專利名稱：一種煙草黑脛病菌的簡便分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用簡易的設(shè)備或條件高 效、快速分離煙草黑脛病菌的簡便分離方法。
背景技術(shù)：
煙草黑脛病(tobacco black shank)是世界煙草生產(chǎn)中危害最嚴重的病害之一， 特別是在溫帶、亞熱帶和熱帶發(fā)生較重，也是我國煙草的主要病害之一。煙草黑脛病病原 的分離方法通常是在發(fā)病田塊采集病株，在實驗室利用選擇性培養(yǎng)基平板分離病菌(鄭小 波，疫霉菌及其研究技術(shù)，北京，中國農(nóng)業(yè)出版社，1997，P84-85)。因此，這種病樣采集與病 菌分離往往存在3 7天或者更長的時間差，病樣在此期間極容易受到其它雜菌的污染，致 使一些病樣的病菌分離失敗。而且分離需要消毒、采用選擇性培養(yǎng)基，操作比較煩瑣。為 此，本發(fā)明人針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，根據(jù)典型病樣的特點，研制開發(fā)了一種適合于田間采集 病樣并即時分離病菌的簡便分離方法，實驗證明，應(yīng)用效果良好。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種工藝簡便，適合于田間作業(yè) 條件下簡易環(huán)境應(yīng)用的煙草黑脛病菌的簡便分離方法。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的利用簡易設(shè)備和簡陋的空間條件營造潔凈工作環(huán) 境，快速分離煙草黑脛病菌，具體包括以下步驟A、病株選擇與采集選擇田間癥狀典型，無其它癥狀，病莖無開裂或未被人為剖 開，即呈碟片狀的病髓片被密封包裹于健康莖桿中的病株作為目標病株；采集時去莖頂、葉 片和根，僅留取病莖，沖洗表面浮塵后晾干，每根病莖分別用滅菌的衛(wèi)生紙包裹分隔，置于 一次性使用的干凈封口袋內(nèi)；B、凈化工作環(huán)境選擇不通風(fēng)的室內(nèi)，用潔凈水噴霧沉降空氣中的塵埃，達到分離 所需的空氣環(huán)境要求；分離前，用點燃的酒精燈火焰滅菌形成無菌小環(huán)境；C、病菌分離從上部剖開病莖，兩手抓住病莖上端，扳開病莖至呈碟片狀的病髓片 露出；用火焰滅菌的彎頭鑷子夾取呈碟片狀的病髓片，置于火焰下的培養(yǎng)基平板內(nèi)，每個采 樣點用3 5個培養(yǎng)基平板，每個平板上放置病髓片3 5片；D、對分離的病菌進行室溫培養(yǎng)，根據(jù)菌落形態(tài)挑選目標病菌。E、病菌鑒定采用孢子灌根法或菌谷法接種感病品種紅花大金元進行病菌鑒定， 病情嚴重度大于1的菌株就有致病性。分離的病菌可采用水浸菌絲塊法于6 10°C恒溫條件下保存，通?？杀４? 2 年。分離病菌的致病性可用孢子灌根法[梁元存，劉延榮，王玉軍，王智發(fā)，張廣民。煙草黑 脛病菌致病性分化和煙草品種的抗病性差異，植物保護學(xué)報，2003，30(2) 143-147]或菌 谷法(GB/T 23224-2008煙草品種抗病性鑒定)進行驗證。本發(fā)明適用于田間采樣后的即時病菌分離，整個操作所用設(shè)備簡單，在不具備微
3生物實驗室的條件下也可開展分離工作，分離病菌的純度高，保持了病菌野生型的特性。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限定， 任何基于本發(fā)明技術(shù)思路的等同替換，均落入本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明利用簡易設(shè)備和簡陋的空間條件營造潔凈工作環(huán)境，快速分離煙草黑脛病 菌，具體包括以下步驟A、病株選擇與采集選擇田間癥狀典型，無其它癥狀，病莖無開裂或未被人為剖 開，即呈碟片狀的病髓片被密封包裹于健康莖桿中的病株作為目標病株；采集時去莖頂、葉 片和根，僅留取病莖，沖洗表面浮塵后晾干，每根病莖分別用滅菌的衛(wèi)生紙包裹分隔，置于 一次性使用的干凈封口袋內(nèi)；B、凈化工作環(huán)境選擇不通風(fēng)的室內(nèi)，用潔凈水噴霧沉降空氣中的塵埃，達到分離 所需的空氣環(huán)境要求；分離前，用點燃的酒精燈火焰滅菌形成無菌小環(huán)境；C、病菌分離從上部剖開病莖，兩手抓住病莖上端，扳開病莖至呈碟片狀的病髓片 露出；用火焰滅菌的彎頭鑷子夾取呈碟片狀的病髓片，置于火焰下的培養(yǎng)基平板內(nèi)，每個采 樣點用3 5個培養(yǎng)基平板，每個平板上放置病髓片3 5片；D、對分離的病菌進行室溫培養(yǎng)，根據(jù)菌落形態(tài)挑選目標病菌。