專利名稱：可利用甲烷的金黃桿菌及用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于環境生物技術領域，具體的說涉及一種可利用甲烷的金黃桿菌以及應用。
背景技術：
甲烷氧化菌是一種特殊的、以甲烷為唯一碳源和能源的甲基營養型微生物，分布 范圍很廣，在酸、堿、鹽、高溫、低溫、貧瘠等很多環境下都發現甲烷氧化菌存在。其特殊的代 謝過程和代謝產物對全球環境具有重大影響，已經引起廣泛的關注。甲烷氧化菌不僅在全 球甲烷消耗中起重要作用，而且在碳、氮、氧循環中也發揮著重要作用。甲烷氧化菌是一種革蘭氏陰性菌，嚴格寡營養型。自1906年首次分離出 甲烷氧化菌以來，至今已經發現的甲烷氧化菌共有8個屬，主要包括甲基單胞菌屬 (Methylomonas)、甲基細菌屬(Methylobacter)、甲基球菌屬(Methylococcus)、甲基孢囊 菌屬(Methylocytis)、甲基彎曲菌屬(Methylosinus)、甲基微菌屬(Methylomicrobium) > Methylocaldum和Methylospera。根據代謝途徑、膜結構、主要磷脂脂肪酸成分等系列特 征，可將甲烷氧化菌分為I型、II型和X型三大類型。甲烷氧化菌對甲烷氧化途徑有兩條， 一條是通過由乙醛酸到絲氨酸的途徑，另一條是甲醛結合在磷酸核糖上生成6-磷酸阿洛 酮糖的途徑。這些菌可以利用任何一條途徑來進行同化，總反應式CH4 — CH3OH — HCHO — HCOOH — CO2甲烷氧化菌的特征酶是催化第一步反應的甲烷單加氧酶 (methanemonooxygenase,ΜΜ0)，MMO能斷裂非常穩定的C-H鍵，將分子氧中的一個氧原子插 入C-H中，另一個氧原子則生成水。它有兩種不同的類型顆粒狀或膜結合甲烷單加氧酶 (particulatemethane monooxygenase, pMMO)禾口可溶性甲燒單力口氧Bl (soluble methane monooxygenase, sMMO)。甲烷氧化菌研究速度過快導致了目前國內外研究報道中對該類細菌的稱謂存 在著不統一和歧義。以文獻報道為依據，對甲烷氧化菌進行全面介紹最早可追溯到1958 年，Leadbetter總結了自1906年首次發現甲烷氧化菌以來的研究成果，文章之所以提及 甲烷利用細菌而不是甲烷氧化菌，主要是因為當時研究條件以及研究深度和廣度的局限， 并不能給出這一類菌的共同特征。在伯杰細菌手冊第八版(1984)中，將這一類菌歸屬于 了甲基單胞菌科，并定義這一類菌僅利用單碳有機化合物作為碳源，屬于革蘭氏陰性菌。 1996年，Hanson對甲燒氧化菌的稱謂進行了統一，即Methane-oxidation bacteria和 Methane-utilizingbacteria 者β^Τ禾爾為 methanotrophs。在伯杰細菌手冊關于甲基單胞菌科的描述中發現了另一個重要的信息，“許多細 菌是能利用多碳化合物以及單碳化合物，而不是專依靠甲烷或甲醇作為碳源和能源”。與 傳統意義上只以甲烷為唯一碳源和能源的甲烷氧化菌相區別，此類細菌稱之為兼性營養 甲烷氧化菌(facultative methanotrophs)。經典生物學研究在培養基優化中很少關注 以甲烷為碳源，目前，已有一些文獻報道了非甲烷氧化菌可以消耗甲烷。Wolf早在1979年就發現了可以利用甲烷的酵母菌，目前有許多甲烷利用酵母被分離和純化，其中包括 Pichiapastoris, Hansensulapolymorpha, Candida spp.，and Trichsporon spp. 0兼性營養甲烷氧化菌可以利用其它碳源，因此更易實現擴大培養。生活垃圾在漫 長的降解過程中富含了豐富的微生物，前期研究表明礦化垃圾具有很好的降解甲烷能力， 從生活垃圾填埋場中提取兼性營養甲烷氧化菌有望在生活垃圾填埋場等人為源甲烷減排 的工程化方面取得新的突破，并為甲烷氧化在溫室氣體方面的工程應用提供新的平臺。
發明內容
