做陰性對照。用極限稀釋法克隆陽性細(xì)胞，細(xì)胞上清的檢測方法同陽性融合孔的篩選。陽性融合孔的篩選的結(jié)果表明，10天后96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中長出肉眼可見的雜交瘤細(xì)胞團(tuán)，待細(xì)胞長滿孔底的1/3取細(xì)胞上清檢測抗體效價，結(jié)果顯示雜交瘤H2H5、3D12、H1H8、2A11抗體效價都大于陰性對照的2.1倍，判定為陽性雜交瘤，且H2H5的差異率比2A1U3D12的差異率大四株細(xì)胞上清與Hg-DTPA-OVA反應(yīng)OD45tl值均高于與DTPA-OVA反應(yīng)OD450值，其中H2H5差異較大(圖2)，說明這兩株細(xì)胞分泌的抗體針對Hg2+離子的特異性較強(qiáng)，H2H5進(jìn)行亞克隆。4、陽性融合細(xì)胞的亞克隆化H2H5經(jīng)過兩次亞克隆化后細(xì)胞分泌的抗體的效價有所升高，獲得穩(wěn)定的分泌抗Hg2+單克隆抗體的細(xì)胞株，說明亞克隆較成功，還可以看出H2H5分泌的抗體對金屬Hg2+的特異性較H1H8的強(qiáng)(圖3)。H2H5已于2009年7月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為湖北省武漢市武漢大學(xué))，H2H5保藏登記號為CCTCCNa.C200948。二、分泌抗重金屬汞離子抗體的雜交瘤的鑒定1、雜交瘤染色體核型的鑒定參照文獻(xiàn)(司徒鎮(zhèn)強(qiáng)主編.細(xì)胞培養(yǎng).西安世界圖書出版社.2007242)所述的方法進(jìn)行雜交瘤染色體核型的鑒定，具體方法為取對數(shù)生長期雜交瘤細(xì)胞株H2H5用終濃度為0.05mg/L0.lmg/L的秋水仙素處理4h6h，收集細(xì)胞后用低滲KCL溶液處理30min,固定液固定，滴加細(xì)胞懸液到4°C預(yù)冷的載玻片上，室溫自然干燥，Giemsa染色，經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察，挑選細(xì)胞形態(tài)完整染色體分散均勻的細(xì)胞計數(shù)。每株計數(shù)5個細(xì)胞，記錄染色體數(shù)目并算出平均值。雜交瘤細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果表明，SP2/0細(xì)胞的染色體數(shù)目平均為68條，脾細(xì)胞染色體數(shù)目平均為40條，而雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目均在100以上(圖4)，高于兩親本細(xì)胞的染色體數(shù)目，說明這兩株雜交瘤細(xì)胞是SP2/0細(xì)胞和脾細(xì)胞的雜交產(chǎn)物。2、腹水型單克隆抗體的制備取8周齡10周齡的雌性BABL/c小鼠，腹腔注射石蠟油0.5mL/只，1周2周后分別腹腔注射ιχIO6個雜交瘤H2H5和HIH8，接種細(xì)胞7dIOd后密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，抽取腹水。室溫放置30min后，4°C放置1.5h2h后12000r/min，離心2min，取上清-20°C保存?zhèn)錂z。梯度稀釋腹水型抗體后檢測小鼠腹水效價，檢測方法同步驟一種的步驟2所述的融合小鼠的選擇，一抗是稀釋后的腹水。取得細(xì)胞株H2H5腹水型抗體后檢測得出H2H5的效價大于151200(圖5)。3、抗汞離子抗體亞型的鑒定取出正在培養(yǎng)的雜交瘤H2H5和HIH8細(xì)胞上清，按150稀釋后，按照鼠單抗亞型鑒定試劑盒ISOStripTMMonoclonalAntibodyIsotypingKit說明書操作，取稀釋液0.15mL加入試劑盒小管中，室溫放置lmin。待其自然溶解后，輕輕混勻。然后將試劑條插到小管底部，大約5min后，當(dāng)最前端條帶在兩對“+”中間出現(xiàn)時，即可見與雜交瘤細(xì)胞株所分泌的抗體亞類和輕鏈類型對應(yīng)的指示條帶所在位置，從而確定抗體亞型。結(jié)果表明，當(dāng)最前端條帶出現(xiàn)在兩對“+”中間時，抗體亞類和輕鏈指示條帶分別在Gl,k位置，即細(xì)胞株H2H5所分泌的抗體為IgGl亞類，輕鏈為kappa型(圖6)。4、雜交瘤分泌抗體穩(wěn)定性的測定將雜交瘤細(xì)胞株凍存后，過一段時間再復(fù)蘇并且連續(xù)培養(yǎng)后測抗體效價。檢測方法同步驟一的步驟3中陽性融合孔的篩選，用Hg-DTPA-OVA包被酶標(biāo)板，二抗用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG。經(jīng)檢測顯示細(xì)胞株H2H5分泌抗金屬Hg2+單克隆抗體的水平未見明顯下降(圖7)，表明抗體的穩(wěn)定性較好，同時可證明亞克隆較成功。效價稍有波動，可能是由于取細(xì)胞上清備檢時間間隔不同以及每次檢測之間的誤差所致，屬正常。