E、病菌鑒定采用孢子灌根法或菌谷法接種感病品種紅花大金元進行病菌鑒定， 病情嚴重度大于1的菌株就有致病性。所述的病菌分離中病髓片放置所用培養(yǎng)基平板直徑為6 9cm，平板打開角度為 10° 15°，病髓片每片放置的時間為3 5s。所述的室溫培養(yǎng)是將培養(yǎng)基平板用封口膜封口，3 5個平板一起置于密封的培 養(yǎng)盒內(nèi)，室溫條件培養(yǎng)3 5天，然后根據(jù)菌落形態(tài)挑選目標病菌。所述的培養(yǎng)基為燕麥培養(yǎng)基或利馬豆培養(yǎng)基。所述的燕麥培養(yǎng)基的組成為燕麥片30g，瓊脂17 20g，蒸餾水1000ml。所述的利馬豆培養(yǎng)基的組成為利馬豆60g，瓊脂17 20g，蒸餾水IOOOml。實施例1選擇田間癥狀典型，無其它癥狀，病莖無開裂或未被人為剖開，即病髓片呈碟片狀 被密封、包裹于健康莖桿中的病株作為目標病株，采集時去莖頂、葉片和根，僅留取病莖，沖 洗表面去浮塵，晾干，每根病莖分別用滅菌的衛(wèi)生紙包裹分隔，置于一次性使用的干凈封口 袋內(nèi)。在潔凈的環(huán)境下進行病菌分離，首先從莖上部剖開病莖，兩手抓住病莖上端，扳開病 莖，至呈碟片狀的病髓片露出。然后用火焰滅菌的彎頭鑷子夾取病髓片，置于火焰下的燕麥 培養(yǎng)基平板內(nèi)；所用培養(yǎng)基平板直徑為6 9cm，平板打開角度為10° 15°，病髓片每片 放置的時間為3 5s ；每個采樣點用3 5個平板進行分離，每個平板放病髓片3 5片。 將平板用封口膜封口，3 5個平板一起置于密封的培養(yǎng)盒內(nèi)，室溫條件下培養(yǎng)3 5天，根 據(jù)純白色的菌落形態(tài)挑選目標病菌。分離病菌的致病性用孢子灌根法接種感病品種紅花大 金元進行驗證，病情嚴重度大于1(GB/T 23222-2008煙草病蟲害分級及調(diào)查方法)的菌株 就有致病性。實施例2
4
用利馬豆培養(yǎng)基平板代替燕麥培養(yǎng)基平板，其余同實施例1。實施例3按實施例1的方式選擇病莖、分離病髓片并進行室溫培養(yǎng)，根據(jù)純白色的菌落形 態(tài)挑選目標病菌。分離病菌的致病性用菌谷法接種感病品種紅花大金元進行驗證，病情嚴 重度大于1的菌株就有致病性。實施例4按實施例2的方式選擇病莖、分離病髓片并進行室溫培養(yǎng)，根據(jù)純白色的菌落形 態(tài)挑選目標病菌。分離病菌的致病性用菌谷法接種感病品種紅花大金元進行驗證，病情嚴 重度大于1的菌株就有致病性。發(fā)明的工作原理和特點本發(fā)明利用黑脛病菌從根莖部侵染、蔓延至莖髓部的特性，以健康組織包裹的內(nèi) 部病組織為分離材料，與國內(nèi)同類分離方法相比優(yōu)點表現(xiàn)在1、本發(fā)明提供的一種煙草黑脛病菌簡便分離方法更適用于田間采樣的及時分離， 整個操作所用設(shè)備簡單，在不具備微生物實驗室的條件下也可開展分離工作。2、本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基平板在嚴格的微生物實驗條件下制備，分離在相對簡陋 的潔凈環(huán)境中進行，有利于實驗室專業(yè)人員與基層技術(shù)人員的工作對接，即專業(yè)人員制備 平板、培訓(xùn)簡易分離技術(shù)，基層技術(shù)人員在基層可及時分離，專業(yè)人員就可直接收集病菌分 離物，有利于擴大病菌收集范圍。3、本發(fā)明采用的病組織為病莖的內(nèi)部組織，所以病菌類型單一，分離時不必進行 表面消毒、不采用選擇性培養(yǎng)基，保持了病菌野生型特性，可降低成本，節(jié)省時間。4、本發(fā)明從典型病樣的篩選、采集與存放，病菌分離時剖莖的器具沒有接觸到病 髓片、彎頭鑷子的使用(可減少平板開啟的角度)、平板的選擇以及開啟角度和時間的限 定，病菌密封培養(yǎng)等措施保證了分離病菌的純度。分離的效率可達90% 95%，比常規(guī)技 術(shù)效率(70% 80%)顯著提高，污染率明顯下降，減少污染2 4倍。