本發明針對現有技術中甲烷生物甲烷無法工程化方面存在的不足，提供一種可利 用甲烷的金黃桿菌JT03及用途，所述金黃桿菌JT03可以利用淀粉等經濟型碳源快速生長， 在此基礎上實現高效地甲烷氧化，為甲烷生物氧化強化填埋場甲烷減排的工程化提供了非 常重要的生物基礎。。本發明的技術方案是可利用甲烷的金黃桿菌，其保藏號為CCTCC NO.M2010100，其16S rDNA序列如SEQ ID NO 1 所示。可利用甲烷的金黃桿菌的菌落直徑0. 8-1. 2mm,圓形凸起或扁平，黃色或白色或 桔黃色，透明有光澤；菌體桿狀或橢圓形，不運動，好氧、化能異養型細菌；細胞寬0. 4 0.6^111，長1.0 1.311111;革蘭氏染色陰性。本發明所述可利用甲烷的金黃桿菌可用于制備甲烷生物吸收劑、垃圾處理或制備 生物催化劑。本發明的菌株名為金黃桿菌(Chryseobacterium sp.) JT03 (保藏號為CCTCCNo. M2010100，保藏單位為中國典型培養物保藏中心-武漢大學保藏中心，保藏日期為2010年 4月25日)，從生活垃圾填埋場中分離得到的。該菌可高效利用甲烷，具有極高應用價值。 菌株DNA的測序委托大連寶生物公司完成，金黃桿菌JT03的16S rDNA部分堿基序列長度 為664bp(SEQ ID NO 1)，堿基序列在GenBank核酸序列數據庫進行比較發現與金黃桿菌屬 (Chryseobacterium sp.)的3個菌株的同源性在99%以上。通過對該菌株進行的一系列生 理生化以及工藝優化試驗表明，本發明提供的可利用甲烷的金黃桿菌(Chryseobacterium sp.)JT03CCTCC N0.M2010100，可有效解決人為源甲烷的減排，主要特點如下(1)金黃桿菌(Chryseobacterium sp.)JT03的發現克服了專一營養甲烷氧化菌 菌體密度低，菌體難于擴大培養等應用難題。(2)用金黃桿菌(Chryseobacterium sp. ) JT03的完整細胞作為生物催化劑，脫離 環境體系后仍可維持較高的甲烷氧化活性；適用于高濃度甲烷氧化，血清瓶中濃度為40% (ν/ν)的甲烷可完全降解。(3)該菌脫離環境體系后，在培養84h后可恢復活性，與已報道的甲烷氧化菌比 較，延遲時間縮短了約Mh。該菌脫離環境耐受性強，適合填埋后期寡養環境下的甲烷氧化， 該菌體的液體培養濃度高于以報道的多數甲烷氧化菌，對甲烷有較高的親和性。(4)金黃桿菌(Chryseobacterium sp. ) JT03的擴大培養所需的培養基簡單，成本 低。特別適用于生活垃圾填埋場、水稻田等甲烷人為源，可以廣泛推廣。本發明所述金黃桿菌(Chryseobacterium sp. ) JT03是從生活垃圾填埋場分離得到，在脫離垃圾填埋場環境后仍保持較高的甲烷氧化活性，可應用于生活垃圾填埋場、水稻 田等人為源甲烷的減排，在溫室氣體減排領域具有廣闊的應用前景；本發明所述金黃桿菌 (Chryseobacterium sp.) JT03也可在NMS培養基上培養，可利用多碳化合物為碳源快速增 殖，易于擴大化培養；所述金黃桿菌在利用多碳化合物增殖后仍具有高效降解甲烷的能力。下面結合附圖和實施例對本發明做進一步的說明，但本發明的實施方式不限于 此。
圖1金黃桿菌Chryseobacterium sp. JT03菌株的電鏡掃描照片；圖2金黃桿菌JT03切膠回收目的片段的DNA電泳，其中M =DL 2，OOODNAMarker ； 1 JT03PCR產物；+ 正對照；-負對照；圖3金黃桿菌Chryseobacterium sp. JT03菌株以甲烷為碳源的生長曲線；圖4不同碳源培養的Chryseobacterium sp. JT03菌株對甲烷降解效果圖；圖5是不同碳源培養的Chryseobacterium sp. JT03菌株代謝過程二氧化碳生產 效果圖。
具體實施例方式1.實驗材料NMS 培養基的組成如下(g/L) =KH2PO4L Og · Λ Na2HPO4 · 12Η20 2. 9g · Λ MgSO4 ·7Η20 0. 32g ·ΙΛ (NH4) 2S043. Og · Γ1，微量元素溶液 10mL，蒸餾水 990mL，pH 6. 8。微量 元素溶液組成如下(mg/L) =ZnSO4 ·7Η20 0. 287 ；MnSO4 ·7Η200· 223 ；H3BO3O. 062 ；Na2M0O4 ·2Η20 0. 048 ；COCl2 · 6Η20 0. 048 ；KI 0. 083 ；CaCl2 · 2Η20 3. 5。垃圾顆粒選自生活垃圾填埋場礦化垃圾，本實施例選取上海老港垃圾填埋場(上 海市南匯區老港東部)已填埋10年的垃圾，取4mm篩下和2mm篩上垃圾顆粒，先在甲烷和 空氣混合氣中密閉馴化2周菌株的復壯。2.菌種富集與優化實驗1)富集培養稱取礦化垃圾Ig放入100ml匪S培養基中，置于30°C、160rpm搖床 振蕩2h。