三、討論由于Hg2+能與動物體內(nèi)生物分子發(fā)生強(qiáng)烈的不可逆的反應(yīng)，導(dǎo)致動物中毒，因此，可利用特異性的雙功能螯合劑DTPA螯合Hg2+，形成能被動物免疫系統(tǒng)識別的螯合物，但這些重金屬復(fù)合物是分子量低于IkD的半抗原，免疫原性低，不足以引起免疫反應(yīng)(YuHN,JonesRM,BlakeDA.Animmunosensorforautonomousin-linedetectionofheavymetalsvalidation.IntJEnvironAnalChem，2005，85(12-13):817_830)。DTPA除了能螯合金屬離子之外，還能與載體蛋白偶聯(lián)，可以成功制備重金屬汞的包被抗原和免疫抗原(DarwishIA,BlakeDA.One-stepcompetitiveimmunoassayforcadmiumionsdevelopmentandvalidationforenviromentalwatersamples.AnalChem,2001,73(8)1889-1895；DarwishIA,BlakeDA.Developmentandvalidationofaone-stepimmunoassayfordeterminationofcadmiuminhumanserum.AnalChem,2002,74(1)52-58)。有多種蛋白質(zhì)如KLH、BSA、0VA等能作為載體蛋白，但從誘發(fā)免疫應(yīng)答的角度來看，KLH的免疫原性優(yōu)于BSA、OVA等，因此本研究用KLH作為載體蛋白來免疫小鼠以期產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。重金屬Hg2+單克隆抗體制備的關(guān)鍵在于重金屬免疫原的制備，所以對免疫原鑒定后再免疫小鼠是成功得到重金屬單克隆抗體的保證。本研究先用BCA法測定了超濾后上清中的重金屬復(fù)合物蛋白濃度，然后用石墨爐原子吸收光譜法檢測其中的Hg2+含量，這為之后重金屬Hg2+的單克隆抗體的成功制備提供了可靠的保證。本研究根據(jù)差異率(Differenced)篩選融合所用小鼠，Differenced越大，說明產(chǎn)生針對Hg2+的抗體特異性越強(qiáng)，融合篩選得到陽性雜交瘤細(xì)胞的幾率就越大。本研究成功獲得了抗重金屬Hg2+或Hg-DTPA的單克隆抗體，目前正在純化抗體并對抗體的各項(xiàng)性能進(jìn)行鑒定。該工作的完成為其它抗重金屬抗體的制備提供了可行的方法，也為重金屬免疫檢測方法的建立及應(yīng)用(如ELISA方法、免疫膠體金快速診斷法(陳鳳梅，李娟，曲原君，等.免疫膠體金的研究進(jìn)展及應(yīng)用.中國獸藥雜志，2004，38(8)33-35)等)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明所獲得的抗體，可用于免疫學(xué)檢測技術(shù)檢測重金屬，具有檢測速度快、費(fèi)用低廉、儀器簡單易攜、靈敏度高和選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于現(xiàn)場對重金屬進(jìn)行靈敏、準(zhǔn)確、實(shí)時、快速的檢驗(yàn)分析。免疫分析技術(shù)引起人們越來越多的關(guān)注，這也是免疫分析技術(shù)發(fā)展的必然趨勢，也是成本低工業(yè)化生產(chǎn)所要求的。權(quán)利要求雜交瘤細(xì)胞株H2H5CCTCC№.C200948。2.雜交瘤細(xì)胞株H2H5CCTCCNs.C200948分泌的單克隆抗體。3.雜交瘤細(xì)胞株H2H5CCTCCN2.C200948或其分泌的單克隆抗體在汞離子免疫檢測中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種抗重金屬汞離子抗體及其應(yīng)用。該抗重金屬汞離子抗體為雜交瘤細(xì)胞株H2H5CCTCC№.C200948分泌的單克隆抗體。本發(fā)明的金屬汞離子螯合物的單克隆抗體的獲得，為汞離子殘留免疫學(xué)檢測方法的建立打下了基礎(chǔ)?？梢岳蒙鲜鰡慰寺】贵w，研究和建立重金屬的免疫學(xué)檢測方法。并利用其快速、廉價、靈敏和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，發(fā)展便于現(xiàn)場檢測的便攜方法，從而適用于農(nóng)畜產(chǎn)品的抽樣檢測及進(jìn)出口通關(guān)的快速檢驗(yàn)。對提高風(fēng)險評估工作的效率和質(zhì)量，保障食品安全有重要現(xiàn)實(shí)意義。文檔編號C12N5/20GK101948807SQ20101026132公開日2011年1月19日申請日期2010年8月24日優(yōu)先權(quán)日2010年8月24日發(fā)明者李霞,楊慧,趙麗申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院