權(quán)利要求
一種煙草黑脛病菌的簡便分離方法，其特征在于利用簡易設(shè)備和簡陋的空間條件營造潔凈工作環(huán)境，快速分離煙草黑脛病菌，具體包括以下步驟A、病株選擇與采集選擇田間癥狀典型，無其它癥狀，病莖無開裂或未被人為剖開，即呈碟片狀的病髓片被密封包裹于健康莖桿中的病株作為目標病株；采集時去莖頂、葉片和根，僅留取病莖，沖洗表面浮塵后晾干，每根病莖分別用滅菌的衛(wèi)生紙包裹分隔，置于一次性使用的干凈封口袋內(nèi)；B、凈化工作環(huán)境選擇不通風(fēng)的室內(nèi)，用潔凈水噴霧沉降空氣中的塵埃，達到分離所需的空氣環(huán)境要求；分離前，用點燃的酒精燈火焰滅菌形成無菌小環(huán)境；C、病菌分離從上部剖開病莖，兩手抓住病莖上端，扳開病莖至呈碟片狀的病髓片露出；用火焰滅菌的彎頭鑷子夾取呈碟片狀的病髓片，置于火焰下的培養(yǎng)基平板內(nèi)，每個采樣點用3～5個培養(yǎng)基平板，每個平板上放置病髓片3～5片；D、對分離的病菌進行室溫培養(yǎng)，根據(jù)菌落形態(tài)挑選目標病菌。E、病菌鑒定采用孢子灌根法或菌谷法接種感病品種紅花大金元進行病菌鑒定，病情嚴重度大于1的菌株就有致病性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述煙草黑脛病菌的簡便分離方法，其特征在于所述的病菌分離中 病髓片放置所用培養(yǎng)基平板直徑為6 9cm，平板打開角度為10° 15°，病髓片每片放置 的時間為3 5s。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述煙草黑脛病菌的簡便分離方法，其特征在于所述的室溫培養(yǎng)是 將培養(yǎng)基平板用封口膜封口，3 5個平板一起置于密封的培養(yǎng)盒內(nèi)，室溫條件培養(yǎng)3 5 天，然后根據(jù)菌落形態(tài)挑選目標病菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述煙草黑脛病菌的簡便分離方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基 為燕麥培養(yǎng)基或利馬豆培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述煙草黑脛病菌的簡便分離方法，其特征在于所述的燕麥培養(yǎng)基 的組成為燕麥片30g，瓊脂17 20g，蒸餾水1000ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述煙草黑脛病菌的簡便分離方法，其特征在于所述的利馬豆培養(yǎng) 基的組成為利馬豆60g，瓊脂17 20g，蒸餾水1000ml。
全文摘要
本發(fā)明提供一種煙草黑脛病菌的簡便分離方法，利用簡易設(shè)備和簡陋的空間條件營造潔凈工作環(huán)境，快速分離煙草黑脛病菌，具體包括(1)病株選擇與采集；(2)凈化工作環(huán)境；(3)病菌分離；(4)病菌室溫培養(yǎng)等步驟。即在簡易條件下營造潔凈的工作環(huán)境，酒精燈火焰滅菌形成無菌小環(huán)境，剖開病莖，鑷取病莖內(nèi)碟片狀的病髓片，置于燕麥或利馬豆培養(yǎng)基平板；培養(yǎng)基平板用封口膜封口，3～5個平板置于密封的培養(yǎng)盒內(nèi)，室溫培養(yǎng)3～5天，根據(jù)菌落形態(tài)即可得到目標病菌。本發(fā)明適用于田間采樣后及時分離，整個操作所用設(shè)備簡單，在不具備微生物實驗室的條件下也可開展分離工作，分離病菌的純度高，保持了病菌野生型的特性。
文檔編號C12R1/645GK101914454SQ20101025123
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月12日
發(fā)明者余清, 宋春滿, 方敦煌, 晉艷, 秦西云, 莫笑晗 申請人:云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院