取菌懸液2ml作為種子接入分裝了 20ml匪S培養基的100ml血清瓶中，加蓋橡膠 塞密封；用20ml甲烷氣置換瓶內20ml空氣，然后在30°C、160rpm條件下振蕩培養一周。2)純菌分離用已冷卻的無菌蒸餾水對菌液進行10倍系列稀釋，制成稀釋度為 10-1、10-2的稀釋液。采用傾注法進行匪S培養基培養。將平板倒置于真空干燥器中，并 向干燥器中通入一定量的甲烷，然后用保鮮膜封口。將干燥器置于生化培養箱中，30°C培養 4 5天。將長勢好的菌種進行多次傳代，純化。3)優化實驗利用純菌株制備一定濃度的菌懸液，加入到裝有一定量匪S培養基 的血清瓶中；用甲烷置換瓶內空氣，之后具塞密封。在30°C、160rpm條件下振蕩培養。間隔 一段時間檢測菌液濃度以及生物氣濃度。隨著甲烷的消耗，需定期補充一定體積的氮氣，以 消除瓶中負壓。3菌種鑒定實驗使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit (Code No. D310)進行PCR擴增目的片段。取5 μ 1進行3 %瓊脂糖凝膠電泳，使用TaKaRaAgarose GelDNAPurification Kit Ver. 2. O (Code No. DV805A)切膠回收目的片段進行DNA測序。DNA 的測序委托大連寶生物公司完成。Wkq Forward,Seq Reverse、Seqhternal為引物進行 DNA測序。4檢測方法菌液的OD值采用UV2000分光光度計檢測，波長為560nm。活細胞濃度采用平板 菌落計數法確定。菌體干重通過一定體積的菌液在80°C下烘干至恒重，用精密電子天平稱 量。每個實驗最少做2組平行試驗，確保RSD小于5%。甲烷的檢測采用氣相色譜(安捷倫6890N)。色譜條件⑶X不銹鋼柱(IOmX 2mm)， 進樣口溫度、柱溫以及檢測器(TCD)溫度分別為80、50、120°C，氫氣為載氣，流速為25ml/ min,進樣量 0. 5ml。實施例1.金黃桿菌Chryseobacterium sp. JT03的純化與鑒定該菌株屬革蘭氏陰性、菌落圓形凸起或扁平，黃色、白色或桔黃色，邊緣光滑，透明 有光澤，菌落直徑Imm左右；菌體桿狀或橢圓形、不運動，好氧、化能異養型細菌。細胞寬約 0. 4 0.6 μ m，長約1.0 1.3μπι。掃描電鏡照片見圖1。對菌株JT03的PCR產物進行3 %瓊脂糖凝膠電泳(圖2)，可以看到PCR產物的凝 膠條帶非常清晰。菌株DNA的測序委托大連寶生物公司完成，金黃桿菌JT03的16S rDNA 堿基測定的長度為664bp，堿基序列在GenBank核酸序列數據庫進行比較發現與金黃桿菌 屬(Chryseobacterium sp.)的3個菌株的同源性在99%以上。表 IChryseobacterium sp. JT03 的理化特性
權利要求
1.一種可利用甲烷的金黃桿菌，其特征在于，其保藏號為CCTCCNo. M2010100。
2.根據權利要求1所述的可利用甲烷的金黃桿菌，其特征在于，其16SrDNA序列如SEQ ID NO 1 所示。
3.根據權利要求1或2所述的可利用甲烷的金黃桿菌，其特征在于，菌落直徑 0. 8-1. 2mm,圓形凸起或扁平，黃色或白色或桔黃色，透明有光澤；菌體桿狀或橢圓形，不運 動，好氧、化能異養型細菌；細胞寬0.4 0.6μπι，長1.0 1.3μπι;革蘭氏染色陰性。
4.權利要求1所述的可利用甲烷的金黃桿菌在制備甲烷生物吸收劑中的應用。
5.權利要求1所述的可利用甲烷的金黃桿菌在垃圾處理中的應用。
6.權利要求1所述的可利用甲烷的金黃桿菌在制備生物催化劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種可以利用甲烷的金黃桿菌(Chryseobacterium sp.)JT03，該菌株保藏號為CCTCC No.M2010100。其可用于制備甲烷生物吸收劑、垃圾處理劑、生物催化劑。該金黃桿菌克服了甲烷氧化菌菌體密度低，菌體難于擴大培養等應用困難，對甲烷有較高的親和性。特別適用于生活垃圾填埋場、水稻田等甲烷人為源，可以廣泛推廣。
文檔編號C12R1/01GK102071161SQ20101026011
公開日2011年5月25日 申請日期2010年8月23日 優先權日2010年8月23日
發明者全學軍, 張麗杰, 趙天濤, 趙由才, 鄧郁平 申請人:重慶